Desarrollo de un anticuerpo biespecífico dirigido a la EP

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 18011 (2022) Citar este artículo

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El ligando de muerte programada 1 (PD-L1) y el inmunorreceptor de células T con dominios Ig e ITIM (TIGIT) son dos objetivos potenciales para la inmunoterapia contra el cáncer, los primeros estudios clínicos mostraron que la terapia combinada de anti-PD-L1 y anti-TIGIT tenía una eficacia sinérgica tanto en términos de tasa de respuesta global (ORR) como de supervivencia global (OS). Es racional construir anticuerpos biespecíficos dirigidos a PD-L1 y TIGIT, además de conservar la eficacia de la terapia de combinación, los anticuerpos biespecíficos (BsAbs) pueden proporcionar un nuevo mecanismo de acción, como puente entre las células tumorales y las células T/NK. Aquí, desarrollamos un anticuerpo biespecífico de tipo IgG1 con una citotoxicidad óptima. En este estudio, investigamos a fondo 16 formatos IgG-VHH con orientaciones variables y longitudes de enlace, los resultados demostraron que el enlace (G4S) 2 no solo separó correctamente dos dominios de unión, sino que también tuvo el mayor rendimiento de proteína. Además, la orientación VHH-HC mantuvo perfectamente la actividad de unión y citotoxicidad del dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo solo de cadena pesada (VHH) y la inmunoglobulina G (IgG). Después del tratamiento con BiPT-23, el crecimiento tumoral se suprimió significativamente in vivo, con más linfocitos T citotóxicos (CTL) e infiltración de células asesinas naturales (NK), y agotamiento selectivo de las células T reguladoras (Treg). BiPT-23 representa una inmunoterapia novedosa diseñada para prevenir la hiperprogresión del cáncer con el bloqueo de PD-1 y, preferentemente, eliminó las células tumorales PD-L1+ y TIGIT+ Tregs, pero mantuvo las células inmunitarias CD11b+F4/80+ dentro del microambiente tumoral (TME).

En las últimas dos décadas, los anticuerpos biespecíficos brindaron enormes oportunidades para el tratamiento de la deficiencia de coagulación1 y el cáncer2,3,4. Se realizaron 272 ensayos clínicos de anticuerpos biespecíficos entre 1997 y 2020, los BsAb poseían cientos de formatos5 y alrededor de seis mecanismos de acción6, según el mecanismo de acción (MOA), se deben adoptar diferentes formatos. Sin embargo, no todos los formatos son adecuados para la fabricación industrial, se ha demostrado que IgG-like y BiTE poseen una buena capacidad de desarrollo y están protegidos por patentes7. Desde el descubrimiento de VHH en 19938, VHH recibió mucha atención de institutos académicos y empresas de biotecnología. La aprobación de Caplacizumab por parte de la Administración de Drogas y Alimentos de los EE. UU. (FDA) en 2019 dio un impulso a VHH9. Debido a su pequeño tamaño (15 kDa), es conveniente construir anticuerpos biespecíficos con VHH.

Entre todos los ensayos clínicos, el 17,28% fueron bloqueo de doble punto de control10. Los inhibidores de puntos de control inmunitarios tenían el potencial de redefinir la inmunoterapia contra el cáncer. Recientemente, se descubrió que la inmunoglobulina de células T y el dominio ITIM (TIGIT) se coexpresaban con PD-1 en linfocitos infiltrantes de tumores (TIL)11, y la combinación del bloqueo de PD-L1/PD-1 con anti-TIGIT mostró ORR y OS que PD-L1/PD-1 agente único en PD-L1 positivo (puntuación de proporción tumoral [TPS] ≥ 1%) pacientes con cáncer12. Hay varios anticuerpos biespecíficos en desarrollo clínico en China dirigidos a PD-L1 y TIGIT13,14, sin embargo, ninguno de ellos fue optimizado para inducir citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP).

En los tumores, PD-L1 se expresa tanto en las células tumorales15 como en las células inmunitarias16, y los datos preclínicos revelaron que la Fc funcional podría mejorar la actividad antitumoral de los anticuerpos PD-L1 a través de la ADCC contra las células mieloides inmunosupresoras positivas para PD-L117 y células tumorales 18. Varios anticuerpos PD-L1 aprobados o en ensayos clínicos son anticuerpos monoclonales IgG1 con función efectora19. Recientemente, los investigadores desarrollaron un anticuerpo monoclonal (mAb) anti-TIGIT, T4, que causó una reducción significativa en la frecuencia de células T reguladoras intratumorales y activó respuestas adicionales de células T antitumorales CD8+20. La posterior ingeniería de Fc para mejorar la capacidad de participación de FcγR mejoró aún más la eficacia antitumoral20. Además, la interacción con FcγR en APC podría mejorar las respuestas de células T específicas de antígeno para anti-TIGIT21. En resumen, la interacción Fc-FcγR para los bloqueos de PD-L1 y TIGIT no solo ayudó a NK a agotar las células tumorales y las Treg, sino que también fortaleció la comunicación cruzada entre las células T y las células presentadoras de antígeno (APC).

En este estudio, investigamos sistemáticamente la relación entre la citotoxicidad de BsAb y los formatos IgG-VHH. Primero, construimos 16 BsAbs basados en IgG y VHH, y demostramos que la conexión de VHH con la cadena ligera de IgG debilitaba el par entre HC y LC. A continuación, confirmamos que colocar el VHH en el extremo N de la cadena pesada mantenía la citotoxicidad del VHH parental, pero no en el extremo C. Por último, la actividad antitumoral in vivo mostró que el principal candidato podía suprimir el crecimiento del carcinoma de colon MC38, reducir la frecuencia de las células Treg intratumorales, aumentar las células NK y T y mantener las células inmunitarias CD11b+F4/80+, incluidas las CD y los macrófagos dentro de la TME.

YN035 (IgG, anti-PD-L1) y hTIGI7.6, hTIGI7.11E (VHH, anti-TIGIT) fueron desarrollados previamente por Oricell Therapeutics. hTIGI7.6 y hTIGI7.11E de la misma secuencia progenitora de hTIGI7 tenían solo unas pocas diferencias de aminoácidos en CDR3. Con base en YN035 y hTIGI7.6, diseñamos 16 anticuerpos biespecíficos (IgG adjuntas) con diferentes formatos y longitudes de enlace (Fig. 1). La bivalencia no solo podría mejorar la formación de conjugados, lo que puede ayudar a que las células T/NK que expresan TIGIT se acerquen a las células tumorales PD-L122, sino que también mantuvo la actividad de bloqueo de los anticuerpos parentales. La mejor opción del enlazador flexible y soluble fue (G4S)n, que se aplicó para conectar dominios que requerían cierto grado de movimiento23. El enlazador más largo fue (G4S)3, que se calculó en alrededor de 5,7 nm23, más corto que la distancia de la sinapsis inmune (13 nm)24. Al ajustar fácilmente el número de n, el enlazador permitió que los BsAbs se plegaran correctamente, logrando el mayor rendimiento y actividades biológicas óptimas. En nuestro diseño se evitó n ≥ 4, por un lado, (G4S)3 fue lo suficientemente largo para separar dos dominios de unión25; por otro lado, GSG es el motivo para la O-xilosilación y la cantidad total de xilosilación aumenta a medida que aumenta el número de motivos GSG en el enlazador26.

El diseño de anticuerpos biespecíficos. El verde es el VHH frente a TIGIT, el azul oscuro es la cadena pesada de anti-PD-L1, el marrón es la cadena ligera y el negro es el enlazador: (GGGGS)n, n = 0–3.

Todos los BsAbs se expresaron en células EXPI293 (Thermo Fisher Scientific, A14527CN), después de la purificación con proteína A, la agregación y disociación de BsAbs se evaluaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño analítica (SEC) (Fig. 2). En este ensayo, los BsAbs se calcularon teóricamente en 180 kDa, incluido un IgG de 150 kDa y dos VHH de 15 kDa, el tiempo de elución del monómero de los BsAbs fue de aproximadamente 7,1 a 7,4 min. No se observó agregación significativa para todos los BsAbs. Sin embargo, en el tiempo de elución de 8,1 a 8,4 min, los formatos de IgG-[L]-VHH (Fig. 2I-P) tuvieron un pequeño pico (7 a 17 %) que puede ser la cadena pesada de BsAbs, no se encontró cadena ligera. observado en el ensayo SEC, porque la disociación se produjo en los pasos de expresión o purificación, no en el almacenamiento. Los resultados de los datos demostraron que los anticuerpos biespecíficos IgG-[H]-VHH eran más estables que los IgG-[L]-VHH, por lo que se eligieron los formatos AH (Fig. 2) para un análisis adicional y se construyeron anticuerpos biespecíficos BiPT-18 contra BiPT- 25 basado en YN035 y hTIGI7.11E.

SEC de 16 anticuerpos biespecíficos a una concentración de 1 mg/ml. (A–H) Los formatos IgG-[H]-VHH no mostraron agregación ni pico de cadena pesada solamente. Los formatos IgG-[L]-VHH (I–P) no tenían un pico de agregación; sin embargo, la conexión de VHH a la cadena ligera debilitó la asociación de HC y LC, hubo un pequeño pico en el tiempo de elución de 8,1–8,4 min.

La capacidad de unión de BiPT-18–25 se analizó mediante citometría de flujo utilizando la línea de células 293 T que sobreexpresa PD-L1, para investigar la influencia de VHH en IgG. Aquí, todas las IgG-[H]-VHH se unieron a las células T PD-L1+ 293 al mismo nivel, tanto en términos de concentración efectiva máxima como media máxima (EC50) (Fig. 3A, Tabla 1). En comparación con el anticuerpo parental YN035, BiPT-18–25 mostró una pérdida de 1,5–2,0 veces en EC50; sin embargo, no observamos una reducción de la afinidad en el ensayo ForteBio (datos no mostrados). Además, para evaluar el impacto potencial del VHH en la región de unión de CD16a en BsAbs, realizamos ensayos de citotoxicidad in vitro, todos los anticuerpos biespecíficos, YN035, hTIGI7.11E y la combinación de anticuerpos parentales se midieron con PD-L1+ 293 T y célula mononuclear de sangre periférica humana (PBMC) (Fig. 3B). Todos los grupos excepto hTIGI7.11E tenían el mismo nivel de citotoxicidad en términos de lisis máxima y EC50. Estos resultados indicaron que la fusión de VHH con la cadena pesada no interrumpiría la unión de Fc a CD16a. A continuación, evaluamos la capacidad de unión y la citotoxicidad del brazo VHH de BsAbs. Primero, se realizó una citometría de flujo usando TIGIT que sobreexpresa la línea de células 293 T y los resultados mostraron que BiPT-22–25 (orientación VHH-HC) mantuvo la actividad de unión de hTIGI7.11E, BiPT-18–21 (orientación HC-VHH) mostró una reducción significativa en la unión, y la pérdida de unión se intensificó a medida que la longitud del enlazador se hizo más corta (Fig. 3C, Tabla 1). Hubo un impedimento estérico para el reconocimiento del antígeno, cuando el VHH se fusionó con el extremo C-terminal de la cadena pesada. Se pudieron observar los mismos resultados en el ensayo de citotoxicidad, BiPT-18–21 tuvo un desempeño inferior en la lisis celular, en comparación con BiPT-22–25 (Fig. 3D, Tabla 1). En resumen, la longitud del conector es crítica para la unión y citotoxicidad de VHH en la orientación HC-VHH, pero no en la orientación VHH-HC. Teniendo en cuenta la importancia de la citotoxicidad para los anticuerpos TIGIT, BiPT-22, 23, 24 y 25 eran mejores candidatos para un mayor desarrollo.

Actividades vinculantes y ADCC de BiPT. (A) Se muestra la capacidad de unión a PD-L1 humana. (B) Se muestra la actividad de ADCC para la línea de células T 293 que sobreexpresa PD-L1. (C) Se muestra la capacidad de unión a TIGIT humana. (D) Se muestra la actividad de ADCC para la línea de células T 293 que sobreexpresa TIGIT.

Además de la actividad biológica de BsAbs, también se analizó el rendimiento y la estabilidad de la expresión, BiPT-18–25 se expresaron en 100 ml y 300 ml de EXPI293 respectivamente, luego se purificaron en las mismas condiciones que los materiales y métodos. Los resultados mostraron que el enlazador (G4S)2 tuvo el mayor rendimiento tanto en la orientación HC-VHH como en la VHH-HC (Tabla 1). El ensayo de estabilidad no mostró diferencias entre BiPT-22-25 (Fig. 4A, B), sin embargo, hTIGI7.11E perdió la mitad de la capacidad de unión a TIGIT a 60 ° C y los BiPT no se vieron afectados. El resultado inesperado reveló que IgG ayudó a estabilizar el VHH en BsAbs. Por el contrario, la desnaturalización de VHH a 70 °C alteró la capacidad de unión de BiPT-22–25 a PD-L1. Teniendo en cuenta todos los resultados, BiPT-23 fue el mejor BsAb que podía unirse a PD-L1 y TIGIT simultáneamente (Fig. 4C). Se eligió BiPT-23 para evaluar la actividad antitumoral en el modelo de ratón humano TIGIT-KI C57BL/6.

El ensayo de estabilidad de BiPT-22-25. (A) Después de la prueba de calentamiento a temperaturas variables, se incubaron anticuerpos 25 nM con la línea de células 293 T que sobreexpresa PD-L1 para determinar su capacidad de unión. (B) Después de la prueba de calentamiento a temperaturas variables, se incubaron anticuerpos 25 nM con la línea de células 293 T que sobreexpresa TIGIT para determinar su capacidad de unión. (C) BiPT-23 podría unirse a PD-L1 y TIGIT simultáneamente en el ensayo ForteBio Octet.

Dado que YN035 tenía la reactivación cruzada entre PD-L1 humana y de ratón, hTIGI7.11E solo reconocía la TIGIT humana, y la TIGIT humana podía reconocer de forma cruzada el receptor del poliovirus de ratón (PVR)27. Utilizamos el ratón C57BL/6 humanizado con TIGIT y el carcinoma de colon MC38 para evaluar la eficacia in vivo y observamos una regresión tumoral dependiente de la dosis. 36 mg/kg de BiPT-23 mostraron una inhibición del crecimiento tumoral (TGItv) del 53,7 %, en comparación con el grupo IgG1-Fc (Fig. 5A). El análisis de citometría de flujo de las células inmunes dentro del TME mostró que las células T aumentaron significativamente en tres grupos de BiPT-23 (Fig. 5E). Los linfocitos T aumentados eran en su mayoría CTL positivos para CD8 (Fig. 5F), mientras que los linfocitos Th positivos para CD4 mostraban una ligera caída (Fig. 5G). Como informe anterior, las células Treg que sobreexpresan TIGIT redujeron significativamente el dúo a la actividad ADCC de BiPT-23 (Fig. 5H). Además, también detectamos la frecuencia de otras células inmunitarias positivas para PD-L1, y BiPT-23 no alteró la composición del subconjunto mieloide (Fig. 5C), lo que significa que BiPT-23 eliminó selectivamente las células tumorales PD-L1+, distintas de PD-L1+. células inmunitarias, en consonancia con otro informe28. Las células NK también aumentaron en los grupos Tiragolumab y BiPT-23, aunque no hubo diferencia estadística (Fig. 5D). En 2018, el laboratorio de Zhigang Tian descubrió que el bloqueo de TIGIT revertía el agotamiento de las células NK infiltrantes de tumores, aumentaba la frecuencia de las células NK infiltrantes de tumores que expresaban CD107a, factor de necrosis tumoral, interferón-γ y CD226.

BiPT-23 inhibió el crecimiento tumoral in vivo y aumentó preferentemente las células NK y CTL, disminuyó las células Treg y mantuvo las células inmunitarias CD11b+F4/80+ dentro del TME. (A) La actividad antitumoral de BiPT-23 con tres dosis. (B) Se muestra el análisis de las células mCD45+ como una fracción de células vivas dentro del TME. (C) Se muestra el análisis de las células mCD11b+ F4/80+ como una fracción de las células mCD45+ dentro del TME. (D) Se muestra el análisis de células NK (CD3-NK1.1+) como una fracción de células mCD45+ dentro del TME. (E) Se muestra el análisis de las células T (CD3+) como una fracción de las células mCD45+ dentro del TME. (F) Se muestra el análisis de células CTL (CD4-CD8+) como una fracción de células mCD45+ dentro del TME. (G) Se muestra el análisis de las células T auxiliares (Th) (CD4+CD8-) como una fracción de las células mCD45+ dentro del TME. (H) Se muestra el análisis de las células Treg (CD4+FoxP3+) como una fracción de las células mCD4+ dentro del TME. Los datos se mostraron como media ± SEM y se analizaron mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba de Tukey en comparación con cada grupo. (*p < 0,05, ***p < 0,001).

PD-L1 no se expresa en la mayoría de los tejidos normales, excepto en los macrófagos; sin embargo, su expresión puede ser inducida y mantenida por muchas citoquinas, especialmente interferón-γ30. Se informaron altos niveles de expresión de PD-L1 en muchos tumores humanos30, y durante una respuesta inmune antitumoral activa, PD-L1 podría proporcionar un mecanismo de escape del tumor31. La expresión de PD-L1 es un indicador de mal pronóstico para la supervivencia del paciente32; además, la respuesta de mAb anti-PD-L1 se correlacionó más con la expresión de PD-L1 en células inmunitarias como macrófagos, células dendríticas y células T, distintas de las tumorales celdas33.

Avelumab, un mAb IgG1 humano anti-PD-L1, fue desarrollado y aprobado por la FDA en 2017 para tratar el carcinoma de células de Merkel. El análisis clínico reveló que Avelumab podía lisar líneas celulares de tumor de pulmón humano, como H460 y H441, pero no PBMC autólogas PD-L1-positivas de pacientes con cáncer, incluso el nivel de expresión de PD-L1 era similar al de H46028. Parece que el mAb anti-PD-L1 con Fc competente puede funcionar como bloqueador de puntos de control y asesino específico de células tumorales. Además, según el sitio web oficial de CStone Pharmaceuticals, retuvieron el ADCP de un anticuerpo anti-PD-L1 aprobado (Sugemalimab), para inducir la destrucción tumoral directa por parte de los macrófagos y mejorar la presentación del antígeno tumoral para la inmunidad antitumoral a largo plazo.

En los ensayos clínicos, la mayoría de los mAbs anti-TIGIT utilizaron IgG1-Fc, como Tiragolumab (Roche), Vibostolimab (Merck) y Ociperlimab (BeiGene)34, un mecanismo común fue el agotamiento selectivo de las Treg que sobreexpresan TIGIT dentro del microambiente tumoral20. Más allá de ADCC/ADCP de IgG1-Fc, los investigadores descubrieron que la proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4) y los mAbs TIGIT requerían la participación de CD16a humano en APC para una actividad óptima de las células T. La estimulación de PBMC humanas in vitro reveló que la secreción de IL-2 dependía de la interacción CD16a-hIgG1, y el Fc mutante DLE incluso aumentó la producción de IL-2. Los mAb anti-TIGIT con Fc funcional podrían ayudar a formar la sinapsis inmunitaria de las células T y las APC21.

Una de las preocupaciones en el desarrollo de inhibidores de puntos de control inmunitarios es la citotoxicidad mediada por Fc, debido a la lisis de las células inmunitarias PD-L1+ y TIGIT+. Sin embargo, la Fc funcional también podría proporcionar un MOA adicional de actividad antitumoral.

Aquí, desarrollamos un anticuerpo biespecífico tetravalente dirigido a PD-L1 y TIGIT, armado con un Fc completamente funcional. Aprovechamos VHH para seleccionar el mejor formato de anticuerpo biespecífico y enlazador con capacidad de desarrollo y citotoxicidad óptimas. Encontramos que la asociación de la cadena pesada (HC) y la cadena ligera (LC) se vio significativamente afectada por la ubicación de VHH, cuando el sitio de fusión estaba en la cadena ligera, sin importar qué tan largo fuera el enlazador, 7–17% pesado- producto de cadena única mezclado en los BsAb purificados (Fig. 2I-Q). La capacidad de unión de VHH también sufrió una pérdida en el ensayo de citometría de flujo (datos no mostrados). La región constante de LC separaba la región variable de la cadena ligera (VL) y VHH, el enlazador más largo (GGGGS)3 tiene aproximadamente 5,7 nm23, por lo que no había razón para que VHH se emparejara con VL en cis.

Algunos informes investigaron la relación entre los formatos BsAb y ADCC35. Una vez que los investigadores desarrollaron anticuerpos IGF-1R-EGFR tetravalentes de doble orientación IgG1 basados en IgG y un fragmento variable de cadena única (scFv), encontraron que la fusión de scFv al extremo N de HC o LC conducía a un bajo rendimiento de BsAbs, que no era observado en nuestro BiPT-22–25 (Tabla 1). Además, la unión de scFv al extremo C de HC eliminó por completo la citotoxicidad de los anticuerpos biespecíficos, aunque la afinidad de scFv solo disminuyó 2 veces. En nuestros formatos de orientación HC-VHH, la fusión de VHH a HC no hizo ninguna diferencia en la interacción Fc-FcγR (Fig. 3), y la actividad ADCC se relacionó positivamente con la capacidad de unión de VHH (Fig. 4). Parece que el mejor sitio de fusión para scFv fue el extremo C de LC, para VHH, el extremo N de HC fue la mejor elección en nuestro trabajo.

Hay varias soluciones para estabilizar VHH, incluido el injerto de regiones determinantes de la complementariedad en marcos estables, la introducción de enlaces disulfuro no canónicos, mutagénesis aleatoria seguida de una selección estricta y mutación puntual de cargas negativas o positivas, y fusiones genéticas36,37. Los investigadores alguna vez usaron la cola ácida de la α-sinucleína (ATS) como una fusión con un anticuerpo de un solo dominio (sdAb) que carecía del enlace disulfuro, lo que ayudó a estabilizar el sdAb38, se creía que la reducción del punto isoeléctrico (pI) de los sdAbs podría aumentar su estabilidad39. Sin embargo, en nuestro trabajo, encontramos que la fusión de VHH al HC de YN035 mejoró el rendimiento de unión de VHH después del desafío de calentamiento (Fig. 4), los mismos resultados también se pueden observar en la estabilidad a largo plazo a 40 °C. ensayo (datos no mostrados). Se calculó que el pI de YN035 era 8,54, VHH era 8,34, BiPT era aproximadamente 8,50, VH de YN035 era 9,20 y HC de YN035 era 8,77, la región variable de la cadena pesada (VH) más VL era 8,61, no había ninguna razón para bajar el pI de VHH por IgG. Por el contrario, otros informes revelaron que VHH con carga positiva puede ser más resistente a la agregación37,40, lo que coincidió con nuestro resultado.

In vivo, BiPT-23 suprimió significativamente el crecimiento tumoral al aumentar la infiltración de células T CD8+, células NK y reducir las células TIGIT+ Treg. Curiosamente, BiPT-23 no mostró ninguna disminución en las células CD11b+F4/80+, incluidas las células dendríticas (DC) y los macrófagos. La expresión de PD-L1 por parte de las DC es un regulador clave de la inmunidad de las células T en el cáncer, la señalización de PD-1 puede restringir las respuestas de las células T durante la presentación cruzada de antígenos tumorales por parte de las DC41. Es posible que BiPT-23 no solo funcione como un bloqueo de PD-L1 y TIGIT, sino que también fortaleció la interacción entre las células T que expresan TIGIT y las DC PD-L1+FcRs+. Hasta donde sabemos, BiPT-23 fue el primer anticuerpo biespecífico optimizado para la actividad de ADCC y tenía potencial para el desarrollo clínico.

En el futuro, nuestro anticuerpo biespecífico puede combinarse con citocinas que mejoran la proliferación y la función de NK, como la interleucina-2 y la interleucina-15, para potenciar la ADCC mediada por NK contra las células tumorales recubiertas de anticuerpos y las células T regulares.

La línea de células 293 T se adquirió de American Type Culture Collection (ATCC).

Las PBMC se extrajeron de donantes sanos y de ellos se obtuvo el consentimiento informado.

Este estudio con ratones fue realizado por Biocytogen de acuerdo con las pautas AAALAC. Este estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Biocytogen y en cumplimiento de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Al final del experimento, los animales fueron sacrificados con un exceso de CO2.

Todos los estudios de este documento se llevaron a cabo de conformidad con las directrices ARRIVE.

Crecimiento admitido de EXPI293 a la densidad de 1,6 × 106 células/ml con OPM-293 CD05 Medium (OPM, 12112701), SMM293-TII (SB, RZ14JL0801) y 8 mM Gluta MAX-1 (100x) (gibco, 2085465) , incubado en un agitador orbital de 120 rpm a 37 °C, ≥ 80 % de humedad relativa y 8 % de CO2. Al día siguiente, las células EXPI293 alcanzaron una densidad de 3 × 106 células viables/ml. Usando OPTI-MEM (gibco 2120548) para diluir el ADN del plásmido y 1 mg/ml de PEI (ADN del plásmido:PEI = 1:2), invirtió suavemente el complejo 2 o 3 veces, incubó a temperatura ambiente durante 5 min. Se agregó la PEI diluida al ADN del plásmido diluido, se puso la mezcla a temperatura ambiente durante 20 minutos y luego se transfirió la solución al cultivo celular. Después de 5 días de incubación, centrifugar el cultivo a 8000 g durante 10 min, filtrar el sobrenadante con un filtro de 0,5 μm (cobetter, OES0423).

Se encendió AKTA avant 25(GE), se conectó una columna Mab SelctSure (GE) de 10 ml al sistema, se fijó el caudal a 3 ml/min, se lavó la columna con NaOH 0,5 M y PBS 1x uno tras otro hasta que se alcanzaron las líneas base. plano, luego corrió la muestra a través de la columna. Cuando el sobrenadante de la muestra pasó por el sistema de columna, se lavó la columna con 1x PBS hasta que las líneas de base fueran planas, se usó Gly-HCl 0,1 M, pH 3,0 para eluir la proteína, se neutralizó con Tris-HCl 1 M. Se conectó una columna de desalinización G-25 de 50 ml al sistema, se fijó el caudal en 8 ml/min y se lavó la columna con NaOH 0,2 M y PBS 1x uno tras otro hasta que las líneas de base fueran planas. Proteína recogida, filtración de la colección a través de un filtro de 0,22 μm (Pall, FG1375), concentración determinada mediante el kit de ensayo de proteínas BCA (Thermo, UJ292598).

Encendió la cromatografía líquida de alta resolución (Serie 1200 de Agilent Technologies), Primero usó agua pura MilliQ con un caudal de 2 ml/min para eliminar el aire en la tubería del sistema, conectó el SET-C SEC-300 (Sepax, 2F36102 ) al instrumento después de lavarlo durante 30 min. Luego limpió la columna con agua pura MilliQ a una velocidad de flujo de 0,5 ml/min durante 1 hora y usó PBS a una velocidad de flujo de 1 ml/min durante otra hora. Anticuerpos diluidos a 1 mg/ml, tome 100 μl del marcador y los anticuerpos diluidos en el tubo de muestra respectivamente. Establezca el volumen de carga del marcador en 6 l, la tasa de flujo de 1 ml/min y se ejecutó durante 20 min, luego establezca el volumen de carga del anticuerpo en 10 l, la tasa de flujo de 1 ml/min y se ejecutó durante 20 min.

Después de la digestión y centrifugación de 293 T que expresan TIGIT humano y 293 T que expresan PD-L1 humano, se resuspendieron en PBS que contenía BSA al 0,1 % y se agregaron células 4E4 a una placa de 96 pocillos, 30 μl por pocillo. Diluyó los anticuerpos correspondientes a 200 nM y luego lo diluyó 3 veces en 11 gradientes, sin agregar ningún anticuerpo al último gradiente. Se mezclaron 30 μl de solución de anticuerpos con la suspensión celular y se incubaron a 4 °C durante 1 hora. Se lavaron las células dos veces con PBS que contenía BSA al 0,1 % y se centrifugaron a 500 g cada vez durante 5 min. Se diluyó el anticuerpo secundario IgG Fc-650 antihumano (abcam, número de catálogo: ab98593) con PBS que contenía BSA al 0,1 % a una dilución de 1:200 veces, se agregaron 30 μl a cada pocillo y se incubó a 4 °C durante 30 mín. Se lavaron las células 3 veces con PBS que contenía BSA al 0,1 %. Finalmente, resuspendió las células con 30 μl de PBS que contenían BSA al 0,1 %, leyó los datos con la máquina iQue y usó Graphpad para hacer una curva de ajuste de cuatro parámetros para calcular EC50.

BiPT-22, BiPT-23, BiPT-24, BiPT-25, YN035 y hTIGI7.11E diluidos en 100 nM con PBS respectivamente, luego incubados a 20 °C, 30 °C, 40 °C, 50 °C, 60 °C, 70 °C, 80 °C, 90 °C durante 1 h, se realizó citometría de flujo a una concentración de 25 nM para detectar la capacidad de unión de todos los anticuerpos.

La unión de doble objetivo del BiPT-23 se midió usando BLI en el instrumento OCTET RED384 (Sartorius). 100 nM BiPT-23 fue capturado durante 200 s por el biosensor Anti-Human Fc Capture (AHC) (Sartorius AG). Las concentraciones de unión de PD-L1 y TIGIT fueron 100 nM, con 400 s de fase de asociación y 800 s de fase de disociación, seguidos de 5 s de regeneración en solución de Glicina (pH = 1,5).

Se construyeron 293 líneas de células T que expresan de forma estable TIGIT o PD-L1 humano y luciferasa, y las células diana se contaron, centrifugaron y resuspendieron en un medio "DMEM + 10% FBS", 5000 células por pocillo de células diana. PBMC enjuagada 3 veces con PBS, centrifugación de 500 g durante 5 min, centrifugación de 400 g durante 5 min, centrifugación de 300 g durante 5 min, todas las centrifugaciones se realizaron a temperatura ambiente. Las células efectoras se resuspendieron en medio "DMEM + 10% FBS", 1.75E5 células por pocillo, y la proporción de células efectivas y diana fue de 35:1. Anticuerpos diluidos a la concentración de trabajo inicial: 100 nM, dilución 8 veces, 7 gradientes de concentración, 50 μl/pocillo. Mezcle las células diana, las células efectoras y los anticuerpos en una placa de cultivo celular de 96 pocillos con fondo blanco opaco, al mismo tiempo que se estableció un pocillo separado de la célula diana como control. Después de 48 h de incubación en una incubadora a 37 °C, se detectó el contenido de luciferasa en la placa con un lector Tecan. Porcentaje de lisis (%) = (célula diana pocillo n-anticuerpo pocillo m)/pocillo diana n × 100.

Se implantaron por vía subcutánea 5 × 105 células MC38 resuspendidas en PBS en el flanco derecho de ratones C57BL/6 hembra humanizados con TIGIT. Cuando el volumen tumoral medio alcanzó 100 ± 50 mm3, los ratones se seleccionaron en función del volumen tumoral y el peso corporal. Los ratones calificados se asignaron al azar a 5 grupos experimentales, con 6 ratones en cada grupo. Los ratones se trataron con las proteínas indicadas o IgG1-Fc humana a 10 mg/kg una vez cada 3 días durante un total de 6 veces. Los volúmenes de los tumores se recogieron utilizando el calibrador Vernier, y los volúmenes se calcularon mediante el uso de la fórmula elipsoide modificada ½ m de largo por ancho. Después del experimento, se recolectó el tejido tumoral del ratón para preparar una suspensión unicelular, que se tiñó con LD-eF506 y anticuerpos: anti-mCD16/32, anti-mCD45-APC/Cy7, anti-mCD3ε-PerCP/Cy5.5 , anti-mCD4-PE, anti-mCD8a-BV605, anti-mNK1.1-BV421, anti-m/hCD11b-APC, anti-mF4/80-FITC, anti-m/rFoxp3-PE/Cy7. TGITV(%) = [1 − (Ti − T0)/(Vi − V0)] × 100 % (Ti: volumen tumoral medio del grupo de tratamiento el día i de la administración, T0: volumen tumoral medio del grupo de tratamiento grupo en el día 0 de administración; Vi: el volumen tumoral medio del grupo de control de IgG1-Fc en el día i de administración, V0: el volumen tumoral medio del grupo de control de IgG1-Fc en el día 0 de administración). Los datos se mostraron como Media ± SEM y se analizaron mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba de Tukey en comparación con cada grupo (*p < 0,05, ***p < 0,001).

Todos los datos están contenidos en el artículo.

Anticuerpos biespecíficos

Tasa de respuesta general

Sobrevivencia promedio

Dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo solo de cadena pesada

Ligando de muerte programada 1

Inmunorreceptor de células T con dominios Ig e ITIM

Anticuerpo monoclonal

Linfocitos T citotóxicos

Asesino natural

Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos

Fagocitosis celular dependiente de anticuerpos

Cadena pesada

Cadena de luz

Célula presentadora de antígeno

Célula dendrítica

Microambiente tumoral

Linfocitos infiltrantes de tumores

Células T reguladoras

Ser239Asp/Ala330Leu/Ile332Glu de IgG1-Fc

La mitad de la concentración efectiva máxima

Inmunoglobulina G

Mecanismo de acción

Administración de Drogas y Alimentos de EE. UU.

Célula mononuclear de sangre periférica humana

receptor de poliovirus

Proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos

Punto isoeléctrico

Región variable de la cadena pesada

Región variable de la cadena ligera

Fragmento variable de cadena única

Células dendríticas

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Estos autores contribuyeron por igual: Zhenwei Zhong, Mengyao Zhang, Yanan Ning y Guanchao Mao.

Departamento de I+D, Oricell Therapeutics, Origincell Industrial Park, No. 1227 Zhangheng Road, Pudong New District, Shanghái, 201203, China

Zhenwei Zhong, Yanan Ning, Xiaopei Li, Qi Deng, Xiaorui Chen, Dongliang Zuo, Xiangyu Zhao, Ermin Xie, Huajing Wang, Lina Guo y Xiaowen He

Escuela de Graduados de la Universidad de Medicina Tradicional China de Shanghái, Universidad de Medicina y Ciencias de la Salud de Shanghái, Shanghái, 201203, China

Mengyao Zhang y Bohua Li

Departamento de Medicina Protectora contra Agentes Químicos, Facultad de Medicina Naval, Universidad Médica Naval, Shanghái, 200433, China

Guanchao Mao y Kai Xiao

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ZZ y XH conceptualizaron este estudio, interpretaron los resultados y redactaron el manuscrito. ZZ, MZ, YN, GM, XL, QD, XC, DZ, XZ y EX realizaron experimentos. Figuras preparadas por ZZ y HW. XH supervisó el estudio. Todos los autores comentaron el manuscrito.

Correspondencia a Zhenwei Zhong o Xiaowen He.

Zhenwei Zhong, Yanan Ning, Qi Deng, Xiaorui Chen, Dongliang Zuo, Ermin Xie, Huajing Wang, Lina Guo y Xiaowen He son empleados actuales de Oricell Therapeutics, que desarrolla y comercializa terapias de anticuerpos y CAR-T.

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Reimpresiones y permisos

Zhong, Z., Zhang, M., Ning, Y. et al. Desarrollo de un anticuerpo biespecífico dirigido a PD-L1 y TIGIT con citotoxicidad óptima. Informe científico 12, 18011 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-22975-7

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Recibido: 19 julio 2022

Aceptado: 21 de octubre de 2022

Publicado: 26 de octubre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-22975-7

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