Descubrimiento de dos nuevas isoformas del gen DUT humano

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 7760 (2023) Citar este artículo

659 Accesos

Detalles de métricas

En células humanas se han descrito dos isoformas de dUTPasa: una nuclear (DUT-N) y una mitocondrial (DUT-M), con señales de localización afines. En contraste, aquí identificamos dos isoformas adicionales; DUT-3 sin señal de localización y DUT-4 con la misma señal de localización nuclear que DUT-N. Basándonos en un método RT-qPCR para la cuantificación simultánea específica de isoformas, analizamos los patrones de expresión relativa en 20 líneas celulares humanas de orígenes muy diferentes. Encontramos que la isoforma DUT-N se expresa con mucho en el nivel más alto, seguida por la isoforma DUT-M y DUT-3. Una fuerte correlación entre los niveles de expresión de DUT-M y DUT-3 sugiere que estas dos isoformas pueden compartir el mismo promotor. Analizamos el efecto de la inanición de suero en la expresión de las isoformas de dUTPasa en comparación con las células no tratadas y encontramos que los niveles de ARNm de DUT-N disminuyeron en las células A-549 y MDA-MB-231, pero no en las células HeLa. Sorprendentemente, tras la privación de suero, DUT-M y DUT-3 mostraron un aumento significativo en la expresión, mientras que el nivel de expresión de la isoforma DUT-4 no mostró ningún cambio. Tomados en conjunto, nuestros resultados indican que el suministro de dUTPasa celular también puede proporcionarse en el citoplasma y los cambios de expresión inducidos por estrés por inanición dependen de la línea celular.

Las polimerasas no pueden distinguir entre dUTP y dTTP, ya que solo se diferencian en un grupo metilo, por lo que mantener la proporción adecuada de dUTP/dTTP es de suma importancia1. La enzima dUTPasa es responsable de preservar la integridad del genoma al catalizar la hidrólisis de dUTP en dUMP y pirofosfato, eliminando así dUTP del conjunto de dNTP2,3. Si se dispone de dUTP, las glucosilasas de uracilo-ADN escinden el uracilo incorporado como parte del mecanismo de reparación por escisión de la base4. El nivel elevado de dUTP puede conducir a la muerte celular sin timina a través de la sobreactivación del proceso de reparación del ADN5, para evitar esto, se requiere la actividad de la enzima dUTPasa. El otro papel de la reacción catalizada por dUTPasa es producir dUMP, que es un sustrato para la timidilato sintasa en la ruta de síntesis de novo de dTTP.

Hasta la fecha, se han descrito en la literatura dos isoformas de dUTPasa humana, que se localizan en el núcleo y en la mitocondria, respectivamente, presumiblemente para garantizar la regulación del conjunto de dUTP en estos dos orgánulos que contienen ADN6. Las dos isoformas están codificadas por el gen DUT y generadas por el uso de un promotor alternativo junto con un empalme alternativo7,8. Las dos isoformas difieren solo en el primer exón, ya que la isoforma mitocondrial (DUT-M) contiene una secuencia de orientación mitocondrial, mientras que la isoforma nuclear (DUT-N) contiene una señal de localización nuclear7,9,10. Las dos isoformas de dUTPase fueron descritas por Ladner et al. con análisis de transferencia Northern y Western a nivel de ARNm y proteína, respectivamente7. Los niveles de expresión de ARN de las isoformas en células de fibroblastos de pulmón humano 34Lu también se investigaron en condiciones de inanición de suero, lo que obliga a las células a salir del ciclo celular y entrar en un estado de reposo. Según Ladner et al., esta transición conduce a una disminución drástica en la expresión de la isoforma DUT-N dUTPase, sin cambios en el nivel de la isoforma DUT-M.

Estudios recientes de secuenciación de alto rendimiento predijeron la supuesta presencia de dos isoformas adicionales en humanos, denominadas DUT-3 (UniProt ID: A0A0C4DGL3, NCBI RefSeq ID: NM_001025249.1) y DUT-4 (UniProt ID: H0YNW5, NCBI RefSeq ID: NM_001330286.2) en el presente trabajo. Las bases de datos de secuencias sugirieron que la tercera isoforma sugerida (DUT-3) no contiene ninguna señal de localización, por lo que lo más probable es que se retenga en el citosol. La parte aguas arriba de la región 5' UTR de DUT-3 es idéntica a la de DUT-M, sin embargo, la secuencia líder mitocondrial, presente en el primer exón de la isoforma DUT-M, está ausente en la isoforma DUT-3. Se predijo que la cuarta isoforma sugerida (DUT-4) se parecería mucho a la isoforma DUT-N, y solo se diferenciaría en unos pocos aminoácidos en el extremo N-terminal. El primer exón de esta isoforma se encuentra aguas arriba de las otras isoformas en el genoma, por lo tanto, su expresión puede estar impulsada por un promotor alternativo para una posible regulación alterada de esta isoforma. Aún no se han informado datos sobre los niveles de expresión fisiológica o las funciones de estas dos nuevas isoformas de dUTPasa humana.

Aquí presentamos datos de expresión génica de las cuatro isoformas de dUTPasa humana en varias líneas celulares humanas normales y cancerosas para comprender mejor el papel fisiológico de las nuevas isoformas. RT-qPCR fue nuestro método de elección para identificar las dos nuevas isoformas y cuantificar la expresión de ARNm de las cuatro isoformas por separado en varias líneas celulares. Las ventajas de RT-qPCR incluyen su excelente especificidad, amplio rango dinámico lineal, excelente sensibilidad y reproducibilidad11,12,13,14,15. Para desarrollar un método de RT-qPCR confiable para el análisis de la expresión génica, se requiere una optimización exhaustiva y el uso de genes de referencia apropiados16,17,18. En un artículo anterior, identificamos nuevos genes de referencia en las mismas líneas celulares humanas normales y cancerosas que usamos en este estudio19. Además, usamos el mismo enfoque y realizamos los mismos pasos de optimización para desarrollar un método RT-qPCR para el análisis de la expresión génica de las isoformas de dUTPasa.

Nuestro objetivo fue determinar el nivel de expresión de ARNm de las isoformas de dUTPasa específicamente. Primero, investigamos las bases de datos Ensemble, UniProt y NCBI Reference Sequences (RefSeq) y también tuvimos en cuenta el proyecto Consensus CDS (CCDS). En la base de datos de Ensemble, están presentes 8 isoformas que codifican proteínas y 3 que no codifican proteínas, de las cuales 9 tienen identificadores UniProt (P33316 [DUT-M], P33316-2 [DUT-N], A0A0C4DGL3 [DUT-3], H0YNW5 [DUT-4], H0YNJ9, H0YKC5, H0YMP1, H0YMM5, H0YKI0). Realizamos la alineación de secuencias de proteínas múltiples con la herramienta en línea Clustal Omega utilizando la configuración predeterminada. La Fig. 1 complementaria muestra los resultados de la alineación. La enzima dUTPasa tiene cinco motivos conservados entre eucariotas, procariotas, virus de ADN y retrovirus2. De las 9 isoformas descritas en la base de datos UniProt, solo 4 contienen todos los motivos conservados, incluidas las isoformas bien conocidas DUT-N y DUT-M, y dos isoformas nuevas, denominadas DUT-3 y DUT-4 en el presente artículo. . Además, solo estas 4 isoformas están presentes en la base de datos NCBI RefSeq (NM_001025248.2 [DUT-M], NM_001948.4 [DUT-N], NM_001025249.1 [DUT-3] y NM_001330286.2 [DUT-4]) y tener identificadores CCDS (CCDS32231 [DUT-M], CCDS45255 [DUT-N], CCDS45256 [DUT-3] y CCDS81879 [DUT-4]). La base de datos de CCDS contiene secuencias que se anotan de manera uniforme y son de alta calidad. Además, investigamos las isoformas de dUTPasa humana en la base de datos PeptideAtlas20. Además de las isoformas canónicas DUT-N y DUT-M, las únicas proteínas con una cobertura peptídica del 100 % son DUT-3 y DUT-4. Cobertura peptídica de las otras isoformas hipotéticas incompleta, cuestionando la existencia celular de estas proteínas. En resumen, nuestro objetivo fue investigar solo cuatro isoformas funcionales: DUT-M, DUT-N, DUT-3 y DUT-4.

La figura 1A muestra la región promotora de la secuencia genómica del gen DUT. Todas las isoformas de dUTPasa se generan mediante el uso de promotores alternativos y empalmes alternativos; sin embargo, todas las isoformas comparten el mismo extremo 3' a nivel de ARNm y el extremo C correspondiente a nivel de proteína. Además de determinar los niveles de expresión génica de las cuatro isoformas de dUTPasa, también buscamos determinar la expresión de todas las isoformas juntas (DUT-all) mediante el diseño de pares de cebadores ubicados en la secuencia común. La explicación detallada del diseño del cebador utilizado para la determinación específica de la isoforma se puede encontrar en Materiales y métodos. La Tabla 1 contiene parámetros clave de los cebadores utilizados en este estudio. La Figura 1B muestra el.

Secuencia genómica parcial (A) y secuencias proteicas de las isoformas de dUTPasa (B). Panel (A): el primer exón de la isoforma DUT-4 se muestra en naranja, el primer exón de la isoforma DUT-3 se muestra en azul claro. El primer exón de la isoforma DUT-M contiene el primer exón de la isoforma DUT-3 (azul claro) y también contiene el segmento de secuencia azul oscuro, exclusivo de la isoforma DUT-M. El primer exón de la isoforma DUT-N se muestra en segmentos de secuencia rojos y verdes, donde la secuencia en rojo es exclusiva de la isoforma DUT-N, mientras que la secuencia en verde es común a todas las isoformas. Las secuencias de cebadores utilizadas en RT-qPCR están subrayadas. El cebador directo de extensión de intrones diseñado para la isoforma DUT-3 se muestra en fondo gris. El cebador inverso común se muestra en fondo amarillo. Los sitios de iniciación de la traducción (ATG) se muestran en texto sombreado en cursiva coloreado como la isoforma correspondiente (DUT-M, azul oscuro; DUT-N, rojo; DUT-3, azul claro; DUT-4, naranja). (B) Secuencia proteica de las isoformas de dUTPasa. El segmento peptídico correspondiente al primer exón está coloreado según la secuencia genómica, las demás secuencias exónicas están en negro. La secuencia de color verde oscuro es común para todas las isoformas excepto para DUT-3. La secuencia de color verde claro es común a todas las isoformas. La señal de localización nuclear central (KRAR) está subrayada. La figura fue creada con Microsoft Office 2013.

En nuestro artículo anterior, identificamos genes de referencia apropiados para la normalización de la expresión génica relativa medida con RT-qPCR19. En nuestro estudio actual usamos las mismas muestras de ARN preparadas previamente. Preparamos tres réplicas biológicas de muestras de ARN de 20 líneas celulares normales y de cáncer humano. En breve, se cultivaron y recolectaron líneas celulares normales y cancerosas a partir de tres réplicas biológicas. Después de la extracción, se investigó la integridad de las muestras de ARN con electroforesis en gel de agarosa. Dos bandas distintas eran visibles en la imagen del gel de agarosa, que corresponden a las subunidades de ARN ribosómico 18S y 28S, lo que indica falta de degradación y contaminación de ADN genómico, por lo tanto, una buena calidad general de las muestras de ARN preparadas. Para determinar la concentración y la pureza de las muestras de ARN, se realizaron mediciones NanoDrop. Las proporciones 260/280 estaban en el rango de 2,02 a 2,11, lo que demuestra la falta de contaminación por proteínas. Las relaciones de absorbancia 260/280 y 260/230 y los rendimientos de ARN junto con los resultados de la electroforesis en gel se resumen en nuestro artículo anterior como material complementario19.

El rendimiento de la reacción de transcripción inversa (RT) depende en gran medida de la enzima transcriptasa inversa, la estrategia de cebado y la cantidad de ARN en la reacción21,22,23. Es fundamental trabajar dentro del rango dinámico lineal de la reacción de RT para obtener resultados fiables de expresión génica con qPCR. La investigación de cada ARN objetivo es crucial, incluidos los objetivos de interés y los genes de referencia también. Para los genes de referencia utilizados en este estudio, se realizó el mismo proceso de optimización que se analiza a continuación y los resultados se publicaron en nuestro artículo anterior19. Comparamos dos kits de transcripción inversa disponibles comercialmente: el kit de síntesis de ADNc de primera cadena Maxima para RT-qPCR y el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad. Después de preparar una serie de diluciones cuádruples de 6 puntos a partir de una muestra de ARN, se realizó la reacción de transcripción inversa utilizando cada kit. La cantidad de ARN total en la reacción osciló entre 50 y 1600 ng. Los puntos más y menos concentrados quedaron fuera del rango dinámico lineal; sin embargo, la linealidad se confirmó en el rango entre 100 y 800 ng de ARN para todos los objetivos, incluidos los genes de referencia (Fig. 2). Realizamos una regresión lineal de mínimos cuadrados al promedio de las réplicas técnicas dentro del rango de 100 a 800 ng de ARN. El kit de síntesis de ADNc Maxima First Strand para RT-qPCR dio como resultado valores de Cq más bajos que indican una mejor eficiencia de transcripción inversa para todos los objetivos, incluidos los genes de referencia. En el caso de la isoforma DUT-M, la pendiente de la línea ajustada lineal fue definitivamente más plana usando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad, mientras que usando el kit de síntesis de ADNc de primera hebra Maxima para RT-qPCR, la pendiente de la línea ajustada lineal fue adecuado. Utilizando el primer kit, la sensibilidad de la determinación de la isoforma DUT-M estaría claramente comprometida. En consecuencia, para experimentos adicionales, se seleccionó el kit de síntesis de ADNc de la primera cadena Maxima para RT-qPCR y se usaron 200 ng de ARN total.

Optimización de la reacción de transcripción inversa. Los valores de Cq resultantes de las mediciones de qPCR de series de dilución de ARN se muestran comparando el kit de síntesis de ADNc de primera cadena Maxima para RT-qPCR (líneas negras) y el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (líneas grises). En cada punto de concentración se representan tres réplicas técnicas de ambos kits como círculos huecos. Se realizó una regresión lineal de mínimos cuadrados al promedio de las réplicas técnicas en el rango de cantidad de ARN de 100 a 800 ng por reacción. Los gráficos individuales para (A) DUT-M, (B) DUT-N, (C) DUT-3, (D) DUT-4 y para (E) DUT-todos se crearon con OriginPro 2018 (OriginLab Corp.) y el la figura se ensambló con CorelDRAW Graphics Suite 2020 (Corel Corporation).

Para la cuantificación precisa de la expresión de los genes diana, es crucial determinar la eficacia de la qPCR para cada diana; además, los métodos de qPCR precisos y robustos se caracterizan por una alta eficacia24. Se prepararon series de dilución de productos de PCR y se usaron como plantilla en las siguientes reacciones de qPCR usando tres réplicas técnicas. Con este enfoque, se puede investigar un amplio rango de concentraciones; sin embargo, el uso de diluciones en serie de la plantilla de cDNA para determinar la eficiencia tendría en cuenta el efecto matriz25. Por lo tanto, la eficiencia también se determinó con la plantilla de ADNc para la isoforma DUT-N (97,7 %) y el objetivo DUT-all (100 %). Al comparar los dos enfoques, no encontramos una diferencia considerable en los valores de eficiencia: 97 % para la isoforma DUT-N y 96,1 % para el objetivo DUT-all usando productos de PCR como plantilla. Los valores de Cq resultantes se trazaron frente a la dilución aplicada y se realizó una regresión lineal de mínimos cuadrados al promedio de las réplicas técnicas (Figura complementaria S2). Los valores de eficiencia se calcularon a partir de la inclinación de la línea ajustada26. Los valores de eficiencia y los valores del coeficiente de regresión se resumen en la Tabla 1.

Para verificar la especificidad de los productos de PCR con respecto a las cuatro isoformas, enviamos productos de PCR para la secuenciación de Sanger; sin embargo, como la longitud de todos los productos de PCR está por debajo de los 90 pares de bases, se aplicó un diseño de PCR anidado27. Se generó un producto de PCR más largo para cada objetivo con otro cebador inverso y el cebador directo adecuado y estos productos se purificaron y analizaron con secuenciación de Sanger. La secuencia de los productos de PCR más largos era idéntica a la secuencia correspondiente en las bases de datos públicas. Estos productos de PCR más largos contienen la secuencia de los respectivos productos de PCR de ronda única. Luego, los productos secuenciados se diluyeron y se usaron como plantilla en una segunda ronda de PCR, usando los cebadores enumerados en la Tabla 1, además de una plantilla de ADNc humano. La identidad de los dos productos de PCR de la reacción de PCR anidada y de ronda única se evaluó comparando los resultados del análisis de la curva de fusión y la electroforesis en gel de agarosa. Dado que las curvas de fusión eran idénticas (Figura complementaria S3) y las bandas aparecían en la misma posición en el gel de agarosa (Figura complementaria S4), concluimos que cada producto de PCR es específico para el objetivo previsto.

En nuestro trabajo anterior, investigamos 12 genes de referencia candidatos en las mismas líneas celulares humanas normales y cancerosas que usamos en el presente estudio19. Identificamos SNW1 y CNOT4 como nuevos genes de referencia candidatos basados en los datos del gen de la línea celular RNA HPA de The Human Protein Atlas28. Junto con los genes de referencia ampliamente utilizados (ACTB, GAPDH, IPO8, PPIA, PUM1, RPL30, TBP y UBC), también incluimos HNRNPL y PCBP1 en nuestro estudio como lo sugieren Jo et al.29. Se aplicaron varios enfoques para evaluar los resultados, como los métodos GeNorm, NormFinder, BestKeeper y Comparative ΔCt. Para una normalización confiable, se recomienda el uso de al menos dos genes de referencia para minimizar el sesgo experimental16,30,31. Con base en nuestros resultados, sugerimos el uso de IPO8, PUM1, HNRNPL, SNW1 y CNOT4 como genes de referencia estables19, en consecuencia, usamos este conjunto de genes como referencias para el análisis de expresión génica de las isoformas de dUTPasa. Para evaluar el efecto de la privación de suero, se usaron CNOT4, PUM1 y PCBP1 como genes de referencia. Secuencias de proteínas para las isoformas de dUTPasa, que están coloreadas de acuerdo con la secuencia genómica.

Después de preparar tres réplicas biológicas de muestras de ARN de nuestro conjunto de cáncer humano y líneas celulares normales, se investigó la expresión de las isoformas de dUTPasa, así como el objetivo DUT-all. Para ello, la cantidad de ARN total utilizada en la reacción de transcripción inversa y el volumen de ADNc amplificado en la reacción de qPCR se mantuvieron constantes. Utilizamos el método ΔΔCq para el cálculo de los valores de expresión génica aplicando IPO8, PUM1, HNRNPL, SNW1 y CNOT4 como genes de referencia. Las curvas de amplificación para las líneas celulares que tienen la expresión normalizada relativa más alta y más baja de las isoformas de dUTPasa y el objetivo DUT-all se ilustran en la Figura complementaria S5. Según los valores de Cq, la isoforma DUT-N tiene la expresión más alta de las isoformas dUTPase en todas las líneas celulares investigadas, seguida de la isoforma DUT-M y la isoforma DUT-3. La isoforma DUT-4 tiene la expresión más baja de las isoformas de dUTPasa, sin embargo, las isoformas DUT-3 y DUT-4 se expresan en un grado similar en algunas de las líneas celulares investigadas.

Los valores de expresión normalizados relativos para cada isoforma de dUTPasa y el objetivo DUT-all para las veinte líneas celulares investigadas se ilustran en la Fig. 3A. Los valores de expresión normalizados relativos junto con la desviación estándar se resumen en la Tabla complementaria S1. Se encontró que la expresión normalizada relativa de las isoformas DUT-M y DUT-3 era más alta en las líneas celulares U-937, RPMI-8226 y U-251MG y más baja en la línea celular MDA-MB-231. En el caso de DUT-N, DUT-4 y DUT-all target, la expresión relativa normalizada fue considerablemente alta en las células HL-60(TB), U-937, MOLT-4, RPMI-8226 y U-251MG. líneas. Al comparar la línea de células madre pluripotentes humanas HUES-9 y la línea de células madre pluripotentes inducidas XCL-1, la expresión relativa normalizada de cada isoforma y el objetivo DUT-all no difiere significativamente ya que los valores de p fueron mayores o iguales a 0,4 en todos los casos. Los niveles de expresión de la isoforma DUT-4 mostraron las mayores diferencias entre las líneas celulares, con una diferencia de 50 veces entre el nivel de expresión más alto (U-937) y el más bajo (HCT-116).

Datos de expresión génica normalizados relativos para los objetivos de dUTPasa y análisis de correlación de los valores de Cq. (A) En cada panel, el valor de expresión de la línea celular con la expresión más baja se estableció en 1. La escala del eje y es logarítmica con base 10 y se muestra uniformemente de 1 a 100 en cada panel. La barra de error muestra la desviación estándar de tres réplicas biológicas (n = 3) para cada línea celular. Los colores individuales corresponden a los colores utilizados en la Tabla 2. Los gráficos individuales se crearon con CFX Maestro 2.0 (Bio-Rad). (B) Análisis de correlación de los valores Cq del DUT-N con el objetivo DUT-all y (C) el DUT-M con el objetivo DUT-3. El rango que se muestra en los ejes es constante en ambos gráficos para fines de comparación. Los valores del coeficiente de regresión se determinaron con regresión lineal de mínimos cuadrados para todos los puntos de datos. Los gráficos individuales se crearon con OriginPro 2018 (OriginLab Corp.) y la figura se ensambló con CorelDRAW Graphics Suite 2020 (Corel Corporation).

Para revelar posibles elementos reguladores comunes entre los niveles de expresión relativos de las diferentes isoformas, analizamos la correlación de los valores de Cq de cada combinación de dos objetivos de las isoformas de dUTPase y el objetivo DUT-all (Figura complementaria S6). Encontramos correlación entre los valores de Cq de la isoforma DUT-N y el objetivo DUT-all (Fig. 3B), además, entre las isoformas DUT-M y DUT-3 (Fig. 3C). Ambas correlaciones se caracterizaron con valores de coeficiente de regresión superiores a 0,85 determinados con regresión lineal de mínimos cuadrados a todos los puntos de datos. Por el contrario, todas las demás combinaciones se caracterizaron con valores de coeficiente de regresión por debajo de 0,62, lo que indica falta de correlación. El análisis de correlación proporcionó tres observaciones importantes. Primero, dado que DUT-N tiene la expresión más alta de las isoformas de dUTPasa según las curvas de amplificación, esta isoforma domina la expresión general de dUTPasa, como se refleja en la fuerte correlación entre los patrones de expresión DUT-N y DUT-all. En segundo lugar, teniendo en cuenta que las isoformas DUT-M y DUT-3 se transcriben del mismo promotor, se esperaba la correlación entre estos dos objetivos y este hallazgo fortalece aún más la sugerencia de un promotor común para DUT-M y DUT-3. En tercer lugar, la falta de correlación para cualquier combinación que implique la isoforma DUT-4 argumenta a favor de la presencia de un promotor alternativo que proporciona una regulación independiente y diferente de la expresión de DUT-4.

Dado que la proporción de diferentes isoformas expresadas puede ser importante para el correcto funcionamiento de una célula, investigamos el patrón de las isoformas de dUTPasa expresadas en comparación con la expresión general en líneas celulares normales y cancerosas. Establecimos la expresión normalizada relativa de una muestra biológica replicada de la línea celular MDA-MB-231 en 1. Dividimos los valores de expresión normalizados relativos de cada isoforma con los valores de expresión normalizados relativos DUT-all, y el logaritmo de base 2 de la relación se calculó para proporcionar una distribución normal. Para describir la relación del nivel de expresión de las diferentes isoformas, utilizamos estos valores denominados "indicadores de relación" para enfatizar que los valores numéricos no deben ser considerados, solo las diferencias observadas son de interés. Como la varianza de las tres muestras replicadas biológicas medidas en diferentes líneas celulares no es igual, realizamos el análisis no paramétrico de Kruskal-Wallis seguido de comparaciones por pares de Conover-Iman con la corrección de Bonferroni usando XLSTAT. Para cada isoforma, se compararon los indicadores de proporción de líneas celulares normales con el grupo de líneas celulares cancerosas. La Figura 4 ilustra los resultados.

Relación del nivel de expresión normalizado relativo de las diferentes isoformas (A) DUT-M, (B) DUT-N, (C) DUT-3, (D) DUT-4 con la expresión general de dUTPasa medida con el objetivo DUT-all . Todas las líneas celulares de cáncer se incluyeron en un grupo que se usó para comparaciones por pares con cada línea celular normal. Las líneas de células cancerosas son de color rojo. Los colores individuales para las líneas celulares normales corresponden a los colores utilizados en la Tabla 2. El eje y muestra indicadores de relación que son la relación entre el valor de expresión normalizado relativo de cada isoforma y el valor de expresión general en una escala logarítmica. La media de cada grupo se indica con líneas negras. Los valores de p indican los resultados de las comparaciones por pares. Se encontró que las diferencias eran significativas a p < 0,0018 y se indican con asteriscos (*). Los gráficos individuales se crearon con OriginPro 2018 (OriginLab Corp.) y la figura se ensambló con CorelDRAW Graphics Suite 2020 (Corel Corporation).

En el caso de las isoformas DUT-N y DUT-4 no se encontraron diferencias significativas. Como DUT-N tiene la expresión más alta, se esperaba que la relación de esta isoforma con la expresión general fuera casi igual entre las líneas celulares. La isoforma DUT-4 tiene la expresión más baja, pero su indicador de proporción tampoco muestra cambios significativos, es bastante estable entre las líneas celulares normales. Sin embargo, en el caso de las isoformas DUT-M y DUT-3, se observaron diferencias entre las líneas celulares normales. No se encontró que las líneas celulares HEK293, HUES-9 y XCL-1 fueran significativamente diferentes del grupo de líneas celulares cancerosas. La línea de células madre pluripotentes humanas HUES-9 y la línea de células madre pluripotentes inducidas XCL-1 mostraron valores indicadores de relación similares, no elevados, lo que argumenta la similitud de estas líneas celulares. El HEK293 es una línea celular precursora parcialmente diferenciada transformada con Ad5, y esta puede ser la razón de su divergencia del grupo celular normal. Por el contrario, las líneas celulares normales diferenciadas HMEC, HUVEC/TERT2, MRC-5 y HFF-1 mostraron valores significativamente aumentados. Los valores del indicador de relación para las isoformas DUT-M y DUT-3 demostraron cambios paralelos que argumentan aún más a favor de su promotor común.

La inanición de suero es un tratamiento comúnmente aplicado en varios campos de investigación que investigan líneas celulares humanas para revelar los mecanismos moleculares involucrados en diferentes procesos celulares, vías metabólicas y efectos de los tratamientos farmacológicos32. Previamente, Ladner et al. investigaron la expresión relativa de ARNm de DUT-N y DUT-M tras la privación de suero en células de fibroblastos de pulmón humano normal 34Lu. utilizando la técnica de transferencia Northern7. Los resultados de este estudio mostraron que la expresión de ARNm de DUT-M era constitutiva, sin embargo, la expresión de ARNm de DUT-N disminuyó significativamente con la privación de suero. Fue de interés investigar la expresión de las dos nuevas isoformas de dUTPasa, así como DUT-N y DUT-M y también el objetivo DUT-all bajo el tratamiento de inanición de suero en varias líneas celulares para decidir si los efectos son celulares. dependiente de la línea. Teniendo en cuenta nuestro conjunto de 13 líneas celulares de cáncer humano, la detención del ciclo celular no se puede lograr de manera eficiente para la mayoría de las líneas celulares porque el crecimiento de las células no se ve afectado o la viabilidad celular se ve muy comprometida por la falta de suero. Por lo tanto, seleccionamos tres líneas celulares de cáncer humano, HeLa, A-549 y MDA-MB-231, para las cuales este tratamiento es aplicable33. Se aplicó privación de suero a tres cultivos replicados biológicos durante 2 días en el caso de la línea celular MDA-MB-231 y durante 4 días en el caso de las líneas celulares HeLa y A-549. La distribución de fases del ciclo celular de los cultivos celulares tratados y no tratados se analizó con citometría de flujo. Se observó una elevación de la proporción de células en la fase G1 en paralelo a una disminución en la proporción de células en las fases G2 y S tras la inanición de suero (Figura complementaria S7). La proporción de células en fase G1 en células privadas de suero fue superior al 70% en todos los casos, por lo tanto, se logró con éxito la detención del ciclo celular.

La expresión génica de las isoformas de dUTPasa, así como el objetivo DUT-all, se determinó con análisis RT-qPCR comparando las células privadas de suero con las células no tratadas (Fig. 5). Para la normalización, se seleccionaron tres genes de referencia (CNOT4, PUM1 y PCBP1) en base a nuestro artículo anterior que investigaba los genes de referencia19. La expresión relativamente normalizada de la isoforma DUT-4 se mantuvo constante durante la privación de suero en las tres líneas celulares investigadas. En el caso de las isoformas DUT-M y DUT-3, que se transcriben del mismo promotor, la expresión relativa normalizada aumentó significativamente en todos los casos. La isoforma DUT-N tiene la expresión más alta de las isoformas dUTPase según las curvas de amplificación observadas. Tras la privación de suero, la expresión relativamente normalizada de la isoforma DUT-N permaneció constante en las células HeLa, sin embargo, disminuyó significativamente en las células A-549 y MDA-MB-231. La expresión normalizada relativa del objetivo DUT-all cambió en la misma dirección que la isoforma DUT-N, sin embargo, se encontró que el alcance del cambio era menor. Este fenómeno puede deberse al hecho de que la expresión de las isoformas DUT-M y DUT-3 aumenta con la falta de suero y esto puede compensar la disminución en la expresión de la isoforma DUT-N. Los valores de expresión relativos junto con las barras de error para las muestras no tratadas y privadas de suero y los valores p se resumen en la Tabla complementaria S2.

Expresión relativa normalizada de las isoformas de dUTPasa (A) DUT-M, (B) DUT-N, (C) DUT-3, (D) DUT-4 y (E) el objetivo DUT-all en HeLa (rojo), A -549 (naranja) y MDA-MB-231 (amarillo) líneas celulares tras la inanición de suero y (F) análisis de transferencia Western de las proteínas dUTPasa en la línea celular U-937. (AE) NT, sin tratar (columnas simples); SS, hambre de suero (columnas rayadas). Los colores individuales corresponden a los colores utilizados en la Tabla 2. La escala del eje y es logarítmica con base 10 y se muestra uniformemente del 1 al 10 en cada panel. En cada panel, el grupo biológico con la expresión más baja se estableció en 1. Las barras de error muestran la desviación estándar de tres réplicas biológicas (n = 3) para cada línea celular. El número de asteriscos indica una posibilidad creciente de que la expresión génica cambie con la falta de suero. * p < 0,1, ** p < 0,01, *** p < 0,001 según lo calculado por el software CFX Maestro. (F) Tres muestras técnicas replicadas para la detección de proteínas dUTPasa mediante transferencia Western. En el lado izquierdo, las proteínas dUTPasa diana y la proteína actina como referencia se representan con flechas. En el lado derecho se indican los valores de peso molecular teórico correspondientes. Las imágenes individuales de tamaño completo están disponibles en la Figura complementaria S8. Los gráficos individuales para (A) DUT-M, (B) DUT-N, (C) DUT-3, (D) DUT-4 y para (E) DUT-todos se crearon con CFX Maestro 2.0 (Bio-Rad). (F) La imagen se creó con el software Image Lab 4.1 (Bio-Rad). La figura fue ensamblada usando CorelDRAW Graphics Suite 2020 (Corel Corporation).

Un hallazgo importante del análisis de los efectos de la inanición de suero en los niveles de expresión de las isoformas de dUTPasa es que las perturbaciones inducidas por la inanición se producen de manera específica en la línea celular. Es importante destacar que, como se muestra en la Figura complementaria S7, en todas las líneas celulares hemos observado la detención del ciclo celular inducida por el hambre en grados similares. Por lo tanto, las diferentes perturbaciones observadas en los niveles de expresión de las isoformas de dUTPasa no se deben a diferencias en la detención del ciclo celular. El resultado más sorprendente es que la línea celular HeLa muestra una fuerte resiliencia frente a la falta de suero y mantiene la isoforma DUT-N en un alto nivel de expresión, en contraste con las otras líneas celulares (Fig. 5). El concepto principal descrito en la literatura es que la dUTPasa tiene una doble función: es esencial tanto para eliminar dUTP para la desinfección de la piscina de dNTP como para producir dUMP para la síntesis de timidilato de novo. De acuerdo con esto, la isoforma DUT-N más abundante se expresa principalmente durante la fase S del ciclo celular y de manera dependiente del crecimiento de manera similar a otros miembros de la biosíntesis de precursores de nucleótidos y de la vía de replicación del ADN7,35,36, 37. Durante la detención del ciclo celular, la proliferación se detiene, por lo que las células no requieren dNTP para la replicación. Sin embargo, la síntesis de reparación todavía puede ocurrir. La disminución observada en la expresión de la isoforma DUT-N tras la privación de suero está de acuerdo con el papel de la enzima. Nuestros datos actuales, sin embargo, también indican que aunque este esquema puede ser típico, en algunas líneas de células cancerosas se puede perder la estrecha regulación de la expresión de dUTPasa a medida que las células cancerosas pierden sensibilidad a las moléculas de señalización durante la proliferación continua. En el caso de la línea celular HeLa, la proliferación se detiene, sin embargo, se conserva el alto nivel de expresión de la isoforma DUT-N.

Se demostró previamente que la isoforma DUT-M se expresaba de manera constitutiva tanto a nivel de mRNA como de proteína en células 34Lu7. Por el contrario, encontramos que en las tres líneas celulares investigadas la expresión de la isoforma DUT-M aumentó significativamente tras la inanición de suero. Este efecto puede ser importante para la biosíntesis de timidilato mitocondrial y para una mejor conservación de la integridad del ADN mitocondrial tras la inanición de suero. Concluimos que la expresión de las isoformas DUT-N y DUT-M está regulada por mecanismos completamente diferentes y también depende de las líneas celulares. También encontramos que el nivel de expresión de la isoforma DUT-3 demuestra cambios paralelos a los niveles de expresión DUT-M en todas las líneas celulares investigadas, argumentando aún más a favor de su promotor común. La falta de cambios significativos en el nivel de expresión de la isoforma DUT-4 (que contiene el mismo NLS que DUT-N) indica que las tres líneas celulares que hemos investigado a este respecto presumiblemente conservan la localización nuclear de dUTPase incluso en la inanición.

Además de determinar la expresión de ARNm de las isoformas de dUTPasa, también investigamos la expresión de proteínas de las isoformas mediante análisis de transferencia Western (Fig. 5F) utilizando gel de acrilamida al 16%. La imagen original con un tiempo de exposición de 1 s, la imagen con un tiempo de exposición de 40 s y la imagen fusionada con la escalera de proteínas están disponibles como Figura complementaria S8. Usamos la línea celular U-937, que tiene la expresión más alta de las isoformas DUT-N y DUT-4 y, al mismo tiempo, tiene una expresión alta de las isoformas DUT-M y DUT-3 en comparación con otras líneas celulares investigadas en este estudio. Usamos la actina como referencia. Demostramos tres bandas distintas correspondientes a las isoformas DUT-M, DUT-N y DUT-3, en orden de masa molecular decreciente. Calculamos el peso molecular teórico de las isoformas de dUTPasa utilizando la herramienta Protein Molecular Mass (https://www.bioinformatics.org/sms/prot_mw.html), además, también calculamos los valores empíricos para las tres isoformas detectadas en función de la bandas de la escalera de proteínas. La isoforma DUT-N tiene la expresión de ARNm más alta y la expresión de proteína más alta como se ve como una banda inmensa en la transferencia. La masa molecular teórica de la isoforma DUT-4 (17,83 kDa) es casi igual a la masa molecular teórica de la isoforma DUT-N (17,75 kDa), por lo tanto, la isoforma DUT-4 no se puede detectar mediante la técnica de transferencia Western. La masa molecular teórica y empírica de la isoforma DUT-M (19,35 kDa y 19,38 kDa, respectivamente) y de la isoforma DUT-N (17,75 kDa y 17,68 kDa, respectivamente) son razonablemente similares. La masa molecular empírica (15,41 kDa) de la tercera banda detectada es esencialmente la misma que la masa molecular teórica (15,4 kDa) de la isoforma DUT-3, lo que confirma la identidad de esta nueva isoforma.

dUTPase es una enzima ubicua presente en todos los organismos eucariotas investigados hasta ahora, desde plantas hasta animales34, pasando por levaduras. La esencialidad de esta enzima se ha demostrado mediante el uso de modelos knock-out, mientras que los modelos knock-down demuestran auxotrofia o sensibilidad a los agentes que dañan el ADN4,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44, 45,46,47. En contraste con su naturaleza indispensable, la distribución de isoformas de dUTPase se investigó solo en unos pocos organismos modelo. En ratón, se describió una isoforma nuclear y otra mitocondrial de dUTPasa, similar a la de los humanos6,7,27. En Drosophila melanogaster, se demostró que existe una isoforma de dUTPasa nuclear y otra citoplasmática48,49. En Saccharomyces cerevisiae, solo se demostró la presencia de una difosfatasa bifuncional dITP/dUTP, sin embargo, no se estudió su localización50. En Dictyostelium discoideum, solo se identificó una isoforma de dUTPasa que se localiza únicamente en las mitocondrias51. En este trabajo hemos identificado dos isoformas adicionales para la enzima dUTPasa a nivel de ARNm en una amplia variedad de líneas celulares humanas de diferentes orígenes (Fig. 6). Es importante destacar que identificamos una de estas nuevas isoformas a nivel de proteína, que carece de cualquier señal de localización organelar (DUT-3). Nuestros datos ahora sugieren que la presencia de dUTPasa en el citoplasma puede ser un fenómeno más general y no solo un caso excepcional en la mosca de la fruta. En realidad, dado que los dNTP pueden difundirse libremente a través del poro nuclear, no existe una necesidad explícita y directa de que la enzima dUTPasa sea nuclear. Sin embargo, la presencia nuclear de esta enzima desinfectante puede proporcionar un control más eficiente de la eliminación de dUTP durante la síntesis de ADN y la dUTPasa también puede interactuar con otras proteínas nucleares52.

Figura esquemática que ilustra los principales aspectos de este estudio. El color azul oscuro indica la isoforma DUT-M, el color rojo indica la isoforma DUT-N y las nuevas isoformas DUT-3 y DUT-4 están coloreadas de azul claro y naranja, respectivamente. En la esquina superior derecha se muestran curvas de amplificación representativas. El tamaño de fuente del nombre de las isoformas corresponde a sus niveles de expresión relativos. La localización celular hipotética de las isoformas de dUTPasa se representa mediante líneas discontinuas. La figura se creó con CorelDRAW Graphics Suite 2020 (Corel Corporation).

A la luz de nuestro presente trabajo, el repertorio de dUTPasa en células humanas es más extenso de lo que se pensaba anteriormente e incluye cuatro isoformas bajo la regulación de tres promotores diferentes según nuestros resultados. Queda por dilucidar si también se puede identificar una variedad adicional de isoformas de dUTPasa en otras especies. Un promotor reacciona sensiblemente al estrés por inanición reduciendo así los niveles de ARNm de dUTPasa nuclear y total hasta cinco veces. Sin embargo, en la línea celular HeLa se pierde esta fuerte regulación, lo que potencialmente permite un mejor control contra la uracilación del ADN incluso en estado de reposo (p. ej., en la síntesis de reparación). Entre los tres promotores, el que impulsa la síntesis de la isoforma nuclear de dUTPasa DUT-4 muestra el carácter más constitutivo, lo que refuerza la importancia de la presencia nuclear de dUTPasa.

Nuestro objetivo era utilizar líneas celulares populares ampliamente utilizadas en numerosos estudios en la literatura. Anteriormente, resumimos los aspectos utilizados para la selección de 13 cáncer y 7 líneas celulares humanas normales 19, también se usaron exactamente las mismas líneas celulares en este estudio. Las líneas de células cancerosas incluyen HeLa, MCF-7, A-549, K-562, HL-60(TB), HT-29, MDA-MB-231, HCT 116, U-937, SH-SY5Y, U-251MG , MOLT-4 y RPMI-8226, mientras que las líneas celulares normales incluyen HEK293, MRC-5, HUVEC/TERT2, HMEC, HFF-1, HUES-9 y XCL-1.

Las líneas celulares HEK293 (CRL-1573), HeLa (CCL-2), SH-SY5Y (CRL2266), U-937 (CRL-1593.2) y la línea celular de fibroblastos de prepucio humano HFF-1 (SCRC-1041) se adquirieron de ATCC . Las líneas celulares A-549, HCT 116, HL-60(TB), HT-29, K-562, MCF-7, MDA-MB-231, MOLT-4, MRC-5 y RPMI-8226 se obtuvieron de la Programa de Terapéutica del Desarrollo del Instituto Nacional del Cáncer (Institutos Nacionales de Salud). Las células HMEC inmortalizadas con TERT se adquirieron del Departamento de Servicios Celulares del Instituto Francis Crick. HUVEC/TERT2 y MRC-5 fueron un generoso regalo de József Tóvári. Douglas Melton (HHMI) proporcionó amablemente la línea de células madre pluripotentes humanas HUES-9. La línea de células madre pluripotentes inducidas XCL-1 reprogramadas a partir de células de sangre de cordón umbilical CD34+ mediante vectores episomales, se obtuvieron de XCellScience (Novato, CAXIP-001-1 V). A-549, HCT 116, HEK293, HeLa, HL-60(TB), HT-29, K-562, MCF-7, MDA-MB-231, MOLT-4, RPMI-8226, SH-SY5Y, U- Se cultivaron células 251MG y U-937 en medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Gibco, 72400-021) suplementado con suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor al 10 % (Gibco, 10500064) y estreptomicina con penicilina al 1 % (Gibco , 15140-122). Las células HFF-1 se mantuvieron en placas recubiertas de gelatina (Sigma) en medio DMEM-glutamax completado con FBS al 10% (Thermo Scientific). Las células HMEC se cultivaron en MEGM Mammary Epithelial Cell Growth Medium BulletKit (Lonza, CC-3150). Las células HUVEC/TERT2 se cultivaron en EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2 (Lonza, 00190860) complementado con componentes del EGM-2 Endothelial SingleQuots Kit (Lonza, CC-4176). Las células MRC-5 se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (Gibco, 11995-065) suplementado con FBS al 20 % y estreptomicina con penicilina al 1 %. Las células HUES-9 y XCL-1 se mantuvieron en placas de seis pocillos recubiertas con Matrigel (Corning) en medio mTeSR (Stemcell Technologies). Todas las líneas celulares se cultivaron a 37 °C en una incubadora humidificada con una atmósfera de CO2 al 5 %. Todos los cultivos celulares estaban libres de micoplasma según lo determinado por PCR. Las líneas celulares de adhesión se pasaron cuando el cultivo alcanzó una confluencia del 40-50 % para evitar la inhibición por contacto. Las líneas celulares en suspensión se pasaron cada 2 o 3 días. Para la extracción de ARN, las células se recogieron después de 2 días de pase.

Para el tratamiento de privación de suero, las células se cultivaron en medio RPMI 1640 (Gibco, 72400-021) complementado con estreptomicina con penicilina al 1% (Gibco, 15140-122) y sin FBS inactivado por calor al 10%. Después de la inanición de suero, las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Sigma, P3813), se tripsinizaron y se resuspendieron en medio fresco suplementado con EDTA 3 mM (Sigma, E9884), y en el caso de cultivos privados de suero, 10 mg/ml de bovino. albúmina sérica (BSA, Sigma, A7906). Se disolvieron EDTA y BSA en agua MilliQ y las soluciones madre se filtraron en condiciones estériles con la unidad de filtro de membrana Millex-GP Millipore Express PES (Millipore). Las células se centrifugaron a 200 g durante 5 min utilizando una centrífuga Eppendorf MiniSpin (tipo 5452) y se lavaron con PBS.

Las células adhesivas se tripsinizaron con solución de tripsina-EDTA (Sigma, T3924) y se resuspendieron en medio fresco. Los cultivos de células en suspensión y las células adhesivas tripsinizadas se centrifugaron a 200 g durante 5 min utilizando una centrífuga Eppendorf MiniSpin (tipo 5452) y se lavaron dos veces con PBS. El sedimento se resuspendió en tampón RLT (una parte del kit Qiagen RNeasy Plus Mini) complementado con beta-mercaptoetanol al 1 % (Merck) y se lisó mediante agitación vorticial durante 1 min utilizando perlas de vidrio estériles. Las muestras lisadas se mantuvieron a -20 °C hasta su posterior procesamiento. El ARN se extrajo con el kit Qiagen RNeasy Plus Mini siguiendo las recomendaciones del fabricante. La digestión con DNasa en columna se realizó con el conjunto de DNasa libre de RNasa (Qiagen, 79254). El ARN se eluyó en 50 µl de agua libre de nucleasas (Ambion). La concentración y la pureza indicadas por las proporciones 260/280 y 260/230 se determinaron con NanoDrop ND-2000. Para garantizar que se mida la misma cantidad de ARN en la siguiente reacción de transcripción inversa, la concentración de todas las muestras de ARN se fijó en 24 ng/µl y se verificó con NanoDrop. Se realizó electroforesis en gel de agarosa para evaluar la integridad de las muestras de ARN y la posible contaminación del ADN genómico utilizando agarosa al 1 % (Sigma, A9539) y tampón de ejecución TBE. Se mezclaron igualmente 600 ng de ARN con colorante de carga de gel (New England Biolabs, B7024S) y se cargaron en los pocillos del gel. Como marcador se utilizó GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder (Thermo Scientific, SM1331). Se usó Gel Doc XR + Imager (Bio-Rad) para la formación de imágenes. Las muestras de ARN se mantuvieron a -80 °C hasta su posterior procesamiento.

Para evaluar la idoneidad de la reacción de RT, se compararon el kit de síntesis de ADNc Maxima First Strand para RT-qPCR (Thermo Scientific, K1642) y el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems, 4,368,814). Los kits se usaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante y para el kit de síntesis de ADNc Maxima First Strand para RT-qPCR, la reacción de RT se realizó a 65 °C durante 30 min. Se preparó una serie de diluciones dobles de 6 puntos a partir del ARN extraído de células HCT 116 y se introdujo en la reacción de RT con la concentración inicial de 1600 ng/µl. Para otros experimentos, se utilizó el kit de síntesis de ADNc de la primera cadena Maxima para RT-qPCR con 200 ng de ARN introducidos en la reacción. La reacción de RT se realizó en el sistema GeneAmp PCR 2700 de Applied Biosystems. Las muestras de ADNc se mantuvieron a -20 °C hasta su posterior procesamiento.

El sitio de inicio de la transcripción de la isoforma DUT-4 se encuentra aguas arriba del de las otras isoformas (Fig. 1A). Para la detección de la isoforma DUT-4, se diseñó un cebador directo flanqueante de intrones en su primer exón que se muestra en naranja. La isoforma DUT-M probablemente comparte el mismo promotor con la isoforma DUT-3 ya que la transcripción de estas isoformas comienza en la misma posición coloreada en azul claro. La transcripción de la isoforma DUT-M continúa con la secuencia coloreada en azul oscuro, mientras que esta secuencia que corresponde a la secuencia dirigida a la mitocondria está ausente en la isoforma DUT-3. El cebador directo que flanquea al intrón para la isoforma DUT-M se diseñó en este exón. La transcripción de la isoforma DUT-M y DUT-3 continúa con la secuencia coloreada en verde. El cebador directo que abarca intrones para la isoforma DUT-3 está coloreado en gris. La transcripción de la isoforma DUT-N comienza con la secuencia coloreada en rojo y continúa con la secuencia común. Para la detección de la isoforma DUT-N se aplicó un diseño de cebador exónico. La Figura 1B muestra la secuencia proteica de las isoformas de dUTPasa. Todas las isoformas contienen la señal de localización nuclear central (KRAR)10 excepto la isoforma DUT-3, cuyo sitio de iniciación de la traducción se encuentra aguas abajo de la secuencia común verde en negrita.

También apuntamos a determinar el nivel general de expresión de ARNm de dUTPasa (DUT-all). Como la región de codificación común de todas las isoformas de dUTPasa es muy similar a la variante de transcripción 3 (NCBI RefSeq ID: NM_001291368.4) y 4 (NCBI RefSeq ID: NM_001291369.4) de la proteína con dedos de zinc 534 (ZNF534) del Homo sapiens, los pares de cebadores para la secuencia común se diseñaron para ubicarse en la región 3' UTR. Para la amplificación específica de la isoforma DUT-3, los cebadores directos se diseñaron para ubicarse en la unión exón-exón (diseño de expansión de intrones). En el caso de las isoformas DUT-4 y DUT-M, los cebadores directo e inverso se separaron con un intrón (diseño flanqueante de intrones). El diseño del cebador de las isoformas antes mencionadas excluyó la posibilidad de amplificar la contaminación del ADN genómico. La isoforma DUT-N de dUTPase se determinó utilizando un diseño de cebador exónico. Para todos los objetivos, se diseñaron tres o cuatro pares de cebadores y se compararon con la PCR de gradiente de temperatura junto con el análisis de la curva de fusión y la electroforesis en gel de agarosa para garantizar la especificidad de los productos de la PCR. La electroforesis en gel de agarosa se realizó durante la optimización, mientras que el análisis de la curva de fusión se llevó a cabo de forma rutinaria después de cada reacción de PCR. Los productos específicos se indicaron como una única banda nítida en gel de agarosa y se caracterizaron por un único pico con análisis de curva de fusión. En caso de que más de un par de cebadores generara productos específicos, se seleccionó el que tenía el valor de Cq más bajo para experimentos posteriores.

Para diseñar pares de cebadores se utilizó la herramienta de diseño de cebadores NCBI53. La longitud del producto de PCR se limitó a 120 pares de bases (pb)54. Las temperaturas de fusión de los cebadores se establecieron en el rango de 60 a 63 °C. La especificidad se investigó con BLAST con los siguientes parámetros: al menos 5 desajustes totales con objetivos no deseados, incluidos al menos 3 desajustes en los últimos 5 pb en el extremo 3'. Los objetivos con más de 6 discrepancias se ignoraron para la verificación de especificidad. Los cebadores se encargaron a Merck con purificación por desalinización en formato seco y se disolvieron en agua libre de nucleasas siguiendo la recomendación de hacer soluciones de 100 µM. La concentración de las soluciones de imprimación se comprobó con NanoDrop.

La reacción de qPCR se realizó en un volumen final de 10 µL usando MyTaq HS Mix (Bioline, BIO-25046), colorante Evagreen (Biotium, 31000), agua libre de nucleasas, plantilla de ADNc y cebadores apropiados. En cada reacción de qPCR se utilizó 0,1 µl de muestra de ADNc y las concentraciones finales de todos los cebadores fueron 500 nM. Se utilizaron tres réplicas técnicas para cada muestra y cada gen diana. Se midieron dos réplicas técnicas de la reacción de control sin plantilla (NTC) para cada objetivo en cada placa. No se midió aleatoriamente ningún control de transcripción inversa (NRT) para el 25% de las muestras. Los controles de NRT se prepararon a partir de las muestras de ARN utilizando agua libre de nucleasas en lugar de la enzima RT y el tampón de reacción. La diferencia entre los valores de Cq del NRT/NTC y las muestras fue superior a 10 en la mayoría de los casos, y superior a 5 en todos los casos.

Se utilizaron placas de PCR transparentes de 96 pocillos de cubierta dura (Bio-Rad) y película de sellado de placas de PCR Microseal 'B' (Bio-Rad). El ciclo térmico y la detección se realizaron en el sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 (Bio-Rad). El protocolo de ciclo térmico incluye la desnaturalización inicial y la activación de la polimerasa de arranque en caliente a 95 °C durante 5 min, seguida de 50 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 30 s y recocido/extensión a 63 °C durante 30 s. Después de la amplificación, se realizó un análisis de la curva de fusión de 60 °C a 95 °C con un incremento de 0,5 °C cada 5 s. Para comparar las curvas de fusión de los productos de PCR utilizados en la identificación de las isoformas de dUTPasa, el incremento de temperatura se fijó en 0,2 °C.

Para la determinación de los valores de eficiencia de la PCR utilizando productos de PCR, las muestras de ARN extraídas de tres réplicas biológicas de células HCT 116 se agruparon y se introdujeron en reacciones de transcripción inversa para cada objetivo seguido de amplificación con qPCR como se describe anteriormente. Los productos de PCR se analizaron con electroforesis en gel de agarosa utilizando agarosa al 2 % y tampón de ejecución TAE. Los productos de PCR se purificaron del gel utilizando NucleoSpin Gel y PCR Clean-up (Macherey–Nagel, 740609) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Las concentraciones de las soluciones se determinaron con NanoDrop. Se prepararon series de diluciones diez veces de 7 puntos y cada punto de concentración se introdujo en reacciones de qPCR en el rango de concentración final de 100 fg/µl a 0,0001 fg/µl con tres repeticiones técnicas. Los valores de Cq se graficaron contra el logaritmo con base 10 de la concentración y la pendiente de las curvas y se determinaron los coeficientes de regresión y se calcularon los valores de eficiencia de la PCR con la fórmula E(%) = [10^(1/-pendiente)- 1]*100%. Los valores de eficiencia de PCR obtenidos de las mediciones con productos de PCR se usaron para cálculos posteriores.

También determinamos los valores de eficiencia de la PCR utilizando muestras de ADNc para dos objetivos de dUTPasa, DUT-N y DUT-all y, en nuestro artículo anterior, para los objetivos de genes de referencia IPO8, PUM1, SNW1. Para este propósito, se agruparon ADNc derivados de réplicas biológicas de células HCT 116 y se prepararon series de diluciones de 6 puntos de cuatro veces. Los puntos más concentrados contenían 0,3 µl de ADNc en cada pocillo. Se aplicaron tres repeticiones técnicas para cada blanco y cada punto de concentración. Los resultados se evaluaron como se discutió anteriormente.

Inicialmente, para verificar la especificidad de los productos de la PCR, se agruparon ADNc derivados de réplicas biológicas de células HCT 116 y se introdujeron en reacciones de qPCR. La secuenciación de Sanger se realizó para productos de PCR más largos para cada isoforma de dUTPasa. Se utilizó el siguiente cebador inverso, junto con los cebadores directos apropiados para cada objetivo de dUTPasa, para generar los productos de PCR más largos: 5'-TGGTATTGTGTAATCATAGGCACTGT-3'. Usando estos objetivos como plantillas, se realizó una segunda ronda de PCR anidada y los productos de PCR se compararon con los productos de PCR de reacciones de PCR de una sola ronda con electroforesis en gel de agarosa y análisis de curva de fusión. Para la electroforesis en gel de agarosa se utilizó agarosa al 2% y tampón de corrida TAE. Para cada gen, se mezclaron de 2 a 4 µl de productos de PCR con colorante de carga y se cargaron en el gel. Se utilizaron como marcadores GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder y GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder (Thermo Scientific, SM0321). Se usó Gel Doc XR + Imager para la formación de imágenes. El análisis de la curva de fusión se realizó después de cada amplificación. En caso de que las curvas de fusión mostraran la formación de un producto específico, los pocillos se excluyeron del análisis.

La distribución de fases del ciclo celular se analizó con citometría de flujo. Las células se trataron con 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) en una concentración de 10 µM durante 20 min. Las células se recogieron como se discutió anteriormente. La tinción de las células para la síntesis de ADN se realizó con el kit de ensayo de citometría de flujo Click-iT™ Plus EdU Alexa Fluor™ 488 (Invitrogen, C10632) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Las células también se tiñeron para el contenido de ADN con 10 µg/ml de yoduro de propidio (Thermo Scientific) y 20 µg/ml de RNasa A (Sigma, 10109142001 disueltas en 10 mM Tris-HCl, 15 mM NaCl, pH = 7) en 500 µl de PBS y Se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min protegidos de la luz. Las muestras se analizaron con un citómetro de flujo Attune NxT (Thermo Fischer Scientific Waltham, MA, EE. UU.). La señal Click-iT™ Plus EdU Alexa Fluor™ 488 se detectó con una excitación de 488 nm y una emisión de 530/30 nm en el canal BL1. La señal de yoduro de propidio se detectó con una excitación de 488 nm y una emisión de 695/40 nm en el canal BL3. El análisis de los resultados se realizó con el software Attune NxT 3.2.1.

Las células se lisaron mediante agitación vorticial durante 1 min en tampón RIPA (cloruro de sodio 150 mM, sustituto de Nonidet P-40 al 1 %, desoxicolato de sodio al 0,5 %, SDS al 0,1 %, TRIS HCl 50 mM, DTT 2 mM, PMSF 1 mM, PMSF 5 mM benzamidina, EDTA 2 mM) complementado con COMPLETE ULTRA Tablets (Roche) y PhosSTOP (Roche). El lisado se sonicó dos veces durante 3 min con función de desgasificación a 4 °C (Elma S 30 H Elmasonic) y se centrifugó durante 5 min a 4 °C a 10621 g (Eppendorf Centrifuge 5804 R). El sobrenadante se recogió y almacenó a -20 °C hasta su posterior procesamiento. La concentración de proteínas de las muestras se determinó con el kit de ensayo de proteínas Pierce BCA (Thermo Scientific, 23227) utilizando el lector de microplacas BioTek Synergy Mx. Se cargaron 15 µg de proteína total en cada pocillo después de agregar 3,5 µl de tampón de carga 5X (250 mM Tris-HCl, 50 % glicerol, 10 % DTT, 10 % SDS, 0,05 % azul de bromofenol, pH = 6,8) y agua libre de ARNasa en volumen final de 17,5 µl. Las muestras se incubaron a 95 °C durante 5 min y se cargaron en gel de poliacrilamida al 16 %. Se usó GRS Protein Marker Multicolor (GRiSP, GLP01.0500) como escalera de proteínas. La electroforesis se llevó a cabo en el sistema de electroforesis Mini-PROTEAN (Bio-Rad) en Tris-Glycine SDS Running Buffer (25 mM Tris-HCl, 20 mM glicina, 0,1% SDS) a 200 V durante 90 min. Para la transferencia, se usó una membrana de transferencia de PVDF de 0,45 µm de tamaño de poro Immobilon-P (Merck, IPVH09120) con tampón de transferencia (CAPS 10 mM, metanol al 15 %, pH = 11) a 250 mA durante 3 h. La membrana se secó en papel de filtro y se cortó después de la transferencia y se colocó en TBS-T (TRIS HCl 25 mM, NaCl 140 mM, KCl 3 mM, Tween-20 al 0,05%, pH = 7,4). Se realizó bloqueo e inmunotinción en leche descremada en polvo al 5% en TBS-T. Después de 1 h de bloqueo, la incubación con anticuerpos primarios se realizó durante la noche (anticuerpo policlonal anti-actina (20–33) producido en conejo (Sigma, A5060), anticuerpo monoclonal anti-dUTPasa producido en rata (Sigma, SAB4200044)). Después de lavar las membranas tres veces durante 10 min con TBS-T, se realizó una incubación con anticuerpos secundarios protegidos de la luz durante 2 h (anti-IgG de conejo (GE Healthcare, Na934vs) para actina, anti-IgG de rata (Sigma, A9542) para dUTPasa). Después de lavar las membranas nuevamente tres veces durante 10 min con TBS-T, las membranas se colocaron en tampón TBS hasta la obtención de imágenes. Las bandas se visualizaron con Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Merck, WBKLS0100). Las imágenes se realizaron con ChemiDoc MP Imaging System (Bio-Rad).

Para el análisis de la expresión génica se utilizó el software CFX Maestro 2.0 (Bio-Rad) (URL: https://www.bio-rad.com/en-us/product/cfx-maestro-software-for-cfx-real -tiempo-pcr-instrumentos). El valor umbral se fijó uniformemente en 500 unidades relativas de fluorescencia (RFU) para cada placa medida. Las imágenes de gel se capturaron con el software Image Lab 4.1 (Bio-Rad) (URL: https://www.bio-rad.com/en-hu/product/image-lab-software). Los gráficos se crearon con OriginPro 2018 (OriginLab Corp.) (URL: https://www.originlab.com/2018). Se utilizó CorelDRAW Graphics Suite 2020 (Corel Corporation) para crear figuras a partir de gráficos individuales (URL: https://www.coreldraw.com/en/product/coreldraw/).

Para evaluar la relación de la expresión normalizada relativa de las isoformas de dUTPasa con la expresión global, se llevaron a cabo comparaciones por pares entre cada línea celular normal y el grupo de líneas celulares cancerosas. Los datos de expresión normalizados relativos se extrajeron de CFX Maestro 2.0 (Bio-Rad). Se calculó el logaritmo de la relación entre la expresión relativa normalizada de cada isoforma y la expresión general (medida con el objetivo DUT-all) y se denominó indicador de relación. Como la varianza de las tres muestras replicadas biológicas medidas en diferentes líneas celulares no es igual, realizamos el análisis no paramétrico de Kruskal-Wallis seguido de comparaciones por pares de Conover-Iman con la corrección de Bonferroni usando XLSTAT (Lumivero). Después de la corrección de Bonferroni, los valores de p se definieron como significativos por debajo de 0,0018. Para el experimento de privación de suero, los valores de p se calcularon mediante el software CFX Maestro.

No se generaron ni analizaron conjuntos de datos durante el presente estudio. Previa solicitud, los datos sin procesar están disponibles a través de la dirección de correo electrónico [email protected].

Gaidamaviciute, E., Tauraite, D., Gagilas, J. y Lagunavicius, A. Modificación química dirigida al sitio de la polimerasa de ADN Archaeal Thermococcus litoralis Sh1B: capacidad adquirida para leer a través de uracilos de cadena de plantilla. bioquimica Biografía. Acta - Proteómica de proteínas 1804, 1385–1393 (2010).

Artículo CAS Google Académico

Vértessy, BG & Tóth, J. Mantener el uracilo fuera del ADN: función fisiológica, estructura y mecanismo catalítico de las dUTPasas. Cuenta química Res. 42, 97–106 (2009).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Hirmondo, R., Lopata, A., Suranyi, EV, Vertessy, BG y Toth, J. Control diferencial de la biosíntesis de dNTP y el mantenimiento de la integridad del genoma por las enzimas de la superfamilia dUTPase. ciencia Rep. 7, 6043 (2017).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dengg, M. et al. La derogación del punto de control CLK-2 conduce a la tolerancia a los intermedios de reparación de la escisión de la base. EMBO Rep. 7, 1046–1051 (2006).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Webley, SD, Welsh, SJ, Jackman, AL y Aherne, GW La capacidad de acumular trifosfato de desoxiuridina y la respuesta celular a la inhibición de la timidilato sintasa (TS). Hermano J. Cáncer 85, 446–452 (2001).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ladner, RD, McNulty, DE, Carr, SA, Roberts, GD y Caradonna, SJ Caracterización de distintas formas nucleares y mitocondriales de la desoxiuridina trifosfato nucleotidohidrolasa humana. J. Biol. química 271, 7745–7751 (1996).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Ladner, RD & Caradonna, SJ El gen de la dUTPasa humana codifica isoformas tanto nucleares como mitocondriales. J. Biol. química 272, 19072-19080 (1997).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Cohen, D. et al. Asignación del gen de la dUTPasa humana (DUT) al cromosoma 15q15-q21. 1 por hibridación fluorescente in situ. Genómica 40, 213–215 (1997).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Rona, G. et al. La dinámica de reconstitución del proteoma nuclear humano después de la división celular está regulada por la fosforilación adyacente a NLS. Ciclo celular 13, 3551–3564 (2014).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Rona, G. et al. La fosforilación adyacente a la señal de localización nuclear de la dUTPasa humana suprime la importación nuclear: conocimientos estructurales y mecánicos. Acta Crystallogr. D. Biol. cristalogr. 69, 2495–2505 (2013).

Artículo PubMed Google Académico

Ginzinger, DG Cuantificación de genes mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Exp. hematol. 30, 503–512 (2002).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Bustin, SA, Benes, V., Nolan, T. & Pfaffl, MW RT-PCR cuantitativa en tiempo real: una perspectiva. J. Mol. Endocrinol. 34, 597–601 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Bustin, S. Cuantificación absoluta de ARNm mediante ensayos de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa en tiempo real. J. Mol. Endocrinol. 25, 169–193 (2000).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Pfaffl, MW & Hageleit, M. Validez de la cuantificación de ARNm utilizando ARN recombinante y curvas de calibración externa de ADN recombinante en RT-PCR en tiempo real. Biotecnología. Letón. 23, 275–282 (2001).

Artículo CAS Google Académico

Bennett, J., Hondred, D. & Register, JC Mantener la qRT-PCR rigurosa y biológicamente relevante. Plant Cell Rep. 34, 1–3 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Bustín, SA et al. Las directrices MIQE: Información mínima para la publicación de experimentos cuantitativos de PCR en tiempo real. clin. química 55, 611–622 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Bustin, SA y Nolan, T. Peligros de la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa cuantitativa en tiempo real. J. Biomol. tecnología 15, 155–166 (2004).

PubMed PubMed Central Google Académico

Derveaux, S., Vandesompele, J. & Hellemans, J. Cómo hacer un análisis de expresión génica exitoso usando PCR en tiempo real. Métodos 50, 227–230 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Rácz, GA, Nagy, N., Tóvári, J., Apáti, Á. & Vértessy, BG Identificación de nuevos genes de referencia con patrones de expresión estables para estudios de expresión génica utilizando cáncer humano y líneas celulares normales. Sci. Rep. 11, 19459 (2021).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Desiere, F. et al. El proyecto atlas de péptidos. Ácidos Nucleicos Res. 34, D655–D658 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Ståhlberg, A., Håkansson, J., Xian, X., Semb, H. y Kubista, M. Propiedades de la reacción de transcripción inversa en la cuantificación del ARNm. clin. química 50, 509–515 (2004).

Artículo PubMed Google Académico

Miranda, JA & Steward, GF Variables que influyen en la eficiencia y la interpretación de la PCR cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPCR): un estudio empírico con el bacteriófago MS2. J.Virol. Métodos 241, 1–10 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Cholet, F., Ijaz, UZ & Smith, CJ La enzima transcriptasa inversa y la estrategia de cebado afectan la cuantificación y la diversidad de las transcripciones ambientales. Reinar. Microbiol. 22, 2383–2402 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Nolan, T., Hands, RE & Bustin, SA Cuantificación de ARNm mediante RT-PCR en tiempo real. Nat. Protocolo 1, 1559-1582 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Pfaffl, MW Estrategias de cuantificación en PCR en tiempo real. en The Real-Time PCR Encyclopaedia A–Z of Quantitative PCR (ed. Bustin, S.) 87–112 (La Jolla, CA: International University Line, 2004).

Svec, D., Tichopad, A., Novosadova, V., Pfaffl, MW y Kubista, M. Qué tan buena es una estimación de eficiencia de PCR: recomendaciones para evaluaciones de eficiencia de qPCR precisas y sólidas. Biomol. Detectar. cuantifico 3, 9–16 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Racz, GA et al. Evaluación de parámetros de diseño críticos para el análisis basado en RT-qPCR de múltiples genes de isoformas de dUTPasa en ratones. FEBS Open Bio 9, 1153–1170 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Uhlen, M. et al. Un atlas de patología del transcriptoma del cáncer humano. Ciencia 357, eaan2507 (2017).

Artículo PubMed Google Académico

Jo, J. et al. Los genes de referencia usados convencionalmente no son sobresalientes para la normalización de la expresión génica en la investigación del cáncer humano. BMC Bioinforme. 20, 245 (2019).

Artículo Google Académico

Jin, P. et al. Selección y validación de genes de referencia endógenos utilizando un enfoque de alto rendimiento. BMC Genomics 5, 55 (2004).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Vandesompele, J. et al. Normalización precisa de datos de RT-PCR cuantitativos en tiempo real mediante el promedio geométrico de múltiples genes de control interno. Genoma Biol. 3, 1 (2002).

Artículo Google Académico

Pirkmajer, S. & Chibalin, AV Inanición de suero: Caveat emptor. Soy. J. Physiol. Fisiol. 301, C272–C279 (2011).

Artículo CAS Google Académico

Sandag, Z. et al. Papel inhibitorio de TRIP-Br 1/XIAP en la necroptosis bajo inanición de nutrientes/suero. mol. Celdas 43, 236–250 (2020).

CAS PubMed PubMed Central Google Académico

Kerepesi, C. et al. La vida sin dUTPasa. Frente. Microbiol. 7, 1768 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Williams, MV & Studebaker, AW Regulación a la baja de la nucleotidohidrolasa de trifosfato de desoxiuridina humana (dUTPasa) usando ARN de interferencia pequeño (ARNip). Nucleósidos, Nucleótidos Nucleic Acids 23, 1467–1470 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Studebaker, AW, Lafuse, WP, Kloesel, R. & Williams, MV Modulación de dUTPasa humana usando ARN de interferencia pequeño. Bioquímica Biografía. Res. común 327, 306–310 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Merényi, G. et al. La respuesta celular al silenciamiento eficiente de dUTPase RNAi en líneas celulares HeLa estables perturba los niveles de expresión de genes involucrados en el metabolismo del timidilato. Nucleósidos. Nucleótidos Nucleic Acids 30, 369–390 (2011).

Artículo PubMed Google Académico

Gadsden, MH, McIntosh, EM, Game, JC, Wilson, PJ & Haynes, RH La pirofosfatasa dUTP es una enzima esencial en Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 12, 4425–4431 (1993).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Guillet, M., Van Der Kemp, PA & Boiteux, S. La actividad dUTPasa es fundamental para mantener la estabilidad genética en Saccharomyces cerevisiae. Ácidos Nucleicos Res. 34, 2056–2066 (2006).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Siaud, N. et al. La pantalla SOS en arabidopsis: una búsqueda de funciones involucradas en el metabolismo del ADN. Reparación del ADN (Amst). 9, 567–578 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Dubois, E. et al. La recombinación homóloga es estimulada por una disminución de dUTPasa en arabidopsis. PLoS ONE 6, e18658 (2011).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Alam, MS, Moriyama, H. y Matsumoto, M. La inhibición del gen Dr-dut causa daños en el ADN de las planarias. mol. reprod. desarrollo 85, 188–196 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Kumar, H. et al. Evaluación genética funcional de las enzimas limpiadoras del ADN en el parásito de la malaria: dUTPase y Ap4AH son esenciales en Plasmodium berghei pero ITPase y NDH son prescindibles. Opinión de experto. El r. Metas 23, 251–261 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Pálinkás, H. et al. La eliminación de dUTPasa mediada por CRISPR/Cas9 en ratones conduce a una letalidad embrionaria temprana. Biomoléculas 9, 136 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Castillo-Acosta, VM, Estévez, AM, Vidal, AE, Ruiz-Perez, LM & González-Pacanowska, D. Depletion of dimeric all-α dUTPase induce roturas de cadenas de ADN y perjudica la progresión del ciclo celular en Trypanosoma brucei. En t. J. Bioquímica. Biol celular. 40, 2901–2913 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Castillo-Acosta, VM et al. El aumento de la inserción de uracilo en el ADN es citotóxico y aumenta la frecuencia de mutación, la formación de roturas de doble cadena y el cambio de VSG en Trypanosoma brucei. Reparación del ADN (Amst). 11, 986–995 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Castillo-Acosta, VM et al. Requerimientos de pirimidina en mutantes de Trypanosoma brucei deficientes en desoxiuridina trifosfato nucleotidohidrolasa. mol. Bioquímica Parasitol. 187, 9–13 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Bekesi, A. et al. Regulación del desarrollo de dUTPase en Drosophila melanogaster. J. Biol. química 279, 22362–22370 (2004).

Artículo PubMed Google Académico

Muha, V., Zagyva, I., Venkei, Z., Szabad, J. y Vértessy, BG Movimientos dependientes e independientes de la señal de localización nuclear de las isoformas de dUTPasa de Drosophila melanogaster durante la escisión nuclear. Bioquímica Biografía. Res. común 381, 271–275 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Tchigvintsev, A. et al. Estructura y actividad de Saccharomyces cerevisiae dUTP pirofosfatasa DUT1, una enzima esencial de limpieza. Bioquímica J. 437, 243–253 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Chia, CP, Inoguchi, N., Varon, KC, Bartholomai, BM y Moriyama, H. Localización mitocondrial de Dictyostelium discoideum dUTPase mediada por su N-terminal. Resolución BMC. Notas 13, 16 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chu, R., Lin, Y., Rao, MS y Reddy, JK Clonación e identificación de la desoxiuridina trifosfatasa de rata como inhibidor del receptor α activado por el proliferador de peroxisomas. J. Biol. química 271, 27670–27676 (1996).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Ye, J. et al. Primer-BLAST: una herramienta para diseñar cebadores específicos de destino para la reacción en cadena de la polimerasa. BMC Bioinforme. 13, 134 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Debode, F., Marien, A., Janssen, É., Bragard, C. & Berben, G. La influencia de la longitud del amplicón en los resultados de la PCR en tiempo real. Biotecnología. Agron. Soc. Env. 21, 3–11 (2017).

Artículo CAS Google Académico

Descargar referencias

Este estudio fue apoyado principalmente por la Oficina Nacional de Investigación, Desarrollo e Innovación de Hungría (K119493, K135231, VEKOP-2.3.2-16-2017-00013 to BGV, NKP-2018-1.2.1-NKP-2018-00005), y la subvención TKP2021-EGA-02, implementada con el apoyo proporcionado por el Ministerio de Cultura e Innovación de Hungría del Fondo Nacional de Investigación, Desarrollo e Innovación, financiado bajo el esquema de financiación TKP2021-EGA. Este trabajo también fue apoyado por los Fondos de Investigación Científica de Hungría (OTKA-K128011 a VGy y OTKA-K128369 a AÁ). Este estudio también fue apoyado por el Programa Húngaro de Excelencia Temática (TKP2020-NKA-26). Los autores reconocen el apoyo financiero del programa de Excelencia de Laboratorios Nacionales (bajo el Proyecto de Laboratorio Nacional de Tumorbiología (2022-2.1.1-NL-2022-00010 a JT)) y el Programa de Excelencia Temática de Hungría (TKP2021-EGA-44 a JT). Los autores agradecen a Beáta Haraszti por la asistencia técnica.

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por la Universidad de Tecnología y Economía de Budapest.

Departamento de Biotecnología Aplicada y Ciencias de la Alimentación, Facultad de Tecnología Química y Biotecnología, BME Universidad de Tecnología y Economía de Budapest, Műegyetem Rkp. 3., Budapest, 1111, Hungría

Gergely Attila Rácz & Beáta G. Vértessy

Instituto de Enzimología, Centro de Investigación de Ciencias Naturales, Red de Investigación ELKH Eötvös Loránd, Budapest, Hungría

Gergely Attila Rácz, Nikolett Nagy, György Várady, Ágota Apáti & Beáta G. Vértessy

Escuela de Doctorado en Biología, Instituto de Biología, Universidad ELTE Eötvös Loránd, 1117 Budapest Pázmány Péter Sétány 1/C, Budapest, Hungría

Nikolet Nagy

Departamento de Farmacología Experimental, Instituto Nacional de Oncología, Ráth Gy. U. 7-9, Budapest, 1122, Hungría

József Tóvári

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

GAR y BGV concibieron el proyecto y diseñaron los experimentos. GAR y NN realizaron los experimentos y analizaron los resultados. BGV supervisó el proyecto. JT y A.A. proporcionó materiales y experiencia en el cultivo de líneas celulares normales. GV realizó el análisis de citometría de flujo. GAR, NN y BGV escribieron el manuscrito. Todos los autores revisaron el manuscrito y proporcionaron comentarios críticos.

Correspondencia a Gergely Attila Rácz o Beáta G. Vértessy.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Rácz, GA, Nagy, N., Várady, G. et al. Descubrimiento de dos nuevas isoformas del gen DUT humano. Informe científico 13, 7760 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-32970-1

Descargar cita

Recibido: 30 junio 2022

Aceptado: 05 abril 2023

Publicado: 12 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-32970-1

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y Pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.

Blog

Descubrimiento de dos nuevas isoformas del gen DUT humano