El anticuerpo SIRPα combinado con el virus oncolítico OH2 protege contra los tumores activando la inmunidad innata y reprogramando el microambiente inmune tumoral

BMC Medicine volumen 20, Número de artículo: 376 (2022) Citar este artículo

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La combinación de virus oncolíticos (OV) con bloqueos de puntos de control inmunitarios es un punto crítico de investigación y ha demostrado una buena eficacia. Aquí presentamos el primer intento de combinar el virus oncolítico del herpes simple 2 (OH2) con un anticuerpo anti-SIRPα como tratamiento antitumoral. Nuestros resultados brindan una visión única de la combinación de inmunidad innata con OV.

Verificamos la polarización y activación de OH2 en células RAW264.7 in vitro. Posteriormente, evaluamos la capacidad antitumoral de la terapia combinada de OH2 y anti-SIRPα en un modelo de ratón con tumor. Se usaron RNA-seq y Single-cell RNA-seq para caracterizar los cambios en el microambiente tumoral.

Los lisados ​​de OH2 estimularon eficazmente las células RAW264.7 para polarizarse hacia el fenotipo M1 pero no hacia el M2 y activaron la función del fenotipo M1 in vitro. En el experimento de eliminación de macrófagos, la terapia con OH2 indujo la polarización de los macrófagos M1 y participó en la respuesta inmunitaria antitumoral en un modelo de ratón portador de tumores. El tratamiento con una combinación de OH2 y anti-SIRPα inhibió eficazmente el crecimiento tumoral y prolongó significativamente el tiempo de supervivencia de los ratones, y este resultado fue más evidente en el modelo de ratón con un mayor volumen tumoral al inicio del tratamiento. Estos resultados sugieren que la terapia combinada puede remodelar más profundamente el TME y activar respuestas inmunitarias innatas y adaptativas más fuertes.

Nuestros datos respaldan la viabilidad de la terapia con virus oncolíticos en combinación con anticuerpos anti-SIRPα y sugieren una nueva estrategia para la terapia con virus oncolíticos.

Informes de revisión por pares

El uso de virus para la terapia del cáncer comenzó hace más de un siglo. Con el desarrollo de la ingeniería genética y los avances en la comprensión del mecanismo de acción de los virus, los virus oncolíticos (OV) pueden convertirse en una plataforma terapéutica ideal. Un número cada vez mayor de estudios ha demostrado que el efecto letal de los OV sobre las células tumorales no solo se produce a través de la actividad citolítica directa, sino que también implica un modo regulador complejo que combina múltiples mecanismos [1]. Estos mecanismos incluyen la regulación de los cambios en el micro y macroambiente del tumor, las respuestas inmunitarias específicas mediadas por las células T CD8+ y las respuestas inmunitarias celulares inmunitarias innatas [2,3,4]. A pesar de sus múltiples mecanismos de actividad terapéutica, muchos estudios preclínicos y clínicos han demostrado que la mayoría de los virus oncolíticos, armados o no, muestran una eficacia limitada como monoterapias [5, 6]. La capacidad de los virus oncolíticos para modificar el microambiente tumoral (TME) y alterar los tumores inmunológicamente "fríos" sugiere que una combinación de virus oncolíticos con otras terapias, como la inmunoterapia o la quimioterapia, puede lograr mejores resultados terapéuticos [7, 8].

En la actualidad, la combinación de OV y el bloqueo del punto de control inmunitario (ICB, por sus siglas en inglés) es un punto crítico de investigación y ha demostrado una buena eficacia en algunos ensayos clínicos [9]. Sin embargo, la combinación de VO e inmunoterapia se centra principalmente en la regulación de las células T, y existen pocos estudios sobre su efecto en la inmunidad innata. Los OV promueven la muerte celular inmunogénica (ICD) durante la lisis celular, reclutando y activando así células inmunitarias innatas como macrófagos y células dendríticas a través de la liberación de patrones moleculares asociados al daño (DAMP) y patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) y promoviendo aún más la activación de células T específicas de tumor en el TME [4, 10]. Por lo tanto, se espera que la activación de las células mieloides para activar la eliminación de tumores y mejorar la presentación de antígenos para activar la función inmune endógena proporcione conocimientos únicos para la terapia antitumoral.

Los macrófagos son una clase de células inmunes altamente plásticas con una variedad de funciones que generalmente se dividen en macrófagos M1 activados clásicamente y macrófagos M2 en función de su estado de polarización [11]. Los macrófagos M1 promueven la respuesta Th1 inflamatoria a través de la liberación de citocinas inflamatorias y mejoran aún más la respuesta de las células T a través de la regulación al alza de la presentación de antígenos y la expresión de moléculas coestimuladoras [11, 12]. Por lo tanto, los macrófagos M1 pueden estar involucrados en la inmunidad antitumoral en el microambiente tumoral. Los macrófagos M2 generalmente se asocian con la inhibición de la inmunidad antitumoral endógena. Reducir el número de macrófagos M2 y aumentar el número de macrófagos M1 son requisitos previos importantes para una terapia tumoral exitosa. Además, la función fagocítica de los macrófagos está regulada por el eje antifagocítico CD47-SIRPα [13]. CD47 inhibe la fagocitosis de los macrófagos a través de una alta expresión en las células tumorales [13, 14]. Los anticuerpos pueden bloquear la antifagocitosis del eje CD47-SIRPα, lo que aumenta la fagocitosis de los macrófagos. Un estudio reciente demostró que el bloqueo de SIRPα en los macrófagos puede activar eficazmente la capacidad antitumoral de los macrófagos [15].

En estudios previos [16, 17], encontramos que el tratamiento con el virus oncolítico del herpes simple 2 (OH2) puede alterar efectivamente el TME e inducir una respuesta inmune antitumoral en ratones. En este estudio, tratamos un modelo de tumor de ratón con una combinación de OH2 y un anticuerpo anti-SIRPα. Analizamos el efecto terapéutico y el estado de activación inmune de la terapia combinada. Nuestros resultados sugieren que la OH2 combinada con la activación de macrófagos es una terapia antitumoral prometedora.

Las líneas celulares CT26, MC38, 4T-1 y RAW264.7 se compraron en la Infraestructura Nacional de Recursos de Líneas Celulares (Beijing, China) y nuestro laboratorio las conservó. Las células se cultivaron en una incubadora a temperatura constante que contenía CO2 al 5 % a 37 °C.

OH2 fue proporcionado por Binhui Biopharmaceutical Co., Ltd. (Wuhan, China). El virus era un OH2 atenuado derivado de la cepa HG52 de HSV-2 de tipo salvaje con el gen ICP47 y el gen ICP34.5 borrados [18, 19].

Las líneas celulares CT26, MC38 y 4T-1 en la fase de crecimiento logarítmico se pasaron a placas de cultivo de 10 cm2 cuando las células alcanzaron una confluencia del 70-80 %, enjuagar las células con PBS y luego agregar 5 ml de medio RPMI-1640 sin suero. (HyClone, Waltham, MA) e infectar las células con OH2 según MOI=1, y añadir 5 ml de medio RPMI1640 que contiene FBS al 10 % (Gibco, Waltham, MA) después de 1 h. Después de 30 h, se recogió el sobrenadante celular, se centrifugó a 4 °C, 400 g durante 5 min, y el lisado se recogió y almacenó a -80 °C para su uso posterior. El sobrenadante libre de células (CFS) de CT26, 4T-1, MC38 y RAW264.7 sin tratar se usaron como control. El CFS de CT26, 4T-1 y MC38 se obtuvo del sobrenadante de cultivo de células en fase de crecimiento logarítmico, centrifugado a 4°C, 400g durante 5 min. El sobrenadante del lisado de células CT26, MC38 y 4T1 preparado mediante congelación y descongelación repetidas también se usó como grupo de control.

Las células RAW264.7 en fase de crecimiento logarítmico se extendieron en una placa de 96 pocillos a razón de 2000 células/pocillo y se cultivaron durante más de 6 h. Después de que las células se adhirieran, se agregó el lisado y se agregaron controles a las células, y se realizó la detección del Cell Counting Kit-8 (CCK8) en los puntos de tiempo correspondientes (0 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h) ( Dojindo, Kumamoto, Japón). Antes de la detección, se agregaron 100 μl de solución de trabajo de detección (reactivo CCK8: medio RPMI1640 = 1:10) a cada pocillo y se incubaron durante 1 h en una incubadora a 37 °C, CO2 al 5 % en la oscuridad. Finalmente, se utilizó un lector de microplacas (Bio-Rad, Japón) para detectar la absorbancia de las células a una longitud de onda de 450 nm.

Las células RAW264.7 en la fase de crecimiento logarítmico se extendieron a una placa de 6 pocillos a razón de 106 células/pocillo. Después de al menos 6 h, las células se adhirieron completamente a la pared y el lisado y el control se agregaron por separado. Después de 24 h de tratamiento, las células RAW264.7 se tiñeron con FITC anti-ratón F4/80 (clon: FJK-16s, Invitrogen, Waltham, Massachusetts), APC anti-ratón CD86 (clon: GL-1, Biolegend, San Diego , CA) y PE anti-ratón CD206 (clon: MR6F3, Invitrogen, Waltham, Massachusetts) según protocolo de los anticuerpos (M1 macrófago: F4/80+CD86+, M2 macrófago: F4/80+CD206+) y sometidos a flujo citometría (LSR II, BD). La detección de SIRPα en macrófagos en bazo de ratón utilizó FITC anti-ratón F4/80, APC anti-ratón CD11b (clon: M1/70, Biolegend, San Diego, CA) y PE anti-ratón SIRPα (clon: P84, Biolegend , San Diego, CA). Toda la citometría de flujo utilizada para detectar la tipificación de macrófagos en este estudio se configuró con un grupo de control de isotipo de anticuerpo (PE Rat IgG2a, clon: RTK2758, Biolegend, EE. UU.; APC Rat IgG2a, clon: RTK2758, Biolegend, EE. UU.; FITC Rat IgG2a, clon : RTK2758, Biolegend, EE. UU.).

Las líneas celulares CT26, MC38 y 4T-1 en fase de crecimiento logarítmico fueron digeridas y resuspendidas a una concentración de 1x106/mL. Se añadió un μL de solución de trabajo de CFSE (C34554, Life Technology, Waltham, MA) (0,5 mM) a cada 2 ml de células tumorales con una concentración de 1 × 106/mL y se incubó a 37 °C (5 % CO2) durante 8 mín. Después de la incubación, se añadieron 10 ml de medio RPMI 1640 preenfriado que contenía FBS al 10 % para detener la tinción. El sobrenadante se descartó por centrifugación y la concentración celular se ajustó a 5x105/mL con medio RPMI 1640 con FBS al 10%. La concentración de raw264.7 tratado con lisado y control se ajustó a 5x106/mL. Con una proporción de 25:1, 50:1 y 100:1 como efector a muestras paralelas de proporción objetivo, el cocultivo se llevó a cabo en una placa de pocillos en forma de U de 96 pocillos, 100 μL de células crudas 264.7 y 100 μL Se añadieron células tumorales a cada pocillo y se prepararon 3 muestras paralelas. Luego se colocó la placa de cultivo a 37°C (5% CO2) por 4 h. Antes de la prueba, se agregaron 200 μL de solución de trabajo de PI (P8080, Solarbio, Beijing, China) (2,5 μg/mL) a cada pocillo de cultivo.

Las líneas celulares CT26, MC38 y 4T-1 y los macrófagos en el bazo de los ratones se tiñeron con APC anti-ratón CD47 (clon: miap301, Biolegend, San Diego, CA), anti-ratón SIRPα purificado (clon: P84, Biolegend , San Diego, CA) y anticuerpos anti-ratón IgG-Alexa 488 (ab150113, Abcam, Cambridge, Reino Unido) según el protocolo de los anticuerpos. Los niveles de expresión de CD47 y SIRPα se detectaron mediante citometría de flujo.

Las secciones de tejido incrustadas en parafina se hornearon a 60-65 °C durante más de 6 horas y luego se colocaron en xileno para desparafinarlas mientras estaban calientes. Los pasos fueron seguidos por gradiente de hidratación con etanol, antígeno de reparación de citrato (ZLI 9064, Zsjqbio, Beijing, China), peróxido de hidrógeno al 3% que bloquea la actividad de la peroxidasa endógena, bloqueo (SP-KIT-B2, MXB, Fujian, China), anticuerpo primario F480 ( clon: SP115, dilución: 1:200, Abcam, Cambridge, Reino Unido), CD86 (clon: E5 W6H, dilución: 1:500, CST, Danvers, Massachusetts), CD206 (policlonal, dilución: 1:100, Abcam, Cambridge , Reino Unido), CD8 (policlonal, dilución: 1:200, Affinity Biosciences, Jiangsu, China), CD16 (policlonal, dilución: 1:200, Affinity Biosciences, Jiangsu, China) y anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) ( Kit-5010, MXB, Fujian, China), visualizada con el cromógeno 3,30-diaminobencidina DAB (DAB-1031, MXB, Fujian, China), tinción con hematoxilina (Solarbio, Beijing, China), diferenciación de etanol con ácido clorhídrico y agua de amoníaco volviendo a azul. Finalmente, después de la deshidratación con etanol en gradiente, las secciones de tejido se deshidrataron en xileno y se sellaron con goma neutra. Después del secado, se observaron las secciones de tejido para la tinción bajo un microscopio (Nikon Eclip se 80i, Japón).

Las secciones de tejido incrustadas en parafina se hornearon a 60°C-65°C durante más de 6 horas y luego se colocaron en xileno para desparafinarlas mientras estaban calientes. Después de la hidratación con gradiente de etanol y la inmersión en formalina neutra, cada anticuerpo teñido se reparó secuencialmente con citrato, se bloqueó con suero de cabra y se incubó con anticuerpos primarios contra F480 (clon: SP115, dilución: 1:500, Abcam, Cambridge, Reino Unido), CD86 ( clon: E5 W6H, dilución: 1:1000, CST, Danvers, Massachusetts), CD206 (policlonal, dilución: 1:200, Abcam, Cambridge, Reino Unido), CD8 (policlonal, dilución: 1:500, Affinity Biosciences, Jiangsu, China), CD16 (policlonal, dilución: 1:500, Affinity Biosciences, Jiangsu, China) y anticuerpo secundario, y teñido con fluorescencia para amplificar la señal. Una vez completada la tinción, se añadió gota a gota la solución de trabajo de DAPI y, por último, se añadió a la montura la tableta de montaje súper anti-apagado según lo requerido por las instrucciones del kit (TSA-RM, PANOVUE, Beijing, China). Los cortes de tejido teñidos se escanearon y analizaron con el software Plaris e Inform.

Las imágenes IHC se escanearon utilizando el software CaseViewer2.4. Se calificó el grado de tinción: las células con tinción <10 % se calificaron como tinción negativa (-, 1), las células con tinción del 10 al 49 % se calificaron como (+, 2); las células con una tasa de tinción del 50 al 74 % se calificaron como (++, 3), las células teñidas del 75 al 100 % se denotaron como (+++, 4). Las puntuaciones del rango positivo de tinción son las siguientes: incoloro (0); partículas de color amarillo pálido (1), partículas de color tostado (2) y partículas marrones (3). La puntuación final se definió como la puntuación de la extensión de la tinción multiplicada por la puntuación del rango de tinción positiva [20]. Las puntuaciones de expresión negativa oscilaron entre 0 y 5, con puntuaciones de expresión positiva superiores a 5 [21].

Los ratones se adquirieron de Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.). Ratones hembra Balb/c de seis a ocho semanas de edad que pesaban aproximadamente 19–20 g se mantuvieron en una rejilla ultralimpia de flujo laminar en nuestra sala de animales en condiciones asépticas específicas durante aproximadamente 1 semana. Cada ratón se inoculó por vía subcutánea (sc) con 3 x 105 células CT26 en el lado derecho del área dorsal. El tumor apareció en aproximadamente 5 a 7 días y el tratamiento se administró cuando el diámetro del tumor creció a 3 a 5 mm u 8 a 10 mm.

Todas las operaciones se llevaron a cabo bajo los procedimientos operativos estándar del sistema de manejo de cría experimental de ratones libre de patógenos específicos (SPF) especificado por el estado. Todos los procedimientos experimentales relacionados con animales fueron aprobados por el Comité de Ética de Experimentos con Animales del Centro Nacional del Cáncer/Hospital del Cáncer, la Academia China de Ciencias Médicas (CAMS) y el Colegio Médico de la Unión de Pekín.

Se construyó un modelo de tumor de trasplante subcutáneo de células CT26. Cuando el diámetro del tumor alcanzó los 3-5 mm (día 7), los ratones del modelo CL se separaron en tres grupos (OH2 [OH2 + liposomas de control], OH2 + CL y grupo de control con PBS) con una distribución uniforme de volúmenes tumorales. Asignó más de 10 ratones a cada grupo. Se realizó OH2 (2x106 unidades formadoras de placas [PFU]) mediante inyección intratumoral (it) el día 0, el día 2 y el día 4 en un volumen de 100 μl. Se administraron cien microlitros de CL (7 mg/mL, F70101C-NC, FormuMax, Sunnyvale, CA) o liposomas de control (7 mg/mL, F70101-N, FormuMax, Sunnyvale, CA) por ratón mediante inyección intraperitoneal (ip) el día antes del tratamiento con OH2. El grupo de control de PBS recibió 100 μL de PBS por ratón. El crecimiento tumoral se observó y registró regularmente para cada grupo de ratones. Después de 14 días de tratamiento, los tejidos tumorales se resecaron para tinción inmunohistoquímica e inmunohistoquímica multicolor. Los ratones del grupo de observación de supervivencia volvían a tener tumores el día 40.

Se construyó un modelo de tumor de trasplante subcutáneo de células CT26. Cuando el diámetro del tumor alcanzó los 3-5 mm (día 7), se definió como que el tumor era más pequeño en el momento del tratamiento inicial. Los ratones en el modelo anti-SIRPα con tumores más pequeños en el tratamiento inicial se separaron en seis grupos (grupo de anticuerpos anti-SIRPα OH2 +, grupo de isotipo OH2+, grupo OH2, grupo de anticuerpos anti-SIRPα, grupo de isotipo y grupo de control PBS) con una distribución uniforme de los volúmenes tumorales. Asignó más de 10 ratones a cada grupo. El tratamiento con OH2 o PBS se inyectó los días 0, 2 y 4 y se administró el anticuerpo anti-SIRPα (clon: P84, Bioxcell, Lebanon, New Hampshire) o isotipo (TNP6A7, Bioxcell, Lebanon, New Hampshire). los días 1 y 3. El anticuerpo anti-SIRPα y el isotipo se inyectaron por vía intraperitoneal (ip) con 100 μg, se diluyeron a 1 mg/ml con PBS sin solución de conservación y se inyectaron 100 μL por vía intraperitoneal para cada ratón. El grupo de control de PBS recibió 100 μL de PBS por ratón. El método de administración y la dosificación de OH2 fueron los mismos que en el modelo CL. El crecimiento tumoral de los ratones se observó y registró regularmente cada dos días.

Cuando el diámetro del tumor alcanzó los 8-10 mm (día 14), se definió como que el tumor era más grande en el momento del tratamiento inicial. Los ratones en el modelo anti-SIRPα con tumores más grandes en el tratamiento inicial se separaron en cuatro grupos (grupo de anticuerpos anti-SIRPα OH2+, grupo de isotipo OH2+, grupo OH2, grupo de anticuerpos anti-SIRPα y grupo de control PBS) con una distribución uniforme de volúmenes tumorales. Asignó más de 10 ratones a cada grupo. El modo de administración y estrategia de tratamiento fue el mismo que el descrito anteriormente. Se observó y registró regularmente el crecimiento tumoral de los ratones. Después de 12 días de tratamiento, los tejidos tumorales se resecaron para inmunohistoquímica, tinción inmunohistoquímica multicolor y secuenciación de ARN.

Cuando se alcanzó el punto final experimental o el punto final humanitario, como cuando el tamaño del ratón alcanzó los 2500 mm3 o la metástasis del tumor o el crecimiento rápido causaron ulceración, necrosis o infección que interfirió con la alimentación o el caminar, los ratones fueron anestesiados con hidrato de cloral al 5 %. y luego sacrificado por dislocación cervical. La fórmula de cálculo del volumen del tumor fue volumen = (largo × ancho2)/2.

La secuenciación del transcriptoma involucrada en este estudio fue realizada y completada por Tianjin Nuohe Zhiyuan Bioinformation Technology Co., Ltd. Se requirieron muestras de ARN para alcanzar un volumen total de ≥30 μL, un volumen total de ≥1.5 μg y una concentración de ≥50 ng/μL. Se utilizaron el método de cuantificación por electroforesis en gel de agarosa, Nanodrop y Agilent 2100 para probar la concentración, la pureza y la integridad del ARN enviado. El tipo de construcción de la biblioteca fue una biblioteca específica de cadena eucariótica. La estrategia de secuenciación fue Illumina Hiseq-PE150 (secuenciación bidireccional).

Los tejidos tumorales del grupo de control, el grupo OH2 y el grupo de tratamiento combinado se sometieron a análisis de secuenciación de células individuales, y la tecnología de secuenciación de células individuales utilizada en este estudio fue proporcionada por Huada Company. El tejido se disoció utilizando el kit de disociación de tumores (ratón, MACS), se eliminaron las células muertas y se dejó la suspensión de células vivas para la secuenciación. Los datos obtenidos se analizaron con el paquete Seurat y el gráfico del volcán se dibujó con el paquete de software R EnhancedVolcano. Los paquetes R utilizados para el análisis GO y el análisis KEGG incluyeron tidyverse, patchwork, monocle, clusterProfiler, org.Mm.eg.db.

Se usó el software R versión 4.0.2 para analizar los datos de secuenciación del transcriptoma, y ​​el paquete de software R "edgeR" se usó para el análisis de expresión diferencial entre grupos. Se usó el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) para estudiar las diferentes vías de señal entre diferentes grupos. El paquete de software R "clusterProfiler" se utilizó para el análisis de Gene Ontology (GO) y Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Se usó el análisis de variación del conjunto de genes (GSVA) ​​para el análisis de infiltración de células inmunitarias. Se usó la prueba t de Student para comparar los genes expresados ​​diferencialmente, y el valor P se ajustó y corrigió mediante el método de Benjamini-Hochberg. El cambio log2-fold fue superior a 1, y el valor P corregido fue inferior a 0,01 como umbral para juzgar la importancia de la diferencia. Se utilizó un total de 770 genes de ratón relacionados con la inmunología creados a partir del panel de perfilado inmunológico de cáncer de ratón nCounter (NanoString) como genes de referencia que se enumeran en el archivo adicional 1: tabla S1 y el archivo adicional 2: tabla S2.

Se utilizó el software GraphPad Prism versión 8 para el análisis estadístico y las diferencias estadísticamente significativas se definieron como un valor de p<0,05. Se usó la prueba t de Student no pareada de dos colas para comparar dos grupos. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) de dos vías en los datos experimentales para los volúmenes tumorales para más de dos grupos. Se utilizaron el método de Kaplan-Meier y la prueba de rangos logarítmicos para los datos de la curva de supervivencia; el período de supervivencia se definió como el tiempo desde el inicio del tratamiento hasta el final de la observación. Los resultados se presentan como la media ± SEM. En este estudio, todos los experimentos se repitieron al menos tres veces, excepto las partes que se indique lo contrario.

Confirmamos el papel de los macrófagos en el proceso de tratamiento con OH2 del cáncer de colon, como se muestra en la Fig. 1A. Como se muestra en la Fig. 1B, las células RAW264.7 tratadas con los lisados ​​mejoraron significativamente la viabilidad y la capacidad de proliferación mediante el ensayo CCK8 (p<0,0001 para las células CT26 y MC38, p=0,001 y p<0,0001 en comparación con el sobrenadante sin células). (CFS) y células RAW264.7 y 4T-1 no tratadas, respectivamente). Los lisados ​​estimularon la activación de macrófagos. También incubamos OH2 en diferentes MOI (MOI = 1, MOI = 0.5) con células RAW264.7 para determinar si OH podría activar directamente los macrófagos a través de CCK8. Como era de esperar, la adición de OH2 (Archivo adicional 3: Fig. S1) o lisado celular congelado (Archivo adicional 3: Fig. S2) no pudo activar los macrófagos directamente dentro de las 24 h.

Los lisados ​​de OH2 inducen la polarización y la fagocitosis de RAW264.7 in vitro. Un esquema de preparación de lisado y diagrama de flujo del experimento realizado en el estudio. Resultados del ensayo de proliferación de células B de líneas celulares CT26 (izquierda), MC38 (centro) y 4T-1 (derecha) tratadas con lisado (rojo), CFS (azul) y grupo no tratado (negro) mediante ensayo CCK8 en 24 h. C Resultados del análisis de citometría de flujo de una muestra representativa de cada línea celular con tratamiento de lisado o CFS. D El porcentaje del subtipo M1 (F4/80+CD86+) en los grupos de lisado, CFS y sin tratar de células CT26, MC38 y 4T-1 detectadas por citometría de flujo. Los datos son promedios de tres muestras por grupo de tratamiento. Se usó una prueba t de Student no pareada para analizar la significación de la diferencia entre los dos grupos y se usó ANOVA para analizar la significancia de la diferencia entre los grupos (>2). E La proporción del subtipo M2 (F4/80+CD206+) en los grupos de lisado, CFS y no tratados de células CT26, MC38 y 4T-1 detectadas por citometría de flujo. Los datos son promedios de tres muestras por grupo de tratamiento. Se usó una prueba t de Student para datos no apareados para analizar la significación de la diferencia entre los grupos. F. Las funciones fagocítica y letal de los macrófagos tratados con diferentes lisados ​​de células cancerosas detectadas por CFSE/PI. Se establecieron tres proporciones de efectores a objetivo para cada línea celular (RAW264.7: células tumorales = 25: 1, 50: 1 y 100: 1). Los datos son promedios de tres muestras por grupo de tratamiento. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA con comparaciones múltiples. ns, sin diferencias significativas, *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,001, ****, p<0,0001

Posteriormente, utilizamos citometría de flujo para detectar la proporción de macrófagos M1 (F4/80+CD86+) y M2 (F4/80+CD206+) después del tratamiento con lisado (Fig. 1C). La proporción de macrófagos M1 después del tratamiento con lisado y CFS aumentó significativamente (p=0,0015, p<0,0001 y p<0,0001 para el tratamiento con lisado CT26, MC38 y 4T-1, respectivamente, y p=0,01, p=0,0073 y p= 0,023 para el tratamiento con CT26, MC38 y 4T-1 CFS, respectivamente) en comparación con el grupo no tratado (Fig. 1D). También hubo diferencias significativas entre los lisados ​​y el tratamiento con CFS (p=0,01, p=0,0018 y p<0,0001 para el tratamiento con lisados ​​CT26, MC38 y 4T-1, respectivamente). Curiosamente, no hubo diferencia en la proporción de macrófagos M2 entre los grupos lisados ​​y no tratados, pero la proporción de macrófagos M2 en el CFS aumentó significativamente en comparación con la de los otros dos grupos (Fig. 1E, archivo adicional 3: Fig. S3 ). La proporción de macrófagos M1 (F4/80+CD86+) y M2 (F4/80+CD206+) en células RAW264.7 tratadas con lisado en el grupo SIRPα bloqueado y el grupo SIRPα no bloqueado no fue significativamente diferente (p = 0,010, Archivo adicional 3: figura S4). La diferencia en la polarización RAW264.7 inducida por lisado celular congelado y CFS no fue estadísticamente significativa (Archivo adicional 3: Fig. S5). También se observaron resultados similares en macrófagos primarios esplénicos de ratón. CFS no cambió significativamente la proporción de M1 o M2, mientras que la proporción de M1 y M2 en macrófagos primarios aumentó significativamente después del tratamiento con lisado (p<0,0001). Aunque el lisado celular congelado también aumentó la proporción de M1, se reflejó más en la proporción de M2 ​​(Archivo adicional 3: Fig. S6). Estos resultados indicaron que los lisados ​​estimularon eficazmente a los macrófagos para polarizarse hacia el fenotipo M1 pero no hacia el M2. Para descubrir la relación entre la polarización de los macrófagos y la fagocitosis, se realizó un ensayo de destrucción celular. No hubo diferencias significativas entre los grupos con SFC y sin tratamiento. Los macrófagos M1 polarizados con lisado tuvieron un efecto letal significativo en comparación con los otros dos grupos, y el efecto se mejoró con un aumento en la proporción de células efectoras:células diana (E:T) (Fig. 1F).

Para explorar los cambios en los macrófagos con polarización, se realizó la secuenciación de ARN en diferentes grupos de tratamiento RAW264.7. Ya sea que los lisados ​​de CT26 se compararan con sobrenadantes o células RAW264.7 no tratadas, el análisis GO mostró que los lisados ​​activaron la actividad de las vías de señalización antiviral en las células RAW264.7, incluida la respuesta al virus, la regulación del proceso viral, la regulación de la respuesta inmunitaria innata y respuesta al interferón-beta (fig. 2A y B). El análisis KEGG mostró los mismos cambios de señalización que el tratamiento con lisado (Fig. 2C y D). Además, GSEA mostró que las vías relacionadas con el interferón estaban reguladas al alza y las vías de señalización relacionadas con la proliferación celular estaban reguladas a la baja después del tratamiento con lisado (Fig. 2E). En comparación con el grupo sobrenadante, la expresión de los marcadores M1 (Il23a, Il6, Nfkb1, Cd80, Il27, Ccl5, Cd86, Il21r, Il33, Ccl6, Cxcl10, Il7, Cxcl11, Il18, Ccl7, Tlr4 y Ccl2) en el lisado el grupo de tratamiento se reguló al alza y la expresión de los marcadores M2 (Stat3, Mr1 y Ncan) se reguló a la baja (Fig. 2F y G). Estos resultados sugirieron que el tratamiento con lisado podría inducir eficazmente la polarización de los macrófagos M1, activar la función de los macrófagos M1 y activar las respuestas inmunitarias antivirales y antitumorales.

La secuenciación de ARN de los grupos tratados con lisado, tratados con CFS y sin tratar caracterizó la función Raw264.7. Un análisis GO de genes expresados ​​diferencialmente de células RAW264.7 tratadas con lisado y CFS. Análisis B GO de genes expresados ​​diferencialmente de células RAW264.7 tratadas con lisado y células RAW264.7 no tratadas. C Análisis KEGG de genes expresados ​​diferencialmente de células RAW264.7 tratadas con lisado y CFS. D Análisis KEGG de genes expresados ​​diferencialmente de células RAW264.7 tratadas con lisado y células RAW264.7 no tratadas. E GSEA de genes expresados ​​diferencialmente de células RAW264.7 tratadas con lisado y CFS. F La expresión de marcadores de macrófagos M1 en células RAW264.7 tratadas con lisado y CFS. G La expresión de marcadores de macrófagos M2 en células RAW264.7 tratadas con lisado y CFS. El color representa el valor del nivel de expresión del gen en la secuenciación de ARN

Exploramos la correlación entre el tratamiento con OH2 y la función de los macrófagos in vivo, como se muestra en la Fig. 3A. Con base en investigaciones previas [16], demostramos que la terapia con OH2 promovió la infiltración de células inmunitarias adaptativas (células T) y células inmunitarias innatas (macrófagos, DC y células NK) (Fig. 3B).

Tratamiento con OH2 de macrófagos polarizados al fenotipo M1 para la eliminación de tumores in vivo. A El proceso de tratamiento y la línea de tiempo del experimento del modelo animal CL. B Los resultados del análisis de infiltración de células inmunitarias del grupo de tratamiento con OH2 y del grupo de control por GSVA. C La curva de crecimiento tumoral del grupo CL combinado con OH2 (rojo), el grupo OH2 (OH2 con liposomas de control) (azul) y el grupo de control (negro). El cuadro rojo se amplió (a la derecha) para mostrar el grupo CL combinado de OH2 y el grupo OH2. Se realizó un análisis de varianza de dos vías (ANOVA) en los datos experimentales. n=10 ratones/grupo, ****, P<0,0001. D La curva de supervivencia del grupo CL combinado con OH2 (rojo), el grupo OH2 (azul) y el grupo de control (negro). Se utilizaron el método de Kaplan-Meier y la prueba de rangos logarítmicos para los datos de la curva de supervivencia. ns, sin diferencias significativas. E Resultados M-IHC representativos del grupo OH2 (izquierda) y el grupo CL combinado con OH2 (derecha). F4/80, verde, CD86, violeta y CD206, amarillo. Barra de escala, 100 μm. Resultados de la cuantificación F M-IHC para el subtipo M1. n=3 muestras/grupo. Se utilizó la prueba de la t de Student para analizar la significación de la diferencia entre los dos grupos. ***, p<0,001. Resultados de la cuantificación G M-IHC para el subtipo M2. n=3 muestras/grupo. Se utilizó la prueba de la t de Student para analizar la significación de la diferencia entre los dos grupos. **, p<0,01. H Tinción IHC representativa para CD86 (izquierda), CD206 (centro) y F4/80 (derecha) en el grupo CL combinado de OH2 (arriba) y OH2 (abajo). Ampliación original, ×200. n=5 muestras/grupo. (Porcentaje representado la proporción de macrófagos M1/M2 en el número total de células). I. Resultados cuantitativos de la tinción de CD86 en el grupo CL y OH2 combinado con OH2. J Resultados cuantitativos de la tinción de CD206 en el grupo CL y OH2 combinado con OH2. K Resultados cuantitativos de la tinción F4/80 en el grupo CL y OH2 combinado con OH2. n=3 muestras/grupo. Se utilizó la prueba de la t de Student para analizar la significación de la diferencia entre los dos grupos. ns, sin diferencias significativas, *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,001, ****, p<0,0001

Los macrófagos en ratones portadores de CT26 se eliminaron utilizando liposomas de clodronato (CL) un día antes del tratamiento. Primero, verificamos la eficiencia de eliminación y descubrimos que alcanzó más del 90 % dentro de las 24 h posteriores a la inyección y luego se recuperó y fue más alta que el nivel previo a la inyección 72 h después (Archivo adicional 3: Fig. S7). Estos resultados sugieren que el uso de CL solo puede eliminar eficazmente cualquier macrófago existente sin afectar la formación de nuevos macrófagos.

Como se muestra en la Fig. 3C, tanto la terapia con OH2 como CL combinada con la terapia con OH2 mostraron una fuerte inhibición tumoral. De hecho, la terapia de combinación mostró una supresión tumoral más temprana y un efecto terapéutico más significativo (p<0,0001) (Fig. 3C). Sin embargo, no hubo diferencia en la supervivencia entre los dos grupos, y todos los tumores en los grupos combinados y OH2 finalmente retrocedieron (Fig. 3D). El experimento de reexposición mostró que la tasa de formación de tumores del grupo combinado fue significativamente menor que la del grupo OV (p = 0,029), aunque los tumores finalmente regresaron (Archivo adicional 3: Fig. S8). Esto implica que los macrófagos podrían desempeñar un papel en el efecto del tratamiento de OH2.

El análisis cuantitativo por inmunohistoquímica multicolor (M-IHC) mostró que el uso combinado de CL y OH2 promovió un aumento de macrófagos M1 (p=0,0004) en el microambiente inmune del tumor, acompañado de una disminución de macrófagos M2 (p=0,0011) en comparación con OH2 solo (Fig. 3E–G, Archivo adicional 3: Fig. S9). Los resultados de la inmunohistoquímica mostraron que el marcador de macrófagos M1 se expresó en gran medida en los tejidos tumorales, y el marcador de macrófagos M2 solo se expresó en niveles bajos en el grupo de terapia combinada (Fig. 3H-K). Estos resultados sugirieron que la terapia con OH2 puede inducir la polarización de los macrófagos M1 y participar en la respuesta inmunitaria antitumoral in vivo.

Para explorar más a fondo la viabilidad de la OH2 combinada con la terapia con macrófagos, se utilizó un anticuerpo anti-SIRPα que bloquea el eje CD47-SIRPα en los macrófagos. Primero, detectamos la expresión de CD47 y SIRPα en líneas celulares. Como se muestra en la Fig. 4A, CD47 se expresó ampliamente en la mayoría de las líneas celulares, mientras que la expresión de SIRPα fue específica de la línea celular. El nivel de expresión de SIRPα en macrófagos en el bazo de ratones se mostró en el archivo adicional 3: Fig. S10. Estos resultados sugirieron que podríamos eliminar el efecto de bloqueo de CD47 sobre la fagocitosis de macrófagos con un anticuerpo anti-SIRPα.

La combinación de OH2 y terapia anti-SIRPα mejora las respuestas inmunitarias contra el cáncer in vivo. A Los niveles de expresión de CD47 y SIRPα en las líneas celulares CT26, MC38 y 4T-1 se detectaron mediante citometría de flujo. B El proceso de tratamiento y el cronograma experimental para el tratamiento combinado ajustado. C La curva de crecimiento tumoral de diferentes grupos de tratamiento de ratones portadores de tumores con volúmenes tumorales más grandes en el tratamiento inicial. El cuadro rojo se amplió para mostrar el grupo de anticuerpos anti-SIRPα combinados con OH2, el isotipo combinado con OH2 y el grupo OH2. Se realizó un análisis de varianza de dos vías (ANOVA) en los datos experimentales. n=10 ratones/grupo. *, p=0,019. D La curva de supervivencia de diferentes grupos de tratamiento de ratones portadores de tumores con volúmenes tumorales más grandes en el tratamiento inicial. Se utilizaron el método de Kaplan-Meier y la prueba de rangos logarítmicos para los datos de la curva de supervivencia. *, p=0,041. E La curva de crecimiento tumoral del grupo de anticuerpos anti-SIRPα combinados con OH2, el grupo de anticuerpos anti-SIRPα, el grupo OH2 y el grupo de control. Se realizó un análisis de varianza de dos vías (ANOVA) en los datos experimentales. n=6 ratones/grupo. *; **. F La curva de supervivencia del grupo de anticuerpos anti-SIRPα combinados con OH2, el grupo de anticuerpos anti-SIRPα, el grupo OH2 y el grupo de control. Se utilizaron el método de Kaplan-Meier y la prueba de rangos logarítmicos para los datos de la curva de supervivencia. *, p=0,0183. G El proceso de tratamiento y el cronograma experimental para el tratamiento combinado. H La curva de crecimiento tumoral del grupo de anticuerpos anti-SIRPα combinados con OH2, el isotipo combinado con OH2 y el grupo de control. Se realizó un análisis de varianza de dos vías (ANOVA) en los datos experimentales. n=7 ratones/grupo. *, p=0,029; **, P=0,0041; ***, p=0,0003. I La curva de supervivencia del grupo de anticuerpos anti-SIRPα combinados con OH2, el isotipo combinado con OH2 y el grupo de control. Se utilizaron el método de Kaplan-Meier y la prueba de rangos logarítmicos para los datos de la curva de supervivencia. *, p=0,03 yp=0,018; **, P=0,0014

Se realizó una prueba in vivo. Cuando el volumen del tumor CT26 era pequeño al comienzo del tratamiento (45,315±4,403 mm3), el volumen del tumor y la supervivencia no fueron significativamente diferentes entre el grupo de tratamiento combinado y el grupo de tratamiento con OH2 (p = 0,4712) (Archivo adicional 3: Fig. S11). Ya sea como tratamiento único o combinado, OH2 podría ejercer una excelente eficacia antitumoral, y el tumor finalmente retrocedería por completo. Luego, ajustamos el experimento in vivo (Fig. 4B). Iniciamos el tratamiento el día 14 cuando el tumor era más grande (281.596±31.469 mm3), y empezó a aparecer diferencia de eficacia entre el grupo de tratamiento VO y el grupo de tratamiento combinado (fig. 4C). En comparación con los otros grupos, los tumores en el grupo de tratamiento combinado retrocedieron más rápido. Además, los ratones del grupo de combinación tuvieron una tasa de supervivencia más alta (P = 0,041) que los ratones de los grupos OH2 y OH2+iIsotype (Fig. 4D). El número de ratones que lograron la regresión del tumor también fue el más grande. En comparación con el grupo de control, ambos grupos que utilizaron OH2 pudieron inhibir eficazmente el crecimiento tumoral y prolongar la supervivencia de los ratones (Fig. 4E, F). Sin embargo, el anticuerpo anti-SIRPα solo no inhibió el crecimiento tumoral (P>0,05, Fig. 4E) ni prolongó el tiempo de supervivencia de los ratones portadores de tumores (P>0,05, Fig. 4F).

También verificamos la exclusión inmune en modelos de ratón 4T-1 (Fig. 4G). Como se muestra en la Fig. 4H, el grupo de combinación mostró un potente efecto antitumoral que fue significativamente diferente del grupo OH2 (p=0,0041) y el grupo de control (p=0,003). Además, los ratones del grupo de combinación tuvieron una mejor tasa de supervivencia que los ratones de los grupos OH2 (p=0,03) y de control (p=0,0014) (Fig. 4I). Estos resultados mostraron que los anticuerpos anti-SIRPα mejoraron la eficacia de la terapia con OH2.

Posteriormente, realizamos un análisis patológico del tejido tumoral de los ratones. Los resultados patológicos mostraron que en el microambiente tumoral de los ratones que no recibieron tratamiento, la proporción de macrófagos M2 fue mucho mayor que la de los macrófagos M1 (Fig. 5A, Archivo adicional 3: Fig. S12). El tratamiento con OH2 redujo la infiltración de macrófagos M2 (p<0,001) y aumentó hasta cierto punto la infiltración de células NK (p<0,05) en el microambiente tumoral (Fig. 5B y C). El uso combinado de anticuerpo anti-SIRPα y OH2 resultó en una mayor infiltración de células T CD8 (p<0,01) y macrófagos M1 (p<0,001) en el microambiente tumoral (Fig. 5D y E). Los resultados de la inmunohistoquímica mostraron que las células inmunitarias del grupo de tratamiento combinado se concentraron en la parte central del tumor (Fig. 5F, G y archivo adicional 3: Fig. S13). Esto implicaba que se mejoraba la capacidad de estas células inmunitarias inhibidoras de tumores para migrar al centro del tumor. Estos resultados sugirieron que la terapia combinada puede estimular una respuesta inmune antitumoral más fuerte que el tratamiento solo.

M-IHC y tinción IHC del modelo de tratamiento con anticuerpos anti-SIRPα. Un resultado M-IHC representativo del grupo de anticuerpos anti-SIRPα combinados con OH2, el isotipo combinado con OH2, el grupo OH2 y el grupo de control con un volumen tumoral más grande se sentaron en el tratamiento inicial. CD8, verde, CD16, azul cielo, F4/80, morado, CD86, naranja y CD206, rojo. Barra de escala, 100 μm. B Resultados cuantitativos de la tinción de células NK (CD16) en el grupo de anticuerpos anti-SIRPα combinados con OH2, el isotipo combinado con OH2, el grupo OH2 y el grupo de control. n=3 muestras/grupo. C Resultado cuantitativo de la tinción de macrófagos M2 (F4/80+CD206+) en el grupo de anticuerpos anti-SIRPα combinados con OH2, isotipo combinado con OH2, grupo OH2 y grupo de control. n=3 muestras/grupo. D Resultados cuantitativos de la tinción de macrófagos M1 (F4/80+CD86+) en el grupo de anticuerpos anti-SIRPα combinados con OH2, el isotipo combinado con OH2, el grupo OH2 y el grupo de control. n=3 muestras/grupo. E Resultados cuantitativos de la tinción de células T CD8 en el grupo de anticuerpos anti-SIRPα combinados con OH2, el isotipo combinado con OH2, el grupo OH2 y el grupo de control. n=3 muestras/grupo. F Tinción IHC representativa para CD8, CD16, F4/80, CD86 y CD206 del grupo de anticuerpos anti-SIRPα combinados OH2, grupo de isotipo combinado OH2, grupo OH2 y grupo de control con volúmenes tumorales más grandes en el tratamiento inicial. Ampliación original, ×200. n=5 muestras/grupo. G Resultados cuantitativos de la tinción de CD8, CD16, F4/80, CD86 y CD206 en el grupo de anticuerpos anti-SIRPα combinados OH2, isotipo combinado OH2, grupo OH2 y grupo de control. n=5 muestras/grupo. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA con comparaciones múltiples. ns, sin diferencias significativas, *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.001, ****, p<0.0001 (proporción representa el porcentaje de la celda con respecto al número total de celdas)

Utilizamos la secuenciación de ARN y la secuenciación de ARN único para caracterizar el TME con más detalle. El tratamiento con OH2 solo puede promover la infiltración de células inmunitarias adaptativas (células T y células Th1) y células inmunitarias innatas (macrófagos y DC) en el microambiente inmunitario del tumor (Fig. 6A). En el grupo de terapia combinada, las puntuaciones de macrófagos fueron mucho más altas. Aunque no hubo una diferencia significativa, las CD, CD8+ y la citotoxicidad mejoraron con la combinación en comparación con el tratamiento con OH2 solo (Fig. 6B). Cuando se combinaron anti-SIRPα y OH2, fueron más propicios para la infiltración de células inmunitarias en los tejidos tumorales, especialmente macrófagos, DC, células T y células NK. Las células inmunes se activaron globalmente, creando así un microambiente tumoral antitumoral (Fig. 6C). Como resultado de la infiltración de células inmunitarias, se mejoró la señal de presentación del antígeno en los tumores del grupo de tratamiento combinado y se fortaleció la función de destrucción de las células inmunitarias (Fig. 6D y archivo adicional 3: Fig. S14). Sin embargo, la capacidad de proliferación de las células tumorales disminuyó y aumentó la apoptosis (Fig. 6C, Archivo adicional 3: Fig. S15). El análisis GO mostró que la migración de leucocitos y la quimiotaxis mejoraron en el grupo de tratamiento combinado, de acuerdo con los resultados de IHC (Fig. 6E y F). La capacidad de migración mejorada y la activación funcional de las células inmunitarias en los tejidos tumorales, así como la activación completa de las citocinas relacionadas con M1, las citocinas relacionadas con las células T y las citocinas relacionadas con NK, promovieron la eliminación de las células tumorales (Fig. 6G-I). ). Estos resultados sugirieron que la terapia combinada puede remodelar más profundamente el TME y activar respuestas inmunitarias innatas y adaptativas más fuertes.

El microambiente inmune tumoral revelado por los resultados de secuenciación de ARN de tejidos tumorales en diferentes grupos de tratamiento. A Los resultados del análisis de infiltración de células inmunitarias de los tejidos tumorales del grupo de anticuerpos anti-SIRPα combinados OH2, el grupo OH2 y el grupo de control por GSVA. B Los resultados de la puntuación de las células inmunitarias (macrófagos, DC, células Th1, células Th2, células T, células T CD8, células NK CD56bright y células citotóxicas) de tejidos tumorales del grupo de anticuerpos anti-SIRPα combinados OH2, grupo OH2 y grupo de control por GSVA. C Las vías de señalización relacionadas con el sistema inmunitario de los tejidos tumorales del grupo de anticuerpos anti-SIRPα combinados OH2, el grupo OH2 y el grupo de control por GSVA. D Los resultados de la puntuación de las vías de señalización relacionadas con el sistema inmunitario (interferón, actividad de las células NK, citotoxicidad, cebado y activación de células T, localización de células inmunitarias en tumores, señalización de citocinas y quimiocinas) de tejidos tumorales del grupo de anticuerpos anti-SIRPα combinados OH2 , grupo OH2 y grupo control por GSVA. Análisis E GO de genes expresados ​​diferencialmente en el grupo de control y el grupo de anticuerpos anti-SIRPα combinados con OH2. Análisis F GO de genes expresados ​​diferencialmente en el grupo OH2 y el grupo de anticuerpos anti-SIRPα combinados OH2. G El nivel de expresión de citocinas relacionadas con M1 en el grupo OH2, OH2 combinado con el grupo de anticuerpos anti-SIRPα y el grupo de control. H Los niveles de expresión de citocinas relacionadas con células T en el grupo OH2 y OH2 combinado con el grupo de anticuerpos anti-SIRPα y el grupo de control. I El nivel de expresión de citocinas relacionadas con NK en el grupo OH2, OH2 combinado con el grupo de anticuerpos anti-SIRPα y el grupo de control. Se usó una prueba t de Student no pareada para analizar la significación de la diferencia entre los dos grupos. ns, sin diferencias significativas, *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,001, ****, p<0,0001. El color representa el valor del nivel de expresión del gen en la secuenciación de ARN. OH2 + SIRPα representa el OH2 combinado con el grupo de anticuerpos anti-SIRPα

Los datos de una sola célula mostraron que las células inmunitarias en el microambiente tumoral se podían dividir en células T, células B, células NK, células mieloides, mastocitos y células DC (Fig. 7A y archivo adicional 3: Fig. S16). La proporción de cada subconjunto de células inmunitarias se muestra en la Fig. 7B. En comparación con el grupo de control, las células T, las células NK y las células DC en el grupo OH2 y el grupo de anticuerpos anti-SIRPα combinados con OH2 aumentaron, mientras que las células mieloides disminuyeron. En comparación con el grupo tratado con OH2 solo, las células NK y las células DC aumentaron significativamente en el grupo de tratamiento combinado y las células mieloides disminuyeron significativamente (Fig. 7B). El análisis de los diferentes tipos de macrófagos mostró que (Fig. 7C) los macrófagos M1 aumentaron en ambos grupos tratados con OH2, pero el aumento de los macrófagos M1 fue más significativo en el grupo de tratamiento combinado (Fig. 7D). Se identificaron los genes expresados ​​diferencialmente entre el grupo de anticuerpos anti-SIRPα combinados con OH2 y los otros dos grupos. Los fragmentos de ácido nucleico del virus, las proteínas de la cápside intactas no empaquetadas o los contenidos celulares pueden estar involucrados en el tratamiento como PAMP/DAMP. Los resultados de los datos de secuenciación de una sola célula mostraron que Tlr2 y Tlr13 están regulados al alza (Fig. 7E). Tlr2 y Tlr13 reconocen los componentes del virus y activan las vías de señalización dependientes del receptor tipo Toll (TLR) [22, 23], y la función de las células inmunes se activó fuertemente (Fig. 7F).

El microambiente inmunitario del tumor revelado por la secuenciación de ARN único da como resultado tejidos tumorales en diferentes grupos de tratamiento. A Agrupación de células inmunitarias en datos unicelulares. B Proporciones de diferentes subconjuntos de células inmunitarias en datos de una sola célula. C Agrupación de macrófagos en datos unicelulares. D Proporciones de diferentes subconjuntos de macrófagos en datos de una sola célula. E Gráfico de volcán que muestra los receptores tipo toll en genes expresados ​​diferencialmente en el grupo de anticuerpos anti-SIRPα combinados OH2. Análisis F GO de genes expresados ​​diferencialmente en el grupo de anticuerpos anti-SIRPα combinados OH2

Para verificar la respuesta del tratamiento de linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos del tumor, los linfocitos de bazo aislados de diferentes grupos de tratamiento (control, anti-SIRPα, OH2 y OH2+ anti-SIRPα) se cocultivaron con células CT26 in vitro en el objetivo. relaciones célula/célula efectora (T:E) de 1:100, 1:50 y 1:25. Los linfocitos tanto del grupo OH2 como del grupo OH2+ anti-SIRPα mostraron una respuesta CTL altamente específica contra las células CT26 (p<0,001). La respuesta CTL de OH2 combinado con anticuerpo anti-SIRPα fue más intensa que la de OH2 solo (p<0,05). Sin embargo, no se detectó ninguna respuesta de CTL con el anticuerpo anti-SIRPα solo (Archivo adicional 3: Fig. S17A). Se usó ELISA para detectar el sobrenadante de células cocultivadas y encontramos que la expresión de TNF-α, Granzima B e IFN-γ podía inducirse significativamente en el grupo OH2 y en el grupo OH2+anti-SIRPα (p<0,0001 , Archivo adicional 3: Fig. S17B). En general, las citoquinas efectoras de células T fueron ligeramente más altas en el grupo OH2+anti-SIRPα que en el grupo OH2, aunque no hubo diferencia estadística. Además, las citocinas efectoras de células T no se detectaron con el anticuerpo anti-SIRPα solo. Estos resultados sugirieron que la terapia de combinación también puede mejorar los CTL específicos del tumor.

Presentamos la eficacia y los efectos moleculares e inmunológicos de la terapia combinada con el virus del herpes simple oncolítico y anti-SIRPα en un modelo de ratón in vitro e in vivo (Fig. 8). Demostramos que el OH2 inducido por el lisado de células tumorales puede activar e inducir eficazmente la diferenciación de los macrófagos RAW264.7 de ratón hacia el fenotipo M1, mejorando su fagocitosis y matando los efectos sobre las células tumorales in vitro. Observamos que la combinación de OH2 y anti-SIRPα, que bloquea el eje CD47-SIRPα, puede mejorar efectivamente el efecto terapéutico al mejorar el efecto inmunológico innato de los macrófagos. La combinación de OH2 y anti-SIRPα también mostró una regulación más fuerte del microambiente inmune tumoral.

El tratamiento con OH2 polarizó los macrófagos a M1 para la eliminación de tumores in vivo, y el anticuerpo SIRPα combinado con la terapia con OH2 remodela el TME y activa una respuesta inmunitaria antitumoral más completa. La introducción del anticuerpo SIRPα puede acelerar la reconstitución celular de TME e inducir una respuesta inmunitaria antitumoral específica a través de una respuesta inmunitaria innata más temprana

En los últimos años, los VO se han considerado una nueva estrategia prometedora para el tratamiento del cáncer. En comparación con la terapia quirúrgica, la quimiorradioterapia y la terapia dirigida, los OV han demostrado una alta capacidad de destrucción, una capacidad de orientación precisa y pocos efectos secundarios o resistencia a los medicamentos [9, 24, 25]. Los OV se pueden modificar genéticamente para mejorar su capacidad de ataque al tumor, mejorar su seguridad y aumentar su eficacia antitumoral [26, 27]. Actualmente se están evaluando más de 40 tipos de OV en ensayos clínicos para el tratamiento de varios tumores, la mayoría de los cuales se encuentran en estudios de fase I [24], pero solo T-VEC ha ingresado con éxito a los ensayos clínicos de fase III y ha recibido la aprobación de comercialización [28] .

El OH2 utilizado en el estudio actual mostró una buena tolerancia a la inyección intratumoral y una actividad antitumoral persistente en pacientes con cáncer metastásico de esófago y recto en un estudio reciente [29]. Aunque una gran cantidad de ensayos clínicos han mostrado resultados positivos con los OV, su eficacia como agentes de monoterapia es limitada [6, 30, 31]. Por lo tanto, la terapia combinada es una de las estrategias utilizadas para mejorar el efecto terapéutico de los VO [32, 33].

El mecanismo por el cual OV mata los tumores incluye la infección y la replicación en las células tumorales, lo que lleva a la lisis o apoptosis de las células tumorales, y un mecanismo más importante es que las células tumorales muertas liberan antígenos relacionados con el tumor para lograr una respuesta inmunitaria específica del tumor mejorada. [34]. Dado que la terapia con OV puede inducir una respuesta inmunitaria antitumoral adaptativa, una combinación de inhibidores de puntos de control inmunitarios (ICI) y OV podría tener un valor clínico potencial. Algunos estudios han demostrado que la OV combinada con inhibidores de CTLA-4 o inhibidores de PD-1 mejora la respuesta antitumoral y mejora significativamente la supervivencia del paciente, tanto en estudios preclínicos como en ensayos clínicos [2, 35,36,37,38]. Actualmente, hay 19 ensayos clínicos en curso de terapia combinada de ICI y OV, lo que demuestra que la terapia combinada se ha convertido en uno de los puntos calientes de las opciones de tratamiento clínico OV [39].

Sin embargo, la terapia de combinación existente se enfoca más en la respuesta inmune adaptativa y menos en la inmunidad innata. Cuando los OV lisan las células tumorales, liberan muchas citocinas, patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) y patrones moleculares asociados a daños (DAMP), que activan las respuestas inmunitarias innatas. Nuestros datos mostraron que el lisado de OH2 después de la infección con células tumorales podría estimular de manera efectiva la activación de la línea de macrófagos de ratón RAW264.7 y la polarización similar a M1 in vitro. Aunque los resultados de la secuenciación del ARN mostraron que las células RAW264.7 tenían una fuerte respuesta inmunitaria antiviral, las células RAW264.7 polarizadas similares a M1 también mostraron una capacidad significativa de destrucción específica del tumor en experimentos posteriores. Saha et al. [40] mostró que ICI combinado con OV extendió modestamente la supervivencia de un modelo de glioma de ratón, que se asoció con la entrada de macrófagos y la polarización similar a M1. Estos resultados sugieren que la combinación de OV con células inmunitarias innatas, como macrófagos y células dendríticas, también tiene un valor de aplicación potencial.

Estudios recientes han demostrado que el eje CD47-SIRPα es un punto de control fagocítico que regula los macrófagos y otras células inmunes innatas, y una serie de moléculas que bloquean el eje CD47-SIRPα están en desarrollo clínico para la terapia tumoral [13, 41]. Algunos grupos de investigación han diseñado oHSV1 que expresa un anticuerpo CD47 de longitud completa, que ha logrado una buena eficacia terapéutica en modelos de ratón con cáncer de ovario metastásico y glioblastoma [42, 43]. Yao et al. [44] informaron sobre el efecto antitumoral de un nuevo adenovirus oncolítico que contiene el gen de fusión SIRPα-IgG1 Fc en el cáncer positivo para CD47. Dado que el CD47 se expresa comúnmente en niveles elevados en los tejidos normales, es cuestionable el direccionamiento específico de las células tumorales a través del CD47 [45]. SIRPα se expresa en gran medida en células de la médula ósea, como macrófagos y DC, pero se expresa en niveles bajos en otras células inmunitarias. Por lo tanto, SIRPα puede ser un objetivo más ideal para el eje CD47-SIRPα [45, 46]. En este estudio, demostramos que la terapia con virus oncolíticos podría reclutar y activar macrófagos de manera efectiva in vivo e inducir una polarización similar a M1, lo que demuestra la viabilidad de bloquear los OV en combinación con el bloqueo del eje CD47-SIRPα. La combinación de OH2 y anticuerpos anti-SIRPα tuvo un efecto significativo en el tratamiento del modelo CT-26 de cáncer colorrectal de ratón. Curiosamente, descubrimos que la terapia de combinación fue más efectiva en ratones con volúmenes tumorales iniciales más grandes. Esto puede deberse a la cantidad de monocitos infiltrados en el microambiente tumoral con el aumento del tamaño del tumor, y el tratamiento con virus oncolítico cambió el microambiente tumoral de "frío" a "caliente", induciendo así la generación de macrófagos similares a M1 más abundantes. Estos resultados también sugieren que el efecto terapéutico se puede mejorar aún más mediante la optimización de diferentes tiempos de dosificación de la terapia de combinación.

Con una mejor comprensión del microambiente inmunitario tumoral, la inmunoterapia basada en macrófagos se está convirtiendo en una realidad [47]. Los macrófagos son reguladores importantes de muchos aspectos de la TME y pueden activar respuestas inmunitarias específicas de tumores directamente o mediante efectos no específicos en las funciones de las células T y B [12, 48, 49]. También observamos que la terapia OV sola o en combinación con el anticuerpo SIRPα reclutó una gran cantidad de células NK y monocitos para desencadenar respuestas inmunitarias innatas, lo que es consistente con los hallazgos de Ramelyte et al. [50]. Los macrófagos juegan un papel importante en la limitación de la infección por HSV [51, 52], y los resultados de la secuenciación de células individuales mostraron la activación de las vías de señalización de TLR involucradas en el grupo de terapia combinada. Observamos que la terapia combinada no produjo una respuesta antiviral significativa en comparación con el tratamiento solo; sin embargo, es más probable que los macrófagos activen el estado inmunitario general. Los resultados sugieren que la terapia de combinación induce una destrucción más específica de las células tumorales. Las características de la terapia combinada a nivel celular y molecular se basan en la rápida reconstrucción del entorno inmunitario dentro del TME y la activación integral y continua de la inmunidad innata y adaptativa. La eficacia de la terapia combinada se debe a múltiples sinergias inmunitarias, no solo a un tipo de célula inmunitaria. Los macrófagos pueden desempeñar un papel en la presentación temprana de antígenos y en una respuesta inmunitaria ampliada.

En conclusión, nuestros datos respaldan la viabilidad de la terapia con virus oncolíticos en combinación con un anticuerpo anti-SIRPα. La introducción del anticuerpo anti-SIRPα puede acelerar la reconstitución celular del TME e inducir una respuesta inmunitaria antitumoral específica a través de una respuesta inmunitaria innata más temprana. Nuestro estudio sugiere una nueva estrategia para la terapia con virus oncolíticos.

Los datos asociados con este estudio están presentes en el documento o en los Materiales complementarios. Los datos de RNA-seq también están disponibles de los autores correspondientes previa solicitud razonable.

Proteína alfa reguladora de la señal

Virus del herpes simple oncolítico 2

virus oncolítico

secuenciación de ARN

Ambiente del microambiente tumoral

Bloqueo de puntos de control inmunológico

Muerte celular inmunogénica

Patrones moleculares asociados al daño

Patrones moleculares asociados a patógenos

Sobrenadante libre de células

Kit de conteo de células-8

Ontología de genes

Enciclopedia de Kioto de Genes y Genomas

Análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes

Liposomas de clodronato

Inmunohistoquímica multicolor

inmunohistoquímica

Libre de patógenos específicos

receptor tipo toll

Linfocito T citotóxico

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Descargar referencias

Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias de China (No. 82001758) y el Programa Clave de Investigación y Desarrollo de la provincia de Hubei (2020BCA062).

State Key Laboratory of Molecular Oncology, Department of Etiology and Carcinogenesis, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing, 100021, China

Defeng Kong, Zhenrong Yang, Guoliang Li, Quanyou Wu, Zhaoru Gu, Duo Wan, Qi Zhang, Xiaoli Zhang, Shujun Cheng y Kaitai Zhang

Centro Nacional "111" de Regulación Celular y Farmacia Molecular, Laboratorio Clave de Ingeniería de Fermentación (Ministerio de Educación), Centro Provincial de Innovación Cooperativa de Fermentación Industrial de Hubei, Facultad de Bioingeniería, Universidad Tecnológica de Hubei, Wuhan, 430068, China

binlei liu

Departamento de Inmunología, Centro Nacional del Cáncer/Centro Nacional de Investigación Clínica para el Cáncer/Hospital del Cáncer, Academia China de Ciencias Médicas y Facultad de Medicina de la Unión de Pekín, Pekín, 100021, China

wen zhang

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WZ, KTZ y DFK diseñaron los experimentos. DFK realizó los experimentos. DFK, WZ y QYW realizaron procesamiento de datos y análisis estadístico. DFK, WZ, KTZ y BLL escribieron, revisaron y/o revisaron el manuscrito. ZRY, GLL, ZRG, SW, QZ, ZLZ y SJC brindaron apoyo administrativo, técnico o material (es decir, preparar instrumentos quirúrgicos para experimentos con animales, informar u organizar datos y construir bases de datos). WZ y KTZ supervisaron el estudio. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Binlei Liu, Kaitai Zhang o Wen Zhang.

Este estudio fue aprobado en su totalidad por el Centro Nacional del Cáncer/Centro Nacional de Investigación Clínica para el Cáncer/Hospital del Cáncer, la Academia China de Ciencias Médicas y el Colegio Médico de la Unión de Pekín (NCC2020A308).

No aplica.

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Gene lis para mapa de calor.

lista de genes GSVA.

Resultados del ensayo de proliferación celular. Resultados del ensayo de proliferación celular de líneas celulares Raw264.7 tratadas con OH2 MOI=1 (rojo), OH2 MOI=0,5 (azul) y grupo no tratado (negro) mediante ensayo CCK8 en 72 horas. Figura S2. Los lisados ​​de OH2 inducen la polarización y la fagocitosis de RAW264.7 in vitro. A. Demostración del análisis de la fagocitosis por citometría de flujo. B. Resultados del ensayo de proliferación celular de las líneas celulares CT26, MC38 y 4T-1 tratadas con lisado (rojo), CFS (azul), lisado celular congelado (púrpura) y grupo no tratado (negro) mediante el ensayo CCK8 en 24 horas. **, p<0,01. Figura S3. La proporción de macrófagos M1 (F4/80+CD86+) y M2 (F4/80+CD206+) en RAW264.7 sin ningún tratamiento por citometría de flujo. Figura S4. La proporción de macrófagos M1 (F4/80+CD86+) y M2 (F4/80+CD206+) en RAW264.7 tratados con lisado en el grupo SIRPα bloqueado y el grupo SIRPα no bloqueado. A. Demostración del análisis de la polarización de macrófagos por citometría de flujo. B. Visualización de resultados de control de isotipos para diferentes anticuerpos. C. La proporción de macrófagos M1 (F4/80+CD86+) y M2 (F4/80+CD206+) en el grupo SIRPα bloqueado y el grupo SIRPα no bloqueado. D. La proporción de macrófagos M1 (F4/80+CD86+) y M2 (F4/80+CD206+) en el grupo SIRPα bloqueado y el grupo SIRPα no bloqueado. Se usó una prueba t de Student no pareada para analizar la significación de la diferencia entre dos grupos. Figura S5. El lisado celular congelado y el CFS inducen la polarización RAW264.7 in vitro. A. Resultados del análisis de citometría de flujo de una muestra representativa de cada línea celular. B. La proporción del subtipo M1 (F4/80+CD86+) en el lisado congelado de células y los grupos CFS de células CT26, MC38 y 4T-1 detectadas por citometría de flujo. Se usó una prueba t de Student no pareada para analizar la significación de la diferencia entre dos grupos. Figura S6. Los lisados ​​de OH2 inducen la polarización de macrófagos primarios in vitro. A. Demostración del análisis de la polarización de macrófagos por citometría de flujo. B. El porcentaje de subtipo M1 (F4/80+CD86+) y subtipo M2 (F4/80+CD206+) en los grupos de lisado, CFS, lisado sin tratar y células congeladas detectado por citometría de flujo. Los datos son promedios de tres muestras por grupo de tratamiento. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA con comparaciones múltiples. ns, sin diferencias significativas, *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,001, ****, p<0,0001. Figura S7. La clara eficiencia de CL detectada por citometría de flujo. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA con comparaciones múltiples. ***, p=0,0003; ****, p<0,0001. Figura S8. Reexposición al tumor con CT26 de los animales curados con OH2 u OH2+ CL. A. La curva de crecimiento tumoral de las células CT26 se vuelve a exponer después de que los tumores del modelo CL hayan retrocedido por completo. B. La tasa tumorigénica de ratones de reexposición tumoral en el grupo de liposomas de control combinado con OH2 y el grupo CL combinado con OH2. Las diferencias estadísticas se calcularon mediante la prueba de Chi-cuadrado. p=0,0291. Figura S9. Tinción M-IHC de OH2 (izquierda) y grupo CL combinado de OH2 (derecha) que incluye cada marcador de tinción individual. Figura S10. Nivel de expresión de SIRPα en macrófagos en bazo de ratones detectado por citometría de flujo. A. Demostración del nivel de expresión de SIRPα en macrófagos en bazo de ratones detectados por citometría de flujo. B. Histograma que muestra el nivel de expresión de SIRPα en macrófagos en bazo de ratones (n = 3). Figura S11. La terapia anti-SIRPα combinada con OH2 mejora las respuestas inmunitarias contra el cáncer en un modelo de cáncer CT26. A. El proceso de tratamiento y el cronograma experimental para el tratamiento combinado. B. La curva de crecimiento tumoral de diferentes grupos de tratamiento de ratones portadores de tumores con volúmenes tumorales más pequeños en el tratamiento inicial. El cuadro rojo se amplió para mostrar el grupo de anticuerpos anti-SIRPα combinados con OH2, el isotipo combinado con OH2 y el grupo OH2. Se realizó un análisis de varianza de dos vías (ANOVA) en los datos experimentales. n=10 ratones/grupo. ns, sin diferencias significativas. C. La curva de supervivencia de diferentes grupos de tratamiento de ratones portadores de tumores con volúmenes de tumor más pequeños en el tratamiento inicial. Se utilizaron el método de Kaplan-Meier y la prueba de rangos logarítmicos para los datos de la curva de supervivencia. ns, sin diferencias significativas. Figura S12. Resultados de tinción M-IHC del modelo anti-SIRPα. Tinción M-IHC del grupo de control (arriba a la izquierda), grupo OH2 (arriba a la derecha), grupo de isotipo combinado de OH2 (abajo a la izquierda) y grupo de anticuerpos anti-SIRPα combinados con OH2 (abajo a la derecha) que incluye cada marcador de tinción individual. Figura S13. Tinción IHC y resultados cuantitativos del modelo de tratamiento con anticuerpos anti-SIRPα. A. Tinción IHC representativa para CD8, F4/80, CD86 y CD206 del grupo de anticuerpos anti-SIRPα combinados OH2, el grupo de control y el grupo de anticuerpos anti-SIRPα con volúmenes tumorales más grandes en el tratamiento inicial. B. Resultados cuantitativos de la tinción de CD8, F4/80, CD86 y CD206 en el grupo de anticuerpos anti-SIRPα combinados con OH2, el grupo de control y el grupo de anticuerpos anti-SIRPα. Ampliación original, ×200. n=5 muestras/grupo. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA con comparaciones múltiples. ns, sin diferencias significativas, *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,001, ****, p<0,0001. Figura S14. Resultados KEGG de tejidos tumorales del modelo anti-SIRPα. A. Resultados KEGG de genes expresados ​​diferencialmente entre el grupo de anticuerpos anti-SIRPα combinados con OH2 y el grupo de control. B. Resultados KEGG de genes expresados ​​diferencialmente entre el grupo de anticuerpos anti-SIRPα combinados con OH2 y el grupo de anticuerpos Isotipo combinados con OH2. Figura S15. Resultados de GSEA de tejidos tumorales del modelo anti-SIRPα. A. Resultados de GSEA de genes expresados ​​diferencialmente entre el grupo de anticuerpos anti-SIRPα combinados con OH2 y el grupo de control. B. Resultados de GSEA de genes expresados ​​diferencialmente entre el grupo de anticuerpos anti-SIRPα combinados OH2 y el grupo de anticuerpos Isotipo combinados oHSV-2. Figura S16. Análisis de datos de scRNA-seq. A. Las gráficas UMAP representan los grupos (izquierda) y grupos (derecha) de células tumorales. B. Un mapa de calor que muestra la expresión promedio escalada de cada subgrupo de celdas. C. Gráficos UMAP que muestran los valores de expresión de los genes marcadores canónicos de cada subgrupo. D. Un mapa de calor que muestra la expresión promedio escalada de cada subgrupo de células inmunitarias. C. Gráficos UMAP que muestran los valores de expresión de los genes marcadores canónicos de cada subgrupo inmunitario. Figura S17. Ensayo CTL. A. Las funciones de destrucción de los linfocitos cocultivados con diferentes lisados ​​de células cancerosas detectados por CFSE/PI. Se establecieron tres proporciones de efectores a objetivo para cada línea celular (Linfocito: células tumorales = 25: 1, 50: 1 y 100: 1). Los datos son promedios de tres muestras por grupo de tratamiento. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA con comparaciones múltiples. ns, sin diferencias significativas, *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,001, ****, p<0,0001. B. El sobrenadante del ensayo CTL se analizó para TNF-α, Granzima B e IFN-γ mediante ELISA. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA con comparaciones múltiples. ns, sin diferencias significativas, ****, p<0,0001.

Métodos complementarios.

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Reimpresiones y permisos

Kong, D., Yang, Z., Li, G. et al. El anticuerpo SIRPα combinado con el virus oncolítico OH2 protege contra los tumores activando la inmunidad innata y reprogramando el microambiente inmune del tumor. BMC Med 20, 376 (2022). https://doi.org/10.1186/s12916-022-02574-z

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Recibido: 09 marzo 2022

Aceptado: 21 de septiembre de 2022

Publicado: 31 de octubre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1186/s12916-022-02574-z

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