metagenómica

Nature Microbiology volumen 8, páginas 1108–1122 (2023) Citar este artículo

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Los morbillivirus se encuentran entre los patógenos virales más contagiosos de los mamíferos. Aunque estudios metagenómicos anteriores han identificado secuencias de morbillivirus en murciélagos, los morbillivirus completos de murciélagos son limitados. Aquí caracterizamos el morbillivirus de murciélago myotis (MBaMV) de un programa de vigilancia de murciélagos en Brasil, cuyo genoma completo se publicó recientemente. Demostramos que la fusión y la proteína de unión al receptor de MBaMV utilizan CD150 de murciélago y no CD150 humano, como receptor de entrada en una línea celular de mamífero. Usando genética inversa, producimos un clon de MBaMV que infectaba células Vero que expresaban CD150 de murciélago. La microscopía electrónica de las células infectadas con MBaMV reveló la gemación de viriones pleomórficos, un rasgo característico del morbillivirus. La replicación de MBaMV alcanzó 103-105 unidades formadoras de placas ml-1 en líneas de células epiteliales humanas y dependía de nectina-4. También se produjo la infección de macrófagos humanos, aunque de 2 a 10 veces menos eficiente que el virus del sarampión. Es importante destacar que MBaMV está restringido por la neutralización cruzada de sueros humanos provocados por la vacuna contra el sarampión, las paperas y la rubéola y es inhibido por inhibidores de polimerasa biodisponibles por vía oral in vitro. Los genes P/V codificados por MBaMV no antagonizaron la inducción de interferón humano. Finalmente, mostramos que MBaMV no causa enfermedad en murciélagos frugívoros de Jamaica. Llegamos a la conclusión de que, si bien el desbordamiento zoonótico en humanos puede ser teóricamente plausible, la replicación de MBaMV probablemente estaría controlada por el sistema inmunitario humano.

Los murciélagos son huéspedes reservorio importantes para muchos virus con potencial zoonótico1. El coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo, el virus del Ébola y el virus Nipah son ejemplos de virus que han causado epidemias y pandemias mortales cuando los murciélagos se propagaron a las poblaciones humanas y animales2,3. La vigilancia cuidadosa de los virus en los murciélagos es fundamental para identificar posibles patógenos zoonóticos. Sin embargo, las encuestas metagenómicas en murciélagos a menudo no dan como resultado secuencias virales completas que puedan usarse para regenerar dichos virus para una caracterización específica4, al menos no sin mucho esfuerzo adicional, como la amplificación rápida 3 'y 5' de los extremos complementarios del ADN. Las mejoras en las tecnologías de secuenciación y la bioinformática han permitido ensamblajes de genomas más completos. Tres estudios metagenómicos publicados el año pasado confirman que los murciélagos, y en menor medida las musarañas y los roedores, son huéspedes de diversos paramixovirus5,6,7 que comprenden múltiples géneros (Jeilongvirus, Morbillivirus y Henipavirus). Las secuencias metagenómicas, por completas que sean, en la actualidad no pueden proporcionar información suficientemente precisa sobre los fenotipos virales in vitro e in vivo. Todavía se necesitan investigaciones virológicas detalladas para cosificar los descubrimientos taxonómicos.

Los morbillivirus se encuentran entre los patógenos virales más contagiosos que infectan a los mamíferos. Aunque se han identificado numerosas secuencias parciales de morbillivirus en murciélagos y roedores4,5 en estudios metagenómicos, no se ha aislado ni caracterizado ningún morbillivirus auténtico de longitud completa a partir de huéspedes quirópteros. El género morbillivirus incluye el virus del sarampión (MeV), el virus del moquillo canino (CDV), el virus de la peste bovina, el virus del moquillo focino, el morbillivirus de los cetáceos, el virus de la peste de pequeños rumiantes y el morbillivirus felino8. Recientemente se describió que un morbillivirus porcino es la causa putativa de muerte fetal y encefalitis en cerdos9. Todos los morbillivirus causan enfermedades graves en sus huéspedes naturales10,11,12,13,14, y la patogenicidad está determinada en gran medida por la expresión específica de especie de los receptores canónicos de morbillivirus, codificados por CD150/SLAMF1 (ref. 15) y NECTIN4 (ref. 16) .

En este artículo, caracterizamos el morbillivirus del murciélago myotis (MBaMV) de una especie de murciélago vespertiliónido (Myotis riparius) en Brasil, identificado previamente solo a partir de la información de la secuencia. MBaMV usó Myotis spp. CD150 mucho mejor que CD150 humano y de perro en ensayos de fusión. Confirmamos esto usando MBaMV vivo que fue rescatado por genética inversa. Sorprendentemente, MBaMV se replicó en células mieloides primarias humanas pero no en células linfoides y lo hizo de manera independiente de CD150. Esto contrasta con MeV, que se sabe que infecta células mieloides y linfoides humanas CD150+. Además, MBaMV se replicó en células epiteliales humanas y usó nectina-4 humana casi tan bien como MeV. No obstante, MBaMV P/V no parece antagonizar las vías de inducción y señalización del interferón humano (IFN), y MBaMV fue neutralizado de forma cruzada, aunque en grados variables, por los sueros vacunados contra el sarampión, las paperas y la rubéola (MMR). Nuestros resultados demuestran la capacidad de MBaMV para infectar y replicarse en algunas células humanas que son críticas para la patogénesis y transmisión de MeV. Sin embargo, la evaluación integral de las características virales proporciona datos para una evaluación adecuada de su potencial zoonótico.

Durante un estudio genómico metagenómico de virus en murciélagos, identificamos una secuencia completa de morbillivirus de un murciélago miotis ribereño (M. riparius) en Brasil7. En total, se muestrearon 46 individuos de la especie M. riparius. De estos, 9 fueron muestreados de la región amazónica y 37 fueron muestreados del Bosque Atlántico en el sur de Brasil. El hisopado rectal de un individuo de la región amazónica resultó positivo para el virus PDF-31377. Este MBaMV tenía una longitud de genoma de 15.720 nucleótidos de acuerdo con la regla de 6 y estaba compuesto por 6 unidades transcripcionales que codifican los marcos de lectura abiertos (ORF) canónicos de proteína nucleo (N), proteína fosfo (P), proteína de matriz (M), proteína de fusión (F), proteína de unión al receptor (RBP) y proteína grande (L) (Datos ampliados Fig. 1a). Los tamaños de estos ORF son comparables a sus contrapartes en los otros morbillivirus (Tabla 1 de datos ampliados). El análisis filogenético utilizando la secuencia de proteína L de longitud completa indicó que MBaMV está más estrechamente relacionado con CDV y el virus del moquillo focino (Datos extendidos Fig. 1b y Datos extendidos Tabla 2).

Las proteínas de paramixovirus con las interacciones más frecuentes y directas con las proteínas del hospedador, como la P y sus productos genéticos accesorios (V y C), así como la RBP, tienden a exhibir la mayor diversidad17. Los morbillivirus P, V y C antagonizan las respuestas inmunitarias innatas específicas del huésped, mientras que su RBP interactúa con los receptores específicos del huésped. El hecho de que estas proteínas estén bajo presión evolutiva para interactuar con diferentes proteínas del huésped se refleja en la menor conservación de MBaMV P/V/C (31–43 %) y RBP (27–32 %) con otros homólogos de morbillivirus. Esto contrasta con la conservación relativamente alta (52–76 %) de las proteínas MBaMV N, M, F y L con sus respectivas contrapartes de morbillivirus (Datos extendidos Fig. 2).

El uso de CD150/SLAMF1 para ingresar a las células mieloides y linfoides es un sello distintivo de los morbilivirus y también un determinante importante de la patogenicidad. CD150 es muy divergente entre las especies y explica el tropismo restringido por especie de la mayoría de los morbillivirus18. Por lo tanto, primero caracterizamos el tropismo del receptor específico de especie de MBaMV. Realizamos un ensayo de fusión cuantitativo basado en imágenes mediante la cotransfección de vectores de expresión que codifican MBaMV-F y MBaMV-RBP, junto con CD150 de la especie indicada en células de ovario de hámster chino (CHO) con receptor negativo. MeV-RBP y F formaron más sincitios en células CHO tras la cotransfección de CD150 humano (hCD150) en comparación con CD150 de perro (dCD150) o CD150 de murciélago (bCD150) (Fig. 1a, fila superior). Por el contrario, MBaMV-RBP y F formaron sincitios más grandes y numerosos tras la sobreexpresión de bCD150 que hCD150 o dCD150 (Fig. 1a, fila central). CDV-RBP y F formaron sincitios extensos con dCD150 y bCD150, y sincitios moderados con hCD150 e incluso células transfectadas de forma simulada (Fig. 1a, fila inferior), lo que sugiere un grado de promiscuidad. Cuantificamos estos resultados diferenciales de formación de sincitios en un citómetro de imagen como se describe 19 (Fig. 1b).

a, Formación de sincitios en células CHO cotransfectadas con las glicoproteínas de la cubierta del morbillivirus indicadas, CD150 específico de especie y Life-act-GFP. Las imágenes fueron tomadas por el citómetro de imágenes Celigo (Nexcelom) a las 48 h después de la transfección (hpt) y son compuestos computacionales de un número idéntico de campos en cada pocillo. Barras de escala, 200 µm. Los ajustes de brillo y contraste eran idénticos. b, Cuantificación de la formación de sincitios en a. Los datos son la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. Los valores de P ajustados indicados son de ANOVA unidireccional ordinario con la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. c, el ensayo de entrada de pseudopartículas (pp) de VSV mostró tendencias similares. Valores de P ajustados obtenidos como en b pero solo para comparar grupos en el inóculo viral más alto utilizado (dilución recíproca 10−1) en tres experimentos biológicamente independientes (media ± sd).

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También evaluamos el uso del receptor de MBaMV en un ensayo de entrada de pseudotipo del virus de la estomatitis vesicular (VSV). VSV-DG[Rluc] que lleva MeV-RBP y F ingresó a las células CHO transfectadas con hCD150 mejor que las células transfectadas con dCD150, bCD150 o simuladas (Fig. 1c) como se esperaba. Los pseudotipos de MBaMV entraron solo en células CHO transfectadas con bCD150. Los pseudotipos de CDV mostraron una buena entrada en células CHO transfectadas con dCD150 y bCD150 pero no en células CHO transfectadas con hCD150. Estos resultados son generalmente consistentes con los resultados de nuestro ensayo de fusión y respaldan la especificidad de especie de los morbillivirus. El CDV tiene una alta propensión a cruzar las barreras entre especies y puede causar enfermedades en múltiples familias de carnívoros, como los grandes felinos (por ejemplo, leones y tigres), las hiénidas (por ejemplo, las hienas manchadas), los ailuridos (por ejemplo, los pandas rojos), los úrsidos ( por ejemplo, osos negros), prociónidos (por ejemplo, mapaches), mustélidos (por ejemplo, hurones), vivérridos (por ejemplo, civetas) e incluso especies no carnívoras como javalinas (pecaríes) y roedores (marmotas asiáticas)20. El CDV también ha estado implicado en múltiples brotes en primates no humanos (varias especies de Macaca)21,22,23. La capacidad de CDV para usar bCD150 y dCD150 con igual eficiencia sugiere un potencial para una transmisión eficiente de carnívoros a algunas especies de quirópteros si otros factores posteriores a la entrada no presentan restricciones adicionales.

A continuación, intentamos generar un clon de ADNc genómico de MBaMV que pudiéramos rescatar mediante genética inversa. Sintetizamos y ensamblamos el supuesto genoma de MBaMV en fragmentos cada vez más grandes. Se introdujeron dos mutaciones silenciosas en el N-terminal de 1,5 kb del gen L para interrumpir un ORF críptico en la hebra negativa (Datos extendidos, Fig. 3) que inicialmente impidió la clonación de todo el genoma de MBaMV. Introdujimos una unidad de transcripción EGFP adicional en el extremo 3 'y rescatamos este genoma MBaMV-GFP utilizando el plásmido accesorio N, P y L de MeV (Datos extendidos Fig. 1a). MBaMV-GFP se rescató inicialmente en células BSR-T7, pero se pasó, amplificó y tituló en células Vero-bCD150 (Datos extendidos, Fig. 4a). MBaMV formó sincitios positivos para GFP que contenían cientos de núcleos a los 3 días posteriores a la infección (dpi) (Fig. 2a) y placas relativamente homogéneas a los 7 dpi (Fig. 2b). La microscopía electrónica de transmisión (TEM) (Fig. 2c) capturó numerosos viriones pleiomórficos (~ 100–200 nm) asociados o en ciernes de células Vero-bCD150. Algunas parecen ser partículas filamentosas que emergen de una célula. A gran aumento, los viriones se delinearon mediante protuberancias que sugerían glicoproteínas de superficie. Se pueden encontrar estructuras similares a ribonucleoproteínas en el interior del virión que se muestra. Estas observaciones son consistentes con hallazgos previos de MeV24.

a, Formación de sincitios en células Vero-bCD150 inducida por MBaMV 3 dpi Las células formaron sincitios que involucran >100 núcleos tras la infección (campo brillante), que está claramente delineado por GFP expresado por virus (derecha). Barras de escala, 500 µm. Este experimento se realizó tres veces y se muestran imágenes representativas. b, formación de placas de MBaMV en células Vero-bCD150. Las células se infectaron con solución madre de virus diluida diez veces en serie, se incubaron con DMEM que contenía metilcelulosa y se tiñeron con cristal violeta y rojo neutro 7 dpi. El diámetro del pocillo es de 22 mm. Uno de los pocillos se amplía para mostrar la morfología de la placa en detalle. c, imágenes TEM del virión MBaMV en la superficie de las células Vero-bCD150 a 3 ppp Numerosos viriones envueltos brotan de la membrana plasmática o están asociados con ella (izquierda). También se pueden ver partículas filamentosas (asteriscos). La imagen ampliada (derecha) muestra el virión y el complejo ribonucleoproteico (RNP). Estas imágenes son de un experimento independiente.

Para comprender qué tan bien el CD150 de varios huéspedes admite la replicación de MBaMV, probamos el crecimiento de MBaMV en células Vero-CCL81 parentales y derivados isogénicos que expresan constitutivamente CD150 de humanos, perros o murciélagos. MBaMV formó enormes sincitios (Fig. 3a) a 2 dpi en células Vero-bCD150 y alcanzó títulos máximos de ~ 105 PFU ml-1 a ​​3 dpi (Fig. 3b). MBaMV mostró una propagación y crecimiento de sincitios moderados en células Vero-dCD150, pero los títulos máximos a 5 dpi fueron ~ 100 veces más bajos. No se detectó crecimiento de virus notable en células Vero o Vero-hCD150. Estos resultados confirman que MBaMV puede usar bCD150 pero no hCD150 para la replicación y entrada celular eficiente. MBaMV parece usar dCD150, aunque en mucha menor medida que bCD150.

Se infectaron células a,b, Vero-hCD150, Vero-dCD150, Vero-bCD150 y Vero con rMBaMV-EGFP (MOI 0,01). La replicación y la propagación del virus se controlaron mediante citometría de imágenes (a) y el título del virus en el sobrenadante (b). En a, se evidenciaron grandes sincitios en células Vero-bCD150 a 2 ppp. En b, se recogió el sobrenadante todos los días y se determinó el título de virus mediante un ensayo de placa de GFP (Métodos). Los datos que se muestran son la media ± desviación estándar de experimentos por triplicado. c–e, las células H441 y A549 se infectaron con rMBaMV-EGFP a un MOI bajo (0,01) o alto (0,5), con replicación y propagación del virus monitoreadas como en a y b: células H441 y A549 infectadas en 1, 2 y 5 ppp (D1, D2 y D5) (c); curvas de crecimiento de virus representadas por títulos diarios en las condiciones indicadas, donde los datos mostrados son títulos medios ± sd de infecciones por triplicado (d); el área empírica bajo la curva (eAUC) se obtuvo de cada curva de crecimiento y se trazó como un gráfico de barras de tres experimentos independientes (media ± sd) (PRISM v 9.0) (e). Las barras punteadas representan las curvas de crecimiento realizadas a un MOI de 0,1 y las barras llenas a un MOI de 0,5. Se indican los valores de P ajustados (prueba de comparación múltiple T3 de ANOVA de Dunnett unidireccional). f, g, células Vero-nectin-4 humanas (Vero-hN4) se infectaron con MBaMV y MeV (MOI 0,01): MBaMV infectó Vero-hN4 en D1, D2 y D4 (f); títulos de virus replicativos para MBaMV y MeV en células Vero-hN4 durante 5 días (media ± sd, n = 3) (g). Las barras de escala en a, c y f equivalen a 1 mm. Todas las imágenes mostradas son capturadas por un citómetro de imágenes Celigo (Nexcelom). Las imágenes son compuestos computacionales de un número idéntico de campos en cada pocillo. El límite de detección para la determinación del título del virus es de 20 UFP ml−1 y se indica mediante la línea de puntos en b, d y g.

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MeV utiliza nectina-4 humana como receptor de células epiteliales25,26, que media en la eliminación eficiente del virus del huésped afectado16,27. CDV también usa nectina-4 humana de manera eficiente para la entrada y el crecimiento23. Para probar si MBaMV puede usar nectina-4 humana en un contexto de células epiteliales, evaluamos la cinética de replicación de MBaMV en células epiteliales de pulmón humano que expresan niveles altos (H441) o bajos (A549) de nectina-4 (refs. 16,28). ) (Datos ampliados Fig. 4b). Sorprendentemente, MBaMV mostró una propagación eficiente del virus (Fig. 3c) en células H441 y alcanzó 104 UFP ml−1 a los 6 ppp (Fig. 3d). Por el contrario, MBaMV mostró pequeños focos de GFP y un título diez veces menor en las células A549. La comparación del área bajo la curva (AUC) reveló diferencias significativas en esta métrica de la curva de crecimiento (Fig. 3e). Sin embargo, MeV todavía se replicó a títulos más altos que MBaMV en células H441 (Fig. 3d-e). Esto podría deberse a factores del huésped específicos de la especie o diferencias en el antagonismo de IFN entre los morbillivirus humanos y de murciélago. Por lo tanto, probamos el crecimiento de MBaMV frente a MeV en células Vero-nectin-4 humanas defectuosas con IFN (Vero-hN4). MBaMV y MeV se replicaron y propagaron igualmente bien en las células Vero-hN4 (Fig. 3f, g), validando la capacidad de MBaMV para usar nectina-4 humana y sugiriendo que es posible que MBaMV no pueda contrarrestar las respuestas inmunitarias innatas humanas.

Para comprender mejor el perfil transcripcional de MBaMV, utilizamos la secuenciación directa de ARN de lectura larga de Nanopore para secuenciar los ARN mensajeros de células Vero-bCD150 infectadas con MBaMV a 2 ppp (multiplicidad de infección (MOI) 0,01). Encontramos un gradiente transcripcional característico de 3′–5′ donde GFP> N> P> M> F> RBP> L (Datos extendidos Fig. 5a). Los morbillivirus tienen un motivo intergénico conservado (CUU) entre el final del gen y el inicio del gen de los genes adyacentes 'AAAA-CUU-AGG'. Este motivo intergénico no fue inmediatamente evidente en la región intergénica MF de complejo largo del genoma MBaMV ensamblado. Sin embargo, la alta cobertura de esta región intergénica de MF (transcripciones de lectura completa de M) identificó el motivo intergénico de MF como 'CGU' en lugar de 'CUU' (Datos extendidos Fig. 5b).

Se sabe que el gen P de los morbillivirus genera los genes V o W mediante la inserción de una o dos guaninas, respectivamente, en el motivo de edición conservado (AAAAGGG)29, que está presente en MBaMV. La secuenciación de amplicón del motivo de edición del gen P, del mismo grupo de ARNm utilizado anteriormente, reveló que la frecuencia de los ARNm de P, V y W es del 42,1 %, 51,2 % y 2,6 %, respectivamente (Datos ampliados, Fig. 5c), lo que sugiere que la principal Se produce antagonista de IFN (V). Este ratio de edición P es similar al encontrado en estudios previos30.

A continuación, evaluamos la expresión y la escisión de dos glicoproteínas de superficie (RBP y F). La construcción F marcada con AU-1 C-terminal mostró F0 no escindido y F1 escindido (Datos extendidos Fig. 5d). La construcción RBP etiquetada con HA C-terminal mostró monómero además de oligómeros (Datos extendidos Fig. 5e). MBaMV-RBP mostró frotis por encima de 110 kDa, lo que sugiere oligomerización. Esta oligomerización también se observó con MeV-RBP pero no con CDV RBP, lo que sugiere una estabilidad diferencial en las condiciones subreductoras utilizadas.

Los dos subórdenes de quirópteros (murciélagos), Pteropodiformes (Yinpterochioptera) y Vespertilioniformes (Yangochiroptera), incluyen más de 1.400 especies agrupadas en 6 y 14 familias, respectivamente31. Los murciélagos Myotis pertenecen a la familia prototípica Vespertilionidae que es homónima de su suborden. Los murciélagos frugívoros de Jamaica (Artibeus jamaicensis) pertenecen al mismo suborden que los murciélagos myotis, aunque de una familia diferente (Phyllostomidae). Inoculamos seis murciélagos frugívoros de Jamaica disponibles en una colonia cautiva a través de dos rutas diferentes con MBaMV para evaluar su patogenicidad in vivo. Todos los murciélagos permanecieron asintomáticos y no mostraron evidencia de desarrollar enfermedad sistémica hasta 3 semanas después de la infección. Tampoco pudimos detectar ninguna evidencia molecular o serológica de infección productiva (Datos ampliados Fig. 6). La inspección de las secuencias CD150 de murciélagos frugívoros y miotis de Jamaica reveló diferencias clave en las superficies de contacto predichas con RBP (discutidas a continuación), que especulamos que son responsables de la restricción específica de especie observada en nuestro desafío experimental de murciélagos frugívoros de Jamaica con MBaMV.

Para identificar las interacciones RBP-CD150 probablemente involucradas en la determinación del tropismo de la especie huésped, comparamos las secuencias de aminoácidos en las supuestas superficies de contacto de las RBP de morbillivirus y sus receptores CD150 afines. Usando PDBePISA32, identificamos tres regiones clave en MeV-RBP (residuos 188-198, 498-507 y 524-556, Datos extendidos Fig. 7a-c) que ocluyen dos regiones en CD150 (residuos 60-92 y 119-131 de humano CD150, datos extendidos Fig. 8) en la estructura cristalina de MeV-RBP unido a CD150 (ID del banco de datos de proteínas (PDB): 3ALW)33. La alineación de regiones clave en las prácticas comerciales restrictivas de morbillivirus implicadas en las interacciones de CD150 revela diferencias específicas de virus que sugieren la adaptación de las prácticas comerciales restrictivas de morbillivirus a los receptores CD150 de su huésped natural. En particular, MBaMV carece del motivo DxD en los residuos 501–503 (505–507 en MeV) que está presente en todos los morbillivirus excepto FeMV (Datos extendidos Fig. 7). Estos residuos forman múltiples puentes salinos y enlaces de hidrógeno que estabilizan las interacciones MeV-RBP y hCD150. Su conservación sugiere que desempeñan funciones similares para otros morbillivirus. En el lado de CD150 (Datos extendidos Fig. 8), los residuos 70–76 y 119–126 son los más variables entre las especies huésped. Curiosamente, el murciélago de la fruta de Jamaica y Myotis CD150 difieren considerablemente en estas regiones, lo que proporciona una razón fundamental para la infección no productiva que vimos en nuestros experimentos de desafío con el murciélago de la fruta de Jamaica.

Los macrófagos alveolares y las células T y B activadas que expresan CD150 son los objetivos iniciales para la entrada de MeV y la propagación sistémica. Para evaluar mejor el potencial zoonótico de MBaMV, comparamos qué tan bien los morbillivirus humanos y de murciélago pueden infectar macrófagos derivados de monocitos humanos (MDM) y células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Tanto los MDM infectados con MeV como con MBaMV eran claramente GFP+ 24 horas después de la infección (hpi) (Fig. 4a), pero la infección fue variable entre donantes e incluso entre diferentes stocks virales en el mismo donante (Fig. 4b, d). Sin embargo, la infección por MeV de MDM fue inhibida por sCD150 mientras que la infección por MBaMV no lo fue (Fig. 4c). Los MDM tenían una expresión variable de CD150 (10-30 % de CD150+) y ninguna expresión de nectina-4 (Datos ampliados, Fig. 4c), pero la infección por morbillivirus no parecía estar correlacionada con la expresión de CD150 (Fig. 4d). Por el contrario, cuando las PBMC se estimularon con concanavalina-A e IL-2, solo MeV infectó fuertemente estas células (Fig. 4e).

a,b, los MDM se infectaron con MV323-EGFP o MBaMV (1 × 105 UI por muestra) y se fijaron con PFA al 2 % a las 24 hpi, se tiñeron con DAPI y se obtuvieron imágenes (barras de escala, 200 µm) (a) o se cuantificaron mediante citometría de flujo (b). Se muestra el porcentaje de MDM CD68+ GFP+ de seis donantes. Los símbolos abiertos y cruzados indican experimentos que utilizan virus de lote 1 y lote 2, respectivamente. Los valores de P ajustados son de ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. c, CD150 humano soluble (sCD150) o una etiqueta Avi de CD150 inhibía la infección de macrófagos por MeV pero no por MBaMV. Los eventos de GFP+ en los controles no tratados se establecieron al 100 %, y la entrada bajo sCD150/CD150 Avi-tag se normalizó a los controles no tratados. Los valores de P ajustados son de ANOVA de dos vías con la prueba de comparaciones múltiples de Šídák. En b y c, los datos que se muestran son la media ± desviación estándar de varios experimentos (n = 7 y n = 5, respectivamente) y también se muestran los valores individuales. d, Gráficos FACS ejemplares de los datos de resumen que se muestran en b para la tinción de CD150. e, las PBMC estimuladas con ConA/IL-2 se infectaron con MeV o MBaMV (MOI de 0,1) y se analizaron para determinar la expresión de GFP mediante citometría de flujo a las 24 hpi

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Los anticuerpos específicos de MeV resultantes de la vacunación pueden proporcionar protección cruzada contra la infección por CDV34. Para evaluar si los sueros humanos de individuos vacunados con MeV podrían contener anticuerpos de neutralización cruzada contra MBaMV, agrupamos sueros humanos reactivos con MMR y medimos su capacidad para neutralizar MeV, MBaMV y CDV en células Vero que expresan hCD150, bCD150 y dCD150. Los sueros humanos neutralizaron eficazmente la infección por MeV y MBaMV y, en menor medida, la infección por CDV (Fig. 5a, izquierda y centro). Por el contrario, los sueros de hurones infectados con CDV neutralizaron la infección por CDV mucho mejor que MeV o MBaMV (Fig. 5a, derecha). Los sueros de los grupos 1 y 2 de MMR tenían una concentración inhibitoria del 50% (IC50) más alta para MeV y MBaMV que para CDV, mientras que los sueros específicos de CDV tenían una IC50 significativamente más alta para CDV que para MeV o MBaMV (Fig. 5b). Estos resultados indican que los sueros humanos contienen anticuerpos de neutralización cruzada para MBaMV.

a, MeV, MBaMV y CDV se incubaron con diluciones en serie de sueros humanos agrupados de individuos vacunados con MMR (grupo 1 y grupo 2 de MMR) y sueros de hurones infectados con CDV. La capacidad del virus tratado con sueros para infectar células Vero que expresan el receptor apropiado se midió mediante imágenes de células infectadas 20 hpi, midiendo el área de las células GFP+ y calculando la reducción de la infección en comparación con los controles sin sueros. Se trazaron las curvas de neutralización para cada virus y grupo de sueros correspondiente. b, la IC50 de las curvas de neutralización que se muestran en a se generaron para cada réplica utilizando un modelo de ajuste robusto y se trazaron. Se completaron dos experimentos independientes con la neutralización de sueros humanos agrupados, y se completó un experimento con duplicados técnicos usando los sueros CDV (media ± sd). Los valores de P se calcularon con un ANOVA unidireccional utilizando la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. NS, no significativo.

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Las proteínas P y V de MeV interfieren con el sistema inmunitario innato al interrumpir la vía del IFN. Nuestros resultados de secuenciación mostraron que la infección por MBaMV produjo las transcripciones P y V (Datos extendidos, Fig. 5c), por lo que buscamos determinar si las proteínas MBaMV P y V podrían antagonizar la vía del IFN humano. Descubrimos que las células transfectadas con MBaMV P o V y tratadas con IFN no bloquearon la inducción del elemento de respuesta estimuladora de interferón (ISRE), a diferencia de ZIKV NS5, que contrarresta efectivamente el ISRE (datos extendidos Fig. 9a). Además, las células transfectadas con MBaMV P o V no bloquearon la inducción de IFN cuando se trataron con RIG-I, MDA5 o MAVS (datos extendidos, Fig. 9b-d). Estos datos demuestran que las proteínas MBaMV P y V no pueden antagonizar la ruta del IFN humano.

Los posibles tratamientos farmacológicos son un problema crítico para los virus emergentes. Por lo tanto, probamos si MBaMV es susceptible a los medicamentos actualmente disponibles. Hemos desarrollado dos compuestos pequeños biodisponibles por vía oral dirigidos a la proteína L de los morbillivirus, GHP-88309 (ref. 35) y ERDRP-0519 (ref. 36). Las diferencias entre MeV y MBaMV en los cinco dominios funcionales de la proteína L se muestran esquemáticamente en la Fig. 6a37. El modelo in silico (Fig. 6b) predice que ambos fármacos deberían unirse de manera similar a la proteína L de MeV y MBaMV. Una inspección más cercana del bolsillo de unión de ERDRP-0519 (Fig. 6c) muestra 1155–1158 residuos de YGLE y H1288 que interactúan con ERDRP-0519. Estos residuos interactúan directamente con ERDRP-0519 en MeV L38. El modelado del bolsillo de unión de GHP-88309 (Fig. 6d) revela la participación de los residuos E863, S869, Y942, I1009 y Y1105, que se informaron previamente como mutantes de escape de GHP-88309 en MeV35. Como se predijo, ambos fármacos inhibieron el crecimiento de MBaMV de manera dependiente de la dosis (Figs. 6e, f). Aunque la mitad de la concentración efectiva máxima (CE50) de GHP-88309 es menor para MeV que para MBaMV (0,6 µM y 3,0 µM, respectivamente), GHP-88309 alcanza una concentración plasmática de >30 µM en modelos animales, lo que indica que este fármaco podría ser un inhibidor eficaz de MBaMV in vivo.

a, esquema 2D de la proteína MBaMV L que muestra el diseño de cada dominio. Se muestra la conservación entre la proteína MeV y MBaMV L. Las diferencias entre las proteínas MeV y MBaMV L se muestran como líneas grises. b, Se generó un modelo de homología 3D de la proteína MBaMV L utilizando las coordenadas estructurales de la proteína PIV5 L (PDB ID: 6V86). La ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRP), la protección, el conector, la metiltransferasa (Mtase) y los dominios C-terminales (CTD) son de color azul, verde, amarillo, naranja y rosa, respectivamente. Las ubicaciones de las poses de acoplamiento in silico con la puntuación más alta para ERDRP-0519 y GHP-88309 están encuadradas, y los compuestos se muestran como barras rojas. c, La pose de acoplamiento con la puntuación más alta de ERDRP-0519 en el modelo de homología de la proteína MBaMV L (barras rojas). Se muestra una superposición de la pose de acoplamiento previamente identificada de ERDRP-0519 en un modelo de homología de la proteína MeV L (barras amarillas)38. Los residuos identificados en experimentos previos de entrecruzamiento por fotoafinidad (Y1155, G1156, L1157 y E1158) y H1288 del motivo HR se muestran como barras magenta. d, La pose de acoplamiento con la puntuación más alta de GHP-88309 en el modelo de homología de la proteína MBaMV L (barras rojas). Se muestra una superposición de la pose de acoplamiento previamente identificada de GHP-88309 en un modelo de homología de la proteína MeV L (barras amarillas)35. Los residuos identificados en los estudios de perfiles de resistencia MeV se muestran como barras magenta. e, Las curvas de crecimiento de inhibición dosis-respuesta de ERDRP-0519 contra MBaMV. Las células Vero-bCD150 se infectaron con MBaMV a una MOI de 0,01 durante 1 h, luego el inóculo se reemplazó por medio nuevo que contenía inhibidor en las concentraciones indicadas (0–50 µM). 2 dpi, se recogieron los sobrenadantes virales y se titularon en células Vero-bCD150 como se describe en Métodos. Los puntos representan los valores de tres experimentos independientes. La curva de regresión (línea continua) y el intervalo de confianza (IC) del 95 % (línea de puntos) se generaron en PRISM (v.8.0). f, La respuesta farmacológica de GHP-88309 contra el crecimiento de MBaMV. La inhibición del virus se realizó de forma idéntica a la de ERDRP0519.

Datos fuente

Los estudios de vigilancia viral metagenómica con la ayuda de la secuenciación de próxima generación (NGS) han permitido a los científicos monitorear los virus que circulan en especies animales e identificar posibles amenazas zoonóticas5,6,7,39. La vigilancia de las especies de murciélagos ha sido particularmente crítica. Por ejemplo, se identificaron más de 60 nuevas secuencias de paramixovirus en un estudio de vigilancia de murciélagos de 2012, varias de las cuales se asignaron al género Morbillivirus4. Estudios metagenómicos recientes confirman que los murciélagos albergan diversos ortoparamixovirus5,6,7. Si bien la comparación de secuencias de virus nuevos con patógenos conocidos puede ayudar a informar los riesgos asociados con futuros eventos de contagio, este tipo de modelado in silico basado en secuencias virales también debe complementarse con la caracterización funcional de dichos virus. En un estudio anterior, identificamos una secuencia genómica completa de morbillivirus de murciélagos M. riparius en Brasil7. Aquí generamos un clon infeccioso de este virus usando genética inversa. Además, no se detectó ningún virus recombinante durante los experimentos de secuenciación. Con este enfoque, sorteamos el arduo proceso de aislar y cultivar virus vivos directamente de animales y, en su lugar, producimos MBaMV en el laboratorio.

Antes de este estudio, solo había siete especies de morbillivirus reconocidas por el Comité Internacional de Taxonomía de Virus, ninguna de las cuales fue aislada de murciélagos. Si bien el genoma de MBaMV anotado se alineó con la organización clásica del genoma de morbillivirus (N, P/V/C, M, F, RBP y L), era importante verificar que el virus generado por genética inversa recapituló con éxito la biología de morbillivirus. Los ensayos de fusión y los experimentos de entrada confirmaron que MBaMV usaba preferentemente el CD150 de miotis sobre el CD150 humano o de perro para ingresar a las células Vero transgénicas (Fig. 3), lo que se ajusta al paradigma de que el CD150 es el principal determinante de la especificidad del huésped para los morbillivirus. También evaluamos la edición de P, un sello distintivo de los paramixovirus, y encontramos la edición de ARN de P-mRNA, creando V-mRNA (inserción de G simple) o W-mRNA (inserción de doble G) de MBaMV. Curiosamente, la proporción de V-mRNA al 51,2 % del total de transcritos de P es inusualmente alta para los ortoparamixovirus, y se parece más al virus de la peste bovina, ahora extinto, que a los morbillivirus existentes40.

En sus huéspedes naturales, los morbillivirus son altamente patógenos y pueden causar infecciones agudas mortales41. Por lo tanto, una predicción razonable es que MBaMV causaría una enfermedad visible en el huésped murciélago. Sin embargo, cuando desafiamos a los murciélagos frugívoros de Jamaica con MBaMV, encontramos que el virus no podía causar enfermedades sistémicas en los murciélagos (Datos ampliados, Fig. 6) y no había evidencia de que MBaMV infectara productivamente a estos murciélagos. Esta falta de infección podría deberse a las diferencias de CD150 entre las especies: el CD150 de los murciélagos frugívoros de Jamaica y las especies de Myotis se conserva solo en un 70 % en el nivel de aminoácidos (Datos ampliados, Fig. 8). Predecimos que es más probable que la infección por MBaMV cause una enfermedad grave en las especies de M. riparius. Alternativamente, también es posible que los morbillivirus de los murciélagos no provoquen enfermedades graves en sus huéspedes, ya que los murciélagos poseen sistemas inmunitarios únicos que les permiten albergar virus mortales como el Nipah, el ébola y el síndrome respiratorio agudo severo sin mostrar la enfermedad42.

Al evaluar el potencial zoonótico de un nuevo virus, se deben considerar múltiples factores, incluido el uso de receptores, la existencia de anticuerpos de neutralización cruzada en sueros humanos y las interacciones con el sistema inmunitario innato. Si bien actualmente no se sabe que los morbillivirus no humanos salten la barrera de las especies e infecten a los humanos, encontramos que MBaMV fue capaz de utilizar receptores humanos in vitro hasta cierto punto. Tradicionalmente, los morbillivirus usan CD150 para ingresar a las células mieloides y linfoides. Sin embargo, a diferencia de MeV, que infecta a los macrófagos humanos a través de CD150, MBaMV infecta a los macrófagos humanos de manera independiente a CD150 (Fig. 4c)43. Este resultado indica que existe un receptor de entrada no CD150/nectina-4 para MBaMV en los macrófagos humanos. Además, MBaMV se replicó bien en células H441 y en células Vero que expresaban nectina-4 humana (Fig. 3). También se informa que CDV usa nectina-423 humana y puede replicarse en células H35844. De manera alarmante, ha habido varios brotes de CDV en primates no humanos, que han resultado en una enfermedad aguda o en la muerte de los animales34. En un brote, se encontraron mutaciones en RBP, lo que hizo que CDV-RBP fuera capaz de usar primate-CD150 de manera eficiente (ref. 23). Sin embargo, es poco probable que CDV se adapte a los seres humanos en presencia de inmunidad MeV de reacción cruzada. El suero humano de individuos vacunados con MMR pudo neutralizar de forma cruzada la infección por MBaMV in vitro (Fig. 5); esto probablemente limitaría la infección por MBaMV si los humanos vacunados con MMR estuvieran expuestos al virus. Finalmente, mientras que las proteínas MeV P y V antagonizan la respuesta inmunitaria innata, MBaMV P y V no pudieron bloquear la inducción o señalización de IFN (Datos ampliados Fig. 9). En conjunto, nuestros hallazgos sugieren que el potencial zoonótico de MBaMV es bajo debido a los anticuerpos anti-MeV de neutralización cruzada y la restricción inmune innata. Lo primero refuerza la necesidad de mantener una cobertura amplia y alta de vacunación contra el sarampión incluso cuando el virus haya sido eliminado en las poblaciones humanas.

El estudio animal se realizó siguiendo la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. El experimento con animales fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Colorado (protocolo número 1090) por adelantado y se llevó a cabo de conformidad con las pautas de la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Cuidado de Animales de Laboratorio, Institutos Nacionales de Salud, regulaciones de la Universidad Estatal de Colorado políticas y leyes locales, estatales y federales. Los sueros de hurones hiperinmunes al CDV de archivo se obtuvieron de experimentos previos con animales aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Georgia (IACUC número A22035).

Toda la investigación se realizó con la aprobación del Comité de Bioseguridad Institucional (número de protocolo SPROTO202100000065 y aprobaciones anteriores) en el Nivel de Seguridad de Bioseguridad 2+ (BSL2+). Los morbillivirus se clasifican como agentes BSL2. El presente trabajo no está sujeto a las regulaciones de investigación de interés de uso dual, ya que MBaMV no figura como uno de los 15 agentes reconocidos oficialmente como agentes de investigación de interés de uso dual. No se realizaron experimentos mutagénicos para potenciar el tropismo de MBaMV. Para la evaluación de riesgos, los experimentos se realizaron de forma secuencial para minimizar los riesgos involucrados.

Primero, examinamos si el RBP de MBaMV usa el receptor linfoide humano canónico (CD150), que es el receptor responsable de la transmisión, usando un ensayo de fusión (Fig. 1b) y un ensayo de virus pseudotipado (Fig. 1c). Solo después de confirmar que MBaMV no usó CD150 humano en ambos ensayos, lo que sugiere que los riesgos zoonóticos eran bajos, intentamos el rescate completo del virus en BSL2+. Además, nuestros experimentos se realizaron según nuestro procedimiento operativo estándar, que requiere que los experimentos se detengan si se observa algún fenotipo virulento inesperado y luego se informe al IBC. Otros factores de mitigación de riesgos incluyen el requisito de que todo el personal tenga títulos positivos de MMR.

MBaMV se identificó como parte de un estudio metagenómico previo de murciélagos muestreados en Brasil y Malasia. Todos los metadatos asociados con este estudio, incluido el número y las especies de murciélagos muestreados, se pueden encontrar en Wells et al.7. El virus se tomó mediante hisopo rectal de un murciélago que era un macho subadulto (inmaduro, pero independiente) y aparentemente sano. El perfil de ADN mitocondrial (MW554523 y MW557650) identificó al murciélago como una miotis ribereña (M. riparius). El ARN se sometió a análisis NGS y el genoma viral (MW557651) se ensambló a partir de archivos de lectura fastq (GSE166170). El murciélago fue capturado con una red de niebla, luego se recolectaron hisopos orales, rectales y urogenitales para la extracción de ARN. El ácido nucleico total se extrajo utilizando la plataforma Roche MagNA Pure 96 siguiendo el protocolo del fabricante, luego el ácido nucleico total se trató con ADNasa (DNasa I; Ambion, Life Technologies) y se transcribió inversamente utilizando SuperScript III (Invitrogen, Life Technologies) con cebadores de hexámeros aleatorios. El ADNc se trató con RNasa H antes de la síntesis de la segunda cadena por el fragmento Klenow (exonucleasa de 3 'a 5') (New England Biolabs), luego el ADNc de doble cadena se cortó en un promedio de fragmentos de 200 pb usando un ultrasonicador enfocado Covaris E210. El cDNA cortado se secuenció en profundidad con la plataforma Illumina HiSeq 2500, y las lecturas se ensamblaron bioinformáticamente de novo con MEGAHIT v1.2.8 después de los pasos de control de calidad y la exclusión de las lecturas del host con Bowtie2 v2.3.5 (ref. 45). Este método era el mismo que uno publicado previamente7.

Las secuencias de aminoácidos de las proteínas L se alinearon mediante ClustalW, luego se infirió la historia evolutiva de las proteínas L mediante el método de máxima verosimilitud con una prueba de arranque de 1000 repeticiones. Todos los procesos se realizaron en MEGA X (ref. 46). Para la tabla de matriz de conservación, ClustalW alineó las secuencias de aminoácidos de cada gen y luego se evaluaron las conservaciones. Los números de acceso utilizados para la alineación se resumen en la Tabla 2 de datos ampliados.

Células 293T (n.º de cat. ATCC CRL-3216), células A549 (n.º de cat. ATCC CCL-185), células Vero (n.º de cat. ATCC CCL-81, RRID:CVCL_0059) y células BSR T7/5 (RRID :CVCL_RW96) en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Thermo Fisher Scientific) suplementado con suero fetal bovino al 10 % (FBS, Atlanta Biologicals) a 37 °C. Se cultivaron células NCI-H441 (Nº de cat. ATCC HTB-174) en medio RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific) con FBS al 10%. Las celdas 293T, las celdas A549 y las celdas H441 se certificaron mediante el servicio de prueba de autenticación de celdas ATCC. Las células Vero-hCD150 (Vero-human SLAM) son derivados de células Vero que expresan constitutivamente hCD150. Las células Vero-dCD150 son derivados de células Vero que expresan constitutivamente HA-dCD150. Las células Vero-hCD15047 y las células Vero-dCD15048 fueron proporcionadas por el Dr. Yanagi en la Universidad de Kyushu y se mantuvieron en DMEM con 10% de FBS. Se generaron células Vero-bCD150 y células Vero-hN4 como se describe a continuación y se mantuvieron en DMEM con FBS al 10 %. Las células CHO se cultivaron en medio DMEM/F12 (1:1) (Gibco) con FBS al 10%.

Clonamos el ORF de hCD150, dCD150 y bCD150 (de Myostis brandtii ya que se desconoce la secuencia de CD150 de M. riparius) en el vector pCAGGS cortado por EcoRI (NEB) y NheI-HF (NEB). Introdujimos péptidos de señal HA tag-linker-Igk (aminoácidos correspondientes a MVLQTQVFISLLLWISGAYG-YPYDVPDYA-GAQPARSP) en el extremo N de CD150 como se informó anteriormente49. La secuencia de hCD150, dCD150 y bCD150 fue de NP_003028.1, NP_001003084.1 y XP_014402801.1, respectivamente. Sintetizamos secuencias de genes con codones optimizados en GeneArt Gene Synthesis (Invitrogen), generando pCAGGS-Igk-HA-hCD150, pCAGGS-Igk-HA-dCD150 y pCAGGS-Igk-HA-bCD150. También generamos pCAGGS-Igk-HA-bCD150-P2A-Puro, que además expresan el gen resistente a la puromicina. Para pCAGGS-nectin-4-P2A-puro humano, el ADN sintetizado por GeneArt Gene Synthesis (Invitrogen) se clonó en pCAGGS.

La secuencia de MBaMV RBP y F ORF fue sintetizada por GenScript. Estos se clonaron en el vector pCAGGS cortado por EcoRI y NheI-HF con la adición de la etiqueta HA (gen RBP) o la etiqueta AU1 (gen F) en el extremo C, generando pCAGGS-MBaMV-RBP-HA y pCAGGS-MBaMV-F-AU1.

Para MeV RBP y el plásmido que expresa F, amplificamos la secuencia RBP y F de p(+) MV323-AcGFP con la adición de la etiqueta HA y la etiqueta AU1 igual que MBaMV-RBP y MBaMV-F, creando pCAGGS-MeV-RBP -HA y pCAGGS-MeV-F-AU1. Para la clonación de CDV RBP y F, amplificamos la secuencia RBP y F del plásmido pCDV-5804P con la adición de etiquetas HA y etiquetas AU1, creando pCAGGS-CDV-RBP-HA y pCAGGS-CDV-F-AU1.

Plásmidos que codifican el genoma para MeV; (p(+) MV323-AcGFP) y CDV; pCDV-5804P fueron gentilmente obsequiados por el Dr. Makoto Takeda50 y la Dra. Veronica von Messling, respectivamente51. Transferimos la secuencia del genoma de MeV al vector pEMC, agregando un promotor T7 óptimo, una ribozima de cabeza de martillo, e introducimos una unidad transcripcional eGFP en la cabeza del genoma (pEMC-IC323-eGFP), que se informa en el estudio anterior19.

Para la generación del plásmido que codifica el genoma de MBaMV, sintetizamos fragmentos de ADN de 2000 a 6000 pb en GenScript con la adición de la unidad transcripcional eGFP en la cabeza del genoma (eGFP-MBaMV). Los fragmentos de ADN se ensamblaron en el vector pEMC uno por uno utilizando el kit de clonación HD en fusión (Takara), generando pEMC-eGFP-MBaMV. El N-terminal de 1,5 kb del gen L era inicialmente imposible de clonar. El análisis de la secuencia reveló un supuesto ORF (ORF-X) de 86 aminoácidos (aa) en la cadena complementaria. La introducción de dos mutaciones puntuales en esta región para interrumpir ORF-X sin afectar la secuencia de aminoácidos L (datos extendidos, figura 4) finalmente permitió la clonación del genoma de longitud completa, lo que sugiere que ORF-X probablemente era tóxico para las bacterias.

Para la recuperación de MBaMV recombinante, se sembraron 4 × 105 células BSR-T7 en placas de seis pocillos. Al día siguiente, las cantidades indicadas (escritas a continuación) de construcción antigenómica, plásmidos auxiliares (-N, -P y -L de MeV), construcción T7 y reactivo LipofectamineLTX/PLUS (Invitrogen) se combinaron en 200 ml Opti-MEM (Invitrogen ). Después de la incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos, la mezcla de ADN y lipofectamina se añadió gota a gota a las células. Las células se incubaron a 37 °C durante 24 h. Las células que contenían virus P0 se tripsinizaron y se pasaron a células Vero-bCD150 (2,0 × 106 células por matraz en un matraz de 75 cm2). Recolectamos el sobrenadante 2 días después de la superposición (virus P1) y volvimos a amplificar MBaMV en células Vero-bCD150 frescas (>2 × matraces T1 de 75 cm2). Estos stocks del paso 2 (P2) se titularon, se congelaron en alícuotas y se usaron para todos los experimentos.

La cantidad de plásmidos de sarampión utilizados para el rescate se informa en nuestro estudio anterior52: 5 mg de construcción antigenómica, 1,2 mg de T7-MeV-N, 1,2 mg de T7-MeV-P, 0,4 mg de T7-MeV-L, 3 mg de un plásmido que codifica una polimerasa T7 de codón optimizado, 5,8 ml de reactivo PLUS y 9,3 ml de lipofectamina LTX.

El rescate de MeV se realizó exactamente de la misma manera que el rescate de MBaMV excepto que se usaron 5 mg de pEMC-IC323eGFP para la transfección y se usaron células Vero-hCD150 para el cultivo conjunto.

Para MBaMV, se infectó una monocapa de células Vero-bCD150 en 12 pocillos con 500 ml de muestras diluidas en serie durante 1 h, seguido de reemplazo del medio con metilcelulosa que contenía DMEM. Luego, 5 dpi, se contó el número de placas positivas para GFP para determinar el título. Para el ensayo de placas, se incubaron células Vero-bCD150 infectadas bajo DMEM que contenía metilcelulosa durante 7 días. A continuación, las células se tiñeron secuencialmente con cristal violeta al 1% y rojo neutro al 1%. Para MeV, usamos celdas Vero-hCD150 y fijamos las placas a 4 dpi

Se sembró un total de 2,0 × 105 células por pocillo en una placa de 12 pocillos. Las células se infectaron por el título indicado de virus (MOI 0,01 o 0,5) durante 1 h, seguido de reemplazo de medio nuevo. Los virus se cultivaron durante 5 días con cambio de medio todos los días. Los sobrenadantes recolectados se usaron para la titulación.

Se transfectaron un total de 4,0 × 105 de células VeroCCL81 con 2 mg de pCAGGS-Igk-HA-bCD150-P2A-Puro con Lipofectamine 2000 (Invitrogen); las células se seleccionaron bajo 5 mg ml-1 de puromicina (Gibco) hasta que las colonias fueran visibles. Las colonias se aislaron de forma independiente y se comprobó la expresión de HA mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Las células Vero-hN4 se generaron transfectando pCAGGS-nectin-4-P2A-Puro humano en células VeroCCL81, seguido de 5 mg ml-1 de selección de puromicina y aislamiento de clones. La expresión superficial se comprobó mediante FACS.

Se sembraron un total de 6 × 106 células de 293T en una placa de 10 cm (recubierta previamente con poli-l-lisina (Sigma)) 1 día antes de la transfección. Doce miligramos de RBP más 12 mg de plásmido codificante de F de MeV, CDV o MBaMV se transfectaron a células mediante PEI MAX (Polysciences). VSV-deltaG-Gluc complementado con proteína G (VSVDG-G*) se infectaron a una MOI de 10 durante 1 ha 8 h después de la transfección del plásmido. Las células se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y el medio se mantuvo con Opti-MEM durante 48 h. Se recogió el sobrenadante y se ultracentrifugó a 30 000 g durante 2 h, y el precipitado se resuspendió con 100 µl de PBS53. Para la cuantificación de la entrada viral pseudotipada, se transfectaron células CHO en placas de 10 cm con 24 mg de plásmido que expresa hCD150, dCD150 o bCD150 con PEI MAX. Las células CHO se pasaron a placas de 96 pocillos 8 h después de la transfección. El VSV pseudotipado de MeV, CDV o MBaMV se usó para infectar las células CHO. Las unidades de luciferasa de Renilla (RLU) se midieron mediante el sistema de ensayo de luciferasa de Renilla (Promega) para cuantificar la entrada del virus pseudotipo en las células.

Las células CHO se sembraron en 50.000 células en una placa de 48 pocillos 24 horas antes de la transfección. Las células se transfectaron con 200 mg de pCAGSS-RBP-HA (de MeV/CDV/MBaMV), 200 mg de pCAGGS-F-AU1 (de MeV/CDV/MBaMV), pCAGGS-Igk-HA-CD150 (20 ng humano, 5 ng para perros o 20 ng para murciélagos) y 50 mg de pEGFP-C1 Lifeact-EGFP (comprado en Addgene) con 2,5 ml de polietilenimina max (Polysciences). A las 36 h después de la transfección, se tomaron imágenes de las células con un citómetro de imágenes Celigo (Nexcelom) con el canal GFP, y las imágenes se exportaron a una resolución de 5 µm por píxel. ImageJ (desarrollado por NIH) analizó los focos positivos para GFP (células individuales o sincitios), creando el perfil de focos positivos para GFP individuales con información de tamaño.

Para la evaluación del tamaño de los sincitios, primero filtramos los focos positivos para GFP con un tamaño de ≥10 píxeles2, que es el tamaño medio del área de GFP en el pozo de la transfección de MeV-F más LifeactGFP para excluir el ruido de fondo no específico. Luego, calculamos la frecuencia de sincitios, que se define como recuentos de GFP de ≥100 píxeles2 (10 veces el tamaño medio de las células individuales)/recuentos de GFP totales de ≥10 píxeles2.

Se disociaron un total de 50.000 células en una placa de 96 pocillos con EDTA 10 µM en PBS de Dulbecco, seguido de un bloque de FBS al 2% en PBS de Dulbecco. Las células se trataron con el anticuerpo primario durante 1 hora a 4 °C, luego se lavaron y trataron con el anticuerpo secundario durante 1 hora a 4 °C. Las células Vero-bCD150 se examinaron con citómetros de flujo Guava easyCyte (Luminex) para la detección de señal. Las células Vero-hN4 se sometieron a un citómetro de flujo Attune NxT (ThermoFisher Scientific). Para el anticuerpo primario, se utilizaron anticuerpos monoclonales de ratón contra nectina-4 (clon N4.61, Millipore Sigma) y anticuerpos policlonales de marca HA de conejo (Novus Biologicals) a una dilución de 1:1.000. Para el anticuerpo secundario, se usaron apropiadamente IgG anti-conejo de cabra H&L Alexa Fluor 647 (Abcam) e IgG anti-ratón de cabra H&L Alexa Fluor 647 (Abcam). FlowJo se utilizó para analizar los datos y la presentación de FACS.

La producción y purificación de CD150 soluble es como se informó previamente54. El CD150 soluble es una quimera que comprende los dominios V humano (T25 a Y138) y C2 de ratón (E140 a E239) + etiqueta His6, que se clonó en el vector pCA7. El plásmido de expresión se transfectó usando polietilenimina, junto con el plásmido que codifica el antígeno T grande de SV40, en células HEK293S confluentes al 90 % que carecen de actividad de N-acetilglucosaminiltransferasa I (GnTI). Las células se cultivaron en DMEM (MP Biomedicals), complementado con suero de ternera fetal al 10% (FCS) (Invitrogen), l-glutamina y aminoácidos no esenciales (Gibco). La concentración de FCS se redujo al 2% después de la transfección. La proteína etiquetada con His6 se purificó 4 días después de la transfección del medio de cultivo utilizando la columna de afinidad Ni2+-NTA y la cromatografía de filtración en gel Superdex 200 GL 10/300 (Amersham Biosciences). El pH de todos los tampones se ajustó a 8,0. El avitag de fusión CD150 Fc soluble se adquirió de BPS Bioscience y se reconstituyó mediante PBS.

Los monocitos CD14+ se aislaron de leucopacos adquiridos del New York Blood Bank utilizando el kit de selección positiva EasySep Human CD14 (StemCell #17858). Para la diferenciación de macrófagos, se sembraron monocitos CD14+ a 106 células ml-1 y se cultivaron en medio R10 (RPMI suplementado con FBS, HEPES, l-glutamina y penicilina-estreptomicina) con 50 ng ml-1 de factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos ( Sigma Aldrich G5035) en una incubadora a 37 °C. Los medios y las citocinas se reemplazaron 3 días después de la siembra. Seis días después de la siembra, los macrófagos se infectaron con MeV o MBaMV a 100 000 unidades infecciosas (UI) por 500 000 células y se espinolaron a 300 g durante 1 hora a temperatura ambiente. Se eliminó el inóculo de virus y las células se incubaron en medio R10 con factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos a 37 °C. Para los experimentos de imagen, los macrófagos se fijaron en paraformaldehído (PFA) al 4 % a 30 hpi y se tiñeron con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), y se capturaron imágenes fluorescentes y de campo brillante en el lector de placas Cytation 3. Para los experimentos de citometría de flujo, los macrófagos infectados se tiñeron para determinar su viabilidad a las 24 hpi (kit de tinción fijable LIVE/DEAD de Invitrogen L34976), se trataron con bloque Fc humano (BD Biosciences), se tiñeron con anticuerpos contra CD14 (eBioscience clon 61d3; dilución 1:100). ) y HLA-DR (eBioscience clon LN3; dilución 1:75), fijado en PFA al 2%, permeabilizado con saponina y teñido para CD68 intracelular (eBioscience clon Y1/82A; dilución 1:100) y CD150 (eBioscience; 1:75 dilución). CD150 soluble (1 mg ml−1) o CD150 Avi-tag (BPS Bioscience) se incubaron con MeV o MBaMV durante 15 min antes de la infección para los experimentos de inhibición. Los macrófagos teñidos se pasaron por un citómetro de flujo Attune NxT y los datos se analizaron con el software FlowJo (v10).

Las PBMC se aislaron de donaciones de sangre fresca obtenidas a través del New York Blood Center usando centrifugación de densidad y un gradiente de Ficoll. A continuación, las PBMC aisladas se resuspendieron en medio RPMI (10 % FBS, 1 % l-glutamina y 1 % penicilina-estreptomicina) y se estimularon para la activación de células T con concanavalina-A (ConA) a 5 µg ml−1 durante 72 h. A continuación, las células se lavaron una vez con PBS y se estimularon con 10 ng ml−1 de IL2 durante 48 h. Posteriormente, las células se infectaron a una MOI de 0,2 con MeV o BaMV o se infectaron de forma simulada en placas de 12 pocillos a 106 células ml-1. Las células se recogieron 24 hpi, se tiñeron con tinte rojo lejano de células muertas fijables LIVE/DEAD de Invitrogen según el protocolo del fabricante y se analizaron para determinar la expresión de eGFP mediante citometría de flujo con un citómetro de flujo Attune NxT. El análisis se completó utilizando FCSExpress-7. Se utilizó un total de dos donantes para este análisis, con los datos del donante 1 que se muestran en la Fig. 4.

Se sembró un total de 1 × 106 células 293T en una placa de seis pocillos recubierta de colágeno. Las células 293T se transfectaron con 2 mg de pCAGGS, pCAGGS-MBaMV-RBP-HA o pCAGGS-MBaMV-F-AU1 utilizando polietilenimina max (Polysciences). Las células se lavaron con PBS y luego se lisaron con tampón RIPA. Las proteínas citosólicas recolectadas se corrieron en gel de poliacrilamida al 4–15 % (Bio-Rad, n.° 4561086) y se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno (Fisher Scientific, n.° 45-004-113), seguido de una reacción de anticuerpo primario y una reacción de anticuerpo secundario. Se utilizó anticuerpo policlonal de etiqueta HA de conejo (Novus Biologicals, n.º NB600-363; dilución 1:1000) y anticuerpo policlonal de epítopo AU1 de conejo (Novus Biologicals, n.º NB600-453; dilución 1:1000) como anticuerpo primario para la detección de etiquetas HA y AU1 , respectivamente. El anticuerpo monoclonal de conejo (Cell Signaling Technology, #2118; dilución 1:1000) se eligió como anticuerpo primario para detectar GAPDH. El anticuerpo anti-conejo conjugado con Alexa Fluor 647 (Invitrogen, #A-21245; dilución 1:2,000) se usó como anticuerpo secundario apropiadamente. La captura de imágenes fue realizada por Chemidoc MP (Bio-Rad).

MBaMV infectó un total de 4,0 × 105 células Vero-bCD150 con una MOI de 0,01. El ARN citosólico se recogió con 500 ml de TRIzol (Ambion) a 2 ppp. El ARN citosólico recogido se secuenció mediante secuencia directa de ARN por MinION (Oxford Nanopore Technologies) con algunas modificaciones en el protocolo. Primero, comenzamos la preparación de bibliotecas a partir de 3 mg de ARN. En segundo lugar, usamos SuperScript IV (Invitrogen) en lugar de SuperScript III. La secuenciación se realizó durante 48 h utilizando celdas de flujo R9.4. Minimap2 alineó el archivo fastq con la secuencia del genoma de MBaMV y IGVtools extrajo la información de cobertura.

La infección y la extracción de ARN fueron las mismas que las anteriores (análisis del transcriptoma). Un microgramo de ARN se transcribió inversamente mediante TetroRT (Bioline) con cebador poli-A, seguido de PCR con un conjunto de cebadores de Pedit-f (secuencia GGGACCTGTTGCCCGTTTTA) y Pedit-r (secuencia TGTCGGACCTCTTACTACTAGACT). Los amplicones se procesaron con el kit NEBNext Ultra DNA Library Prep siguiendo las recomendaciones del fabricante (Illumina) y se secuenciaron con Illumina MiSeq en una configuración de extremos emparejados de 2 × 250 en GENEWIZ. La llamada base fue realizada por Illumina Control Software (HCS) en el instrumento Illumina. BBTools fusionó los archivos fastq de dos extremos. Estos archivos fastq combinados se alinearon con la secuencia de referencia usando bowtie2, creando un archivo SAM, y contamos el número de inserciones de edición P.

Se sembraron células Vero-hCD150, Vero-dCD150 y Vero bCD150 en placas de 96 pocillos. Dos grupos de sueros humanos agrupados de personas que recibieron previamente la vacuna MMR (tres individuos por grupo) y sueros de hurones vacunados con CDV (cortesía de Richard Plemper) se inactivaron con calor durante 30 minutos a 56 °C. Se incubaron cantidades iguales de CDV, MeV y MBaMV (20 000 UI ml−1) con diluciones en serie de los sueros inactivados por calor durante 15 min a temperatura ambiente. A continuación, se añadieron virus y sueros a las células Vero con el receptor correcto y se colocaron a 37 °C. A las 20 hpi, se tomaron imágenes de las células usando un citómetro de imágenes Celigo (Nexelcom) con el canal GFP. Las imágenes exportadas se analizaron con ImageJ para medir el alcance de la infección viral por área GFP+ (MeV y MBaMV) o recuentos totales de GPF+ (CDV). El porcentaje de reducción de la infección se calculó ajustando el nivel de infección en los pocillos de control sin suero al 100 %. Los datos normalizados se trazaron utilizando GraphPad Prism y las curvas de neutralización se generaron mediante regresión no lineal con concentración de inhibidor versus respuesta normalizada. Los valores de IC50 se calcularon para cada réplica usando un modelo de ajuste robusto. Se completaron cinco réplicas para la neutralización de MeV y MBaMV con los sueros humanos agrupados, y se repitieron dos réplicas con CDV y los sueros de hurón.

Los hurones se vacunaron con CDV y se recogió y combinó el suero de tres hurones hembra. Este suero se usó en ensayos de neutralización viral. Aunque estos sueros de archivo se obtuvieron como parte de estudios aprobados por IACUC (protocolo A22035 de IACUC), el trabajo no se ha publicado en ningún otro lugar. Los hurones se mantuvieron en un nivel de bioseguridad animal 1 en un entorno de alojamiento agrupado en jaulas abiertas a 20 °C (40 % de humedad relativa) con cambios de jaula semanales, alimento (dieta formulada por Marshall Farms) y agua ad libitum, y un fotoperíodo de 14 h de luz. y 10 h de oscuridad. Estos hurones venían inmunizados del proveedor (granjas Tripple F) y fueron vacunados (por vía subcutánea) a las 10 semanas de edad usando una vacuna de CDV con vector de viruela del canario de ADN ribosómico, Purevax Ferret Distemper según el protocolo del fabricante (principal más dos dosis adicionales a las 3 semanas). intervalos). Los hurones inmunizados se sangraron a los 8 meses de edad. Después de una única extracción de sangre de 2 ml de la vena yugular, los hurones se retiraron sin efectos adversos.

Los murciélagos frugívoros de Jamaica se obtuvieron de la colonia de reproducción de la Universidad Estatal de Colorado que se estableció a partir de murciélagos de zoológico donados en 2006. Esta es una colonia de vuelo libre y las hembras reproductivas producen una descendencia en intervalos de aproximadamente 5 a 6 meses. Los murciélagos son alimentados diariamente con fruta fresca (melón, sandía y plátano) complementados con galletas para monos y alimento para pájaros que contiene hierro como fuentes adicionales de proteínas y calorías. Para el desafío experimental con el virus, los murciélagos se alojaron en una jaula para pájaros (76 h × 56 w × 56 d cm) que permitía la extensión completa de las alas y el movimiento. La tela de paisaje se usa habitualmente como sustrato de descanso en las jaulas. Los murciélagos se mantuvieron bajo un fotoperíodo de 12/12 h con temperatura ambiente mantenida a 22 °C y humedad relativa entre 35% y 50%. Los murciélagos se sacrificaron por inhalación de isoflurano al 3%, seguido de toracotomía.

Para los ensayos de inducción de genes estimulantes de interferón, se transfectaron células HEK 293T con plásmidos que codifican ISG54-ISRE-FLuc, TK-RLuc y cualquiera de los vectores vacíos, MBaMV P, MVaMV V o ZIKV MR766 NS5. A las 24 h post-transfección, las células se trataron con 100 U de IFNb humano (a 100 U ml−1). Las células se lisaron 24 h después del tratamiento con IFNb, y se midió la expresión de FLuc y RLuc utilizando el ensayo de luciferasa Promega Dual. Los datos se calcularon como una proporción de Fluc:RLuc para normalizar la eficiencia de la transfección. Se completaron dos experimentos independientes con tres repeticiones técnicas. Para medir el antagonismo de la inducción de IFN (activación del promotor de IFNb), se transfectaron células HEK 293T con plásmidos que codifican IFNb-FLuc, TK-RLuc, un estimulante del promotor de IFN (ya sea RIG-I, MDA5 o MAVS) y vector vacío, MBaMV P , MBaMV V o HCV NS3/4A (antagonistas potenciales de IFN). A las 24 h después de la transfección, se lisaron las células y se midió la expresión de FLuc y RLuc mediante el ensayo de luciferasa Promega Dual. Los datos se calcularon como una proporción de Fluc:RLuc para normalizar la eficiencia de la transfección. Se completaron dos experimentos independientes con tres repeticiones técnicas. Para el análisis estadístico, se realizó con Prism un análisis de varianza de una vía (ANOVA) con comparaciones múltiples de Dunnett.

Seis machos adultos de murciélagos frugívoros de Jamaica (Artibeus jamaicensis) fueron inoculados con 2 × 105 UFP MBaMV-eGFP; se inocularon tres murciélagos por vía intranasal y tres murciélagos se inocularon por vía intraperitoneal. Una semana después de la inoculación del virus, los murciélagos se sometieron a una recolección de sangre y suero, se inspeccionó visualmente la expresión de GFP alrededor de las fosas nasales, la cavidad oral y los ojos con una cámara LED en cada grupo (por vía intranasal e intraperitoneal) mientras se alojaban en jaulas para pájaros. Dos semanas después de la infección por el virus, se recogieron sangre, suero y tejidos (pulmón, bazo e hígado) de un murciélago de cada grupo. Tres semanas después de la infección por el virus, se recogieron sangre, suero y tejidos (pulmón, bazo e hígado) de un murciélago de cada grupo. En el punto de recolección de muestras, se sacrificaron los murciélagos y se procesaron sus tejidos. Los murciélagos se obtuvieron y alojaron en la colonia de reproducción de la Universidad Estatal de Colorado.

El ARN sanguíneo se extrajo con TRIzol. El ARN se transcribió inversamente con el kit de síntesis de ADNc Tetro (Bioline) con el cebador de 'GAGCAAAGACCCCAACGAGA' dirigido al genoma MBaMV-GFP, luego se cuantificó la cantidad de genomas con el kit SensiFAST SYBR & Fluorescein (Bioline) y el sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 Touch (Bio-Rad). El conjunto de cebadores para qPCR es 'GGGGTGCTATCAGAGGCATC' y 'TAGGACCCTTGGTACCGGAG'.

El ensayo de neutralización de virus se realizó como sigue. El suero de murciélago inactivado por calor (56 °C × 30 min) se diluyó en serie tres veces (a partir de una dilución de cinco veces) y se mezcló con 2 × 104 PFU ml−1 de MBaMV en una proporción de 1:1 durante 10 min a temperatura ambiente. . Se aplicaron cien mililitros de mezcla a células Vero-batCD150 en 96 pocillos. Los focos de GFP se detectaron y contaron mediante un citómetro de imágenes Celigo (Nexcelom). Los recuentos de GFP de las muestras tratadas con suero se normalizaron mediante pocillos sin tratamiento con suero.

Los tejidos se fijaron con formalina tamponada al 10% y se incluyeron en parafina, luego se cortaron en rodajas finas. La inmunohistoquímica GFP se realizó utilizando VENTANA DISCOVERY ULTRA. Se usó anticuerpo monoclonal de conejo (Cell Signaling Technology, #2956) como anticuerpo primario y OMNIMap anti-rabbit-HRP (Roche, #760-4310) como anticuerpo secundario. La señal de GFP se visualizó utilizando el kit Discovery ChromoMap DAB (Roche, #760-2513). Los tejidos se contrastaron con hematoxilina para visualizar los núcleos. No se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar los tamaños de muestra, pero nuestros tamaños de muestra son similares a los publicados anteriormente. La recopilación y el análisis de datos no se realizaron a ciegas de las condiciones de los experimentos.

El acoplamiento in silico se realizó con MOE 2018.1001 (Chemical Computing Group), como se describió anteriormente38. Se creó un modelo de homología de MBaMV L sobre la base de las coordenadas estructurales de PIV5-L (ID de PDB: 6V86) utilizando el servidor de modelado de homología SWISS-MODEL55. Antes del acoplamiento, el modelo de la proteína MBaMV L se protonó y se minimizó la energía. Se implementó un protocolo de ajuste inducido utilizando el campo de fuerza Amber10 para acoplar ERDRP-0519 y GHP-88309 en MBaMV L. Para la unión de ERDRP-0519, residuos Y1155, G1156, L1157, E1158 y H1288, y para la unión de GHP-88309 , los residuos E858, D863, D997, I1009 y Y1106 se preseleccionaron como objetivos de acoplamiento, que se prevé que alineen los sitios de acoplamiento de ERDRP-0519 y GHP-88309, respectivamente, en MeV L. Se seleccionaron las poses de acoplamiento de mayor puntuación y alineado en Pymol con las poses de acoplamiento in silico previamente caracterizadas de los inhibidores de la proteína MeV L. La alineación de secuencias de las proteínas MBaMV y MeV L se realizó utilizando Clustal Omega56. La conservación se calificó utilizando el servidor de conservación de alineación AL2CO57,58.

El procesamiento TEM de rutina se realizó como se describe. Las células Vero-bCD150 infectadas por MBaMV durante 3 días se lavaron con PBS y luego se fijaron con glutaraldehído al 2,5 % en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M (pH 7,4) en hielo durante 1 h. Las células se rasparon de la placa de Petri tratada con cultivo de tejidos de 100 mm y se sedimentaron mediante centrifugación a baja velocidad (400 g durante 5 min). El sedimento se fijó durante 30 min con el mismo fijador antes de la fijación secundaria con tetraóxido de osmio al 2 % en hielo durante 1 h. A continuación, las células se tiñeron con una solución acuosa de uranilo al 2 % en bloque durante 1 h a temperatura ambiente, se deshidrataron con una serie de gradientes crecientes de etanol seguidos de un tratamiento con óxido de propileno y se incluyeron en la mezcla de resina Embed 812 (Electron Microscopy Sciences). Los bloques se curaron durante 48 h a 65 °C y luego se recortaron en secciones ultrafinas de 70 nm con un cuchillo de diamante en un Leica Ultracut 6 y se transfirieron a rejillas de cobre de malla 200. Las secciones se contrastaron con acetato de uranilo al 2 % en etanol al 70 % durante 3 min a temperatura ambiente y en citrato de plomo durante 3 min a temperatura ambiente, y luego se examinaron con un microscopio electrónico de transmisión JEOL JSM 1400 equipado con dos cámaras CCD para la adquisición de imágenes digitales: Veleta 2K×2K y Quemesa 11 megapíxeles (EMSIS) operadas a 100 kV.

Todos los métodos estadísticos utilizados en el análisis se enumeran en las leyendas de las figuras adjuntas. Los análisis se calcularon utilizando GraphPrad Prism (v10). Se asumió que la distribución de datos era normal, pero esto no se probó formalmente. Con respecto al estudio de desafío con murciélagos, no se utilizó ningún método estadístico para predeterminar el tamaño de la muestra y no se excluyó ningún dato del análisis.

Las células dendríticas primarias normales y los macrófagos utilizados en este proyecto se obtuvieron de 'sangre periférica humana Leukopack, fresca', proporcionada por el proveedor comercial New York Blood Center. La leucaféresis se realizó en donantes normales utilizando formularios de consentimiento y protocolos aprobados por la junta de revisión institucional por parte del proveedor. El vendedor posee los consentimientos del donante y la autorización legal que debe otorgar el permiso para todos los usos de investigación. El proveedor no está involucrado en el diseño del estudio y no tiene ningún papel en este proyecto. Las muestras fueron desidentificadas por el vendedor y nos las proporcionaron. Para proteger la privacidad de los donantes, el proveedor no divulga ningún registro de donantes. Si se utiliza únicamente con fines de investigación, se aplica el consentimiento del donante. Se obtuvieron alícuotas de sueros inmunes agrupados de un estudio serológico anónimo anterior que se calificó como Exención 4 según las pautas de investigación de sujetos humanos exentos del NIH (Icahn School of Medicine at Mount Sinai)59. Las muestras de suero se compraron a Innovative Research como reactivos de investigación no identificados. El suero se recolectó entre agosto y noviembre de 2014 en Michigan, de donantes de entre 18 y 64 años. Para el suero humano, los títulos reactivos de MuV se determinaron previamente con un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas contra MuV-F y MuV-HN recombinantes, además de los títulos de neutralización utilizando la cepa vacunal recombinante de MuV (JL5). Las muestras de suero utilizadas en este estudio procedían de donantes que presentaban títulos de neutralización superiores a la mediana de los títulos para esta cohorte, según se determinó previamente59.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los resultados NGS sin procesar de la vigilancia de murciélagos, la edición del gen P y el transcriptoma por MinION se cargan en NCBI GEO: GSE166170, GSE166158 y GSE166172, respectivamente. Las imágenes sin procesar de nuestros experimentos se cargaron en Figshare y los enlaces están disponibles en los datos de origen. La secuencia de MBaMV ensamblada y la información de secuencia de pEMC-MBaMVeGFP están disponibles en NCBI Genbank MW557651 y MW553715, respectivamente. La secuencia del huésped de la citocromo oxidasa I y la secuencia del huésped del citocromo b del murciélago infectado con virus están disponibles en MW554523 y MW557650. La secuencia del plásmido que codifica el ADNc genómico de MeV (pEMC-IC323eGFP) está disponible en MW401770. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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SI fue apoyado por el Grupo de Estudio de Oncología y Hematología Clínica de la Universidad de Fukuoka (CHOT-SG). Este estudio fue apoyado en parte por subvenciones NIH U19 AI171403 y AI071002 (RKP y BL), AI149033 (BL y JL), AI140442 (TS), AI134768 (TS) y USAID PREDICT (SJA, JHE, PD y ED). JCCJAA, KYO, AP y CSS reconocen el apoyo de T32 AI07647. KYO fue apoyado adicionalmente por F31 (AI154739). JAA también fue compatible con F31 (HL149295). JCC también fue compatible con F32 (HL158173). Este trabajo también recibió el apoyo de la subvención 20wm0325002h (TH) del Agente japonés para la investigación y el desarrollo médicos (AMED), la subvención JSPS KAKENHI número 20H03497 (TH) y el programa del Centro de Investigación/Uso Conjunto del Instituto de Ciencias Médicas y de la Vida Fronterizas, Universidad de Kyoto (SI ). T. Yanagi de la Universidad de Kyushu proporcionó amablemente las células Vero-hCD150 y Vero-dCD150. M. Takeda (Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, Tokio, Japón) y V. von Messling (Ministerio Federal de Educación e Investigación de Alemania, Berlín, Alemania) proporcionaron amablemente los plásmidos que codifican el genoma para MeV y CDV (respectivamente). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Estos autores contribuyeron igualmente: Satoshi Ikegame, Jillian C. Carmichael.

Departamento de Microbiología, Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai, Nueva York, NY, EE. UU.

Satoshi Ikegame, Jillian C. Carmichael, Joshua A. Acklin, Hsin-Ping Chiu, Kasopefoluwa Y. Oguntuyo, Aum R. Patel, Shreyas Kowdle, Christian S. Stevens, Jean K. Lim, Ethan C. Veit, Matthew J. Evans y Benhur Lee

Departamento de Ecología, Evolución y Biología Ambiental, Universidad de Columbia, Nueva York, NY, EE. UU.

pozos de brezo

Departamento de Medicina, División de Enfermedades Infecciosas, Weill Cornell Medicine, Nueva York, NY, EE. UU.

Robert L. Furler O’Brien

Instituto de Ciencias Biomédicas, Universidad Estatal de Georgia, Atlanta, GA, EE. UU.

Robert M. Cox y Richard K. Plemper

Centro de Enfermedades Infecciosas Transmitidas por Vectores Departamento de Microbiología, Inmunología y Patología Facultad de Medicina Veterinaria Universidad Estatal de Colorado, Fort Collins, CO, EE. UU.

Miles Eckley, Shijun Zhan y Tony Schuntz

Laboratorio de Virología Médica, Instituto de Ciencias Médicas y de la Vida, Universidad de Kyoto, Kyoto, Japón

Takao Hashiguchi

Departamento de Microbiología, Instituto de Ciencias Biomédicas, Universidad de São Paulo, São Paulo, Brasil

edison durigon

Alianza EcoHealth, Nueva York, NY, EE. UU.

Jonathan H. Epstein y Peter Daszak

Departamento de Patología, Microbiología e Inmunología, Facultad de Medicina Veterinaria de UC Davis, Davis, CA, EE. UU.

Simón J. Antonio

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SI, SJA y BL concibieron este estudio. SI realizó ensayos de fusión, rescate de virus, análisis de crecimiento, secuenciación de ARN de análisis de transcriptomas y generación de líneas celulares escritas en el estudio. RLFO realizó imágenes TEM. JCC, JAA, ARP y JKL realizaron los experimentos con macrófagos y células T y el análisis de datos. JCC realizó los ensayos de neutralización de sueros. KYO realizó un ensayo de entrada de pseudotipo VSV. RMC y RKP proporcionaron ERDRP-0519 y GHP-88309 además del modelado in silico de MBaMV-LH-PC evaluó la producción de proteínas mediante transferencia Western. TH proporcionó información guiada por la estructura sobre la conservación de RBP y la unión de CD150, así como CD150 humano soluble para el ensayo de inhibición. KYO y SK evaluaron la expresión superficial de los receptores de morbillivirus. CSS evaluó la frecuencia de edición de P-mRNA a partir de datos NGS. TS, ME y SZ realizaron un experimento de desafío con murciélagos. ED realizó vigilancia de murciélagos en colaboración con JHE y PDSJA y HW realizó análisis NGS de vigilancia de murciélagos y obtuvo secuencias de MBaMV. MJE y ECV realizaron los experimentos de respuesta e inducción de IFN. JHE, PD y SJA proporcionaron información sobre la ecología viral y las amenazas zoonóticas. BL supervisó este estudio. SI, JCC, SJA y BL escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Benhur Lee.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Microbiology agradece a Roberto Cattaneo, Bert Rimaand y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a, Representación esquemática del genoma MBaMV y sus genes codificados. También se muestra el MBaMV-eGFP recombinante generado en este estudio. La unidad transcripcional eGFP se representa como 'G' (recuadro verde). # indica la posición en L donde se introdujeron mutaciones silenciosas para evitar la expresión de ORF-X putativo que parecía tóxico en bacterias (datos extendidos, Fig. 3). La barra de escala de nucleótidos se proporciona para el contexto. b, Se usó la secuencia completa de aminoácidos de la proteína L para construir el árbol filogenético de virus representativos de las tres subfamilias principales de Paramyxoviridae. Las secuencias de la proteína L se alinearon primero mediante clustalw, luego se generó el árbol filogenético mediante el método de máxima verosimilitud usando MEGA 10 (versión 10.1.8). Los números en cada nodo indican la fidelidad mediante la prueba de arranque (1000 veces). MBaMV (punta de flecha roja) estaba más estrechamente relacionado con el virus del moquillo canino (CDV) y el virus del moquillo focino (PDV) hasta el reciente descubrimiento del morbillivirus porcino (PoMV). La escala indica sustituciones por sitio. Los números de acceso para las secuencias utilizadas en este análisis filogenético se muestran en la Tabla S2.

El porcentaje de similitud de aminoácidos (% AA) de las proteínas MBaMV en comparación con los 7 morbillivirus establecidos se representa gráficamente para visualizar el grado de conservación en todo el género. N, M, F y L mostraron una conservación relativamente alta (50 - 80%) a todos los morbillivirus con la excepción de FeMV. P, V, C y RBP mostraron una conservación del 30-50% frente a todos los morbillivirus nuevamente con la excepción de FeMV. Se usó ClustalW para alinear las secuencias de aminoácidos afines de cada morbillivirus y se calculó el % de similitud de AA usando la configuración predeterminada. El número de acceso de las secuencias utilizadas se indica en la Tabla S1.

Datos fuente

Los primeros 1500 nt del gen L fueron refractarios a la clonación. La inspección de la secuencia del gen L reveló un supuesto ORF de 86 aa en la hebra complementaria (-) de los primeros 1500 nt del gen L (a, secuencia original y b, ORF-X). Para determinar si este supuesto ORF podría ser tóxico para las bacterias utilizadas para clonar el genoma de MBaMV, realizamos dos mutaciones que eran silenciosas en el ORF L pero que abolieron la(s) metionina(s) iniciadora(s) en este supuesto ORF-X. Los nucleótidos sombreados en rojo corresponden al tercer codón de metionina en ORF-X (a, ORF-X eliminado). Este clon genómico MBaMV "ORF-X KO" fue la construcción final que se rescató. La secuencia de aminoácidos de ORF-X se muestra en (b).

Las células Vero que expresan establemente Myotis brandtii CD150 (bCD150) y nectina-4 humana se prepararon como se describe en los métodos. a, tinción FACS para la expresión superficial de bCD150 marcado con HA en células Vero-bCD150. La etiqueta HA se colocó inmediatamente después de la secuencia del péptido señal. b, muestra la expresión superficial de nectina-4 humana por FACS. Se usaron células Vero parentales y células H441 (epiteliales de las vías respiratorias inferiores humanas) como controles negativos y positivos para la nectina-4 humana, respectivamente. Más del 50% de las células Vero-Nectin-4 expresan niveles más altos de nectina-4 humana que las células H441. c, Se recolectaron macrófagos derivados de monocitos y se tiñeron para nectina-4 humana superficial, lo que confirma que los macrófagos no expresan nectina-4. Se usaron células Vero-Nectin-4 como control positivo.

Las células Vero-bCD150 se infectaron con MBaMV (MOI = 0,01) y el ARN citosólico recogido a 2 ppp se sometió a secuenciación directa de ARN dirigida a ARNm utilizando la plataforma MinION (Oxford Nanopore Technology). 93 917 lecturas / un total de 797 133 lecturas están alineadas con MBaMV. a, la cobertura de lectura mostró que la infección y la replicación de MbaMV exhibían el gradiente transcripcional de 3' a 5' típico de los paramixovirus. El límite de cada unidad transcripcional también se puede apreciar por la fuerte caída en las lecturas que coinciden con la secuencia intergénica de trinucleótidos. Los rangos de cobertura de secuenciación mediana (IQR) son 6509 (N, 5368-7465), 3640 (P, 3193-4047), 3018 (M, 2533-3656), 929 (F, 722-1096), 535 (RBP, 491- 633) y 10 (L, 5-33). b, El gráfico de cobertura de lectura alrededor de la región intergénica MF se amplía para mostrar el motivo intergénico poco común de 'CGU'. El motivo intergénico entre todos los demás genes es 'CUU'. c, la secuenciación de amplicón alrededor del sitio de edición del gen P muestra la frecuencia de edición del ARNm del gen P. El 51,2% de los ARNm del gen P adquirieron una única inserción 'G' en el sitio de edición, creando el ARNm V. Los números que se muestran son el promedio de tres experimentos independientes con barras de error que representan SD (de) muestran la expresión de glicoproteínas de superficie (RBP y F) de MBaMV, MeV y CDV por Western blot. Se transfectaron 5 μg de plásmidos de expresión (pCAGGS, pCAGGS-RBP-HA, pCAGGS-F-AU1) en 293 T en una placa de 6 pocillos. Las proteínas citosólicas se recogieron y corrieron en gel de acrilamida. La tinción con AU1 (d) mostró proteína F de longitud completa (F0; punta de flecha azul) y producto de F1 escindido (asterisco rojo). La tinción con HA (e) mostró la expresión del monómero RBP (punta de flecha azul) alrededor de 60 a 70 kDa además del oligómero. Se usó COXIV como control de carga para la transferencia. Los experimentos en d) ye) se completaron dos veces, con resultados similares.

Datos fuente

a, 6 murciélagos frugívoros de Jamaica (Artibeus jamaicensis) fueron inoculados con MBaMV (2 × 105 PFU/cuerpo) por vía intranasal (IN) o intraperitoneal (IP). Se recogieron sangre, suero y tejidos (pulmón, hígado y bazo) como se indica. La expresión de GFP en los tejidos se comprobó mediante GFP-IHC. b, el sedimento de células infectadas con MeV (control positivo) mostró una fuerte señal GFP IHC. c, los tejidos derivados de murciélagos no mostraron señal de GFP. El experimento de desafío con murciélagos se completó una vez. Todas las barras de escala se establecen en 50 µM.

El RBP de 8 morbillivirus y otros paramixovirus representativos (virus Sendai (SeV), virus Nipah (NiV), virus de las paperas (MuV)) fueron alineados por clustalw. Las alineaciones alrededor de los residuos de contacto de CD150 se muestran por separado en (a) 180-200 aa, (b) 490-510 aa y (c) 520-560 aa. Los residuos altamente y moderadamente conservados en estas regiones están sombreados en negro y gris, respectivamente. Los residuos ocluidos en la interfaz RBP-CD150 de la estructura cristalina MeV-tití CD150 se identificaron mediante PDBePISA y se indicaron con el sombreado de color melocotón sobre la alineación. Se indican enlaces de hidrógeno (azul profundo), puentes de sal (rojo), enlaces de hidrógeno + puente de sal (púrpura) en estas regiones ocluidas.

CD150 de los 8 mamíferos que son los huéspedes naturales de los morbillivirus indicados están alineados por clustalw. Se muestran las alineaciones alrededor de los residuos de contacto de RBP (aa60-179). Los residuos altamente y moderadamente conservados en estas regiones están sombreados en negro y gris, respectivamente. Los residuos ocluidos en la interfaz RBP-CD150 (PDB: 3ALZ) fueron identificados por PDBePISA e indicados por el sombreado de color melocotón sobre la alineación. Se indican enlaces de hidrógeno (azul profundo), puentes de sal (rojo), enlaces de hidrógeno + puente de sal (púrpura) en estas regiones ocluidas. La reproducción del color es idéntica a la Figura 7 de datos extendidos.

a) Las células T HEK 293 se cotransfectaron con un plásmido ISG54-ISRE-FLuc y MBaMV P, MBaMV V, MeV V, MeV P o ZIKV NS5. Las células se trataron con IFNb humano y la inducción de ISRE se midió mediante un ensayo de luciferasa. Las células T HEK 293 se cotransfectaron con un plásmido IFNb-FLuc, un estimulante promotor de IFN b) RIG-I, c) MDA5 y d) MAVS, y MeV P, MeV V, MBaMV P, MBaMV V o HCV NS3 /4 A. La inducción de IFN se midió mediante el ensayo de luciferasa en 2 experimentos independientes con 3 réplicas técnicas (media +/- SD). Los valores de p específicos (* p < 0,5; **** p = < 0,0001) se calcularon usando un ANOVA unidireccional con una prueba de comparaciones múltiples de Dunnett.

Datos fuente

Figura de selección de citometría de flujo.

Fuente de datos estadísticos.

Fuente de datos estadísticos.

Fuente de datos estadísticos.

Fuente de datos estadísticos.

Fuente de datos estadísticos.

Fuente de datos estadísticos.

Fuente de datos estadísticos.

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Reimpresiones y permisos

Ikegame, S., Carmichael, JC, Wells, H. et al. Ensamblaje de genética inversa habilitado por metagenómica y caracterización de morbillivirus de murciélago myotis. Nat Microbiol 8, 1108–1122 (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01380-4

Descargar cita

Recibido: 09 Septiembre 2022

Aceptado: 06 abril 2023

Publicado: 04 mayo 2023

Fecha de emisión: junio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01380-4

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