La interrupción probiótica de la detección de quórum reduce la virulencia y aumenta la sensibilidad a la cefoxitina en la meticilina

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 4373 (2023) Citar este artículo

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Las terapias que se dirigen a los sistemas de detección de quórum (QS) que regulan la virulencia en Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA) son una alternativa prometedora a los antibióticos. Los sistemas QS juegan un papel crucial en la regulación de la resistencia a los antibióticos MRSA, la producción de exotoxinas, la protección antioxidante y la evasión de las células inmunitarias y, por lo tanto, son objetivos terapéuticos atractivos para reducir la virulencia de un patógeno. En el presente trabajo, se probaron los efectos de los péptidos bioactivos aislados de dos cepas de bacterias del ácido láctico frente a la resistencia a los antibióticos, la producción de carotenoides, la resistencia a la destrucción oxidativa y la estructura del biofilm en dos aislados clínicos de MRSA. Los resultados obtenidos de los ensayos de concentración inhibidora fraccional con moléculas bioactivas a granel y semipurificadas mostraron un efecto sinérgico significativo que aumenta la eliminación de MRSA mediada por cefoxitina. Esto se combinó con una disminución de seis veces del principal pigmento de la membrana, la estafiloxantina, y un aumento del 99 % en la susceptibilidad a la muerte mediada por el estrés oxidativo. El análisis PCR cuantitativo en tiempo real de los genes QS agrA y luxS mostró una expresión diferencial entre las cepas de MRSA y una regulación negativa significativa del gen hla de la hemolisina. La microscopía óptica y la microscopía electrónica de barrido revelaron una alteración en la formación de biopelículas y el comportamiento de agrupamiento. Estos resultados demuestran que los metabolitos bioactivos se pueden aplicar de forma eficaz junto con antibióticos betalactámicos para sensibilizar el MRSA a la cefoxitina. Además, estos resultados mostraron que varios mecanismos clave de virulencia controlados por QS se ven disminuidos por los metabolitos probióticos.

Históricamente, el uso excesivo de antibióticos ha contribuido al aumento de bacterias resistentes a los antibióticos mediante la selección de la resistencia emergente1, y ya no se espera que la dependencia de las monoterapias con antibióticos pueda seguir el ritmo de las cepas de bacterias resistentes emergentes2,3. Una estrategia para ayudar a controlar la propagación de la resistencia a los antimicrobianos es reducir la presión selectiva que contribuye a la aparición de resistencia al limitar el uso de los antimicrobianos establecidos4. En consecuencia, existe un mayor enfoque en la investigación de alternativas a las monoterapias tradicionales de fármacos antibióticos3,5. En particular, las terapias alternativas que interfieren con la detección de quórum bacteriano (QS) y la comunicación de célula a célula son un enfoque prometedor para gestionar mejor la propagación de la resistencia a los antimicrobianos. Los sistemas QS bacterianos utilizan mecanismos reguladores altamente sofisticados para ayudar a la patogénesis bacteriana al adaptar la expresión de los genes de virulencia al entorno fluctuante del huésped durante la infección. A bajas densidades de patógenos, las moléculas de señalización utilizadas para comunicarse entre las células tienen una concentración baja, pero se acumulan hasta un umbral de concentración a medida que aumenta la densidad de población celular. Una vez que se alcanza el umbral, las moléculas de señalización QS son captadas por la célula a través de transportadores específicos y se activan los reguladores transcripcionales que a su vez inducen los genes de virulencia necesarios en esa etapa de la patogénesis6. Los sistemas QS no están directamente involucrados en los procesos metabólicos esenciales y, al menos en teoría, estas alternativas que no matan ejercerían una presión menos selectiva sobre los patógenos con la capacidad de expresar resistencia7,8. Además, dado que los sistemas QS a menudo desempeñan un papel vital en las características y comportamientos típicos de las bacterias que contribuyen a su virulencia general, como la producción de toxinas y la evasión de células inmunitarias, los disruptores QS son candidatos terapéuticos interesantes en la lucha contra la infección bacteriana y la sepsis9,10.

Una de esas alternativas novedosas que ha surgido recientemente como un contendiente para combatir las bacterias patógenas es el uso de bacterias probióticas y sus metabolitos que actúan como disruptores QS8. Aunque la evidencia científica que respalda las afirmaciones de los beneficios de los probióticos en la salud humana y animal es escasa, trabajos recientes han aclarado varios mecanismos por los cuales los probióticos actúan para interferir directamente con la virulencia de los patógenos. Se ha demostrado que los péptidos metabólicos producidos por Lactobacillus acidophilus reducen la virulencia en cepas bacterianas patógenas al reducir el uso de QS para detectar y comunicarse en su entorno: un contribuyente crucial a la capacidad del patógeno para producir toxinas, invadir células huésped, evadir células inmunitarias y formar biopelículas11,12. También se ha demostrado que los metabolitos aislados del medio gastado libre de células (CFSM) de cultivos de Bifidobacterium regulan a la baja los principales genes reguladores que controlan los factores de virulencia necesarios para la unión y adhesión en Salmonella enterica serovar Typhimurium y Escherichia coli enterohemorrágica O157:H713,14. En particular, se ha demostrado in vivo que el probiótico Bacillus subtilis produce metabolitos que apagan el quórum que contribuyeron significativamente a la exclusión del patógeno comensal Staphylococcus aureus en el intestino dentro de las poblaciones rurales tailandesas15.

Staphylococcus aureus es un patógeno grampositivo de gran preocupación. Las bacterias grampositivas utilizan oligopéptidos autoinductores en sistemas de expresión génica controlados por QS intercelular, y la comunicación a través de estos autoinductores impermeables está mediada por receptores especializados. La vía del regulador del gen accesorio (agr) es uno de los sistemas QS mejor descritos en S. aureus y comprende un receptor de histidina quinasa de dos componentes (AgrC) y su regulador de respuesta transcripcional (AgrA)16. El sistema agr está influenciado por la densidad de población celular y regula la expresión de virulencia requerida por S. aureus en las diversas etapas de la infección17. También se ha demostrado que AgrA posee una capacidad de detección de oxidación que es fundamental en la defensa de S. aureus contra el estrés oxidativo y la evasión de células inmunitarias18, y que el sistema agr es esencial en la regulación dependiente de la densidad de exotoxinas como la alfa hemolisina y la superficie celular. expresión de proteínas19,20. Investigaciones anteriores también han demostrado que el sistema agr muestra un efecto regulador significativo en el gen mecA que controla la resistencia a la meticilina en S. aureus resistente a la meticilina adquirido en la comunidad altamente virulento (MRSA)21,22,23. Por lo tanto, se ha propuesto que el sistema agr debería considerarse un candidato importante para la interrupción del QS y una nueva intervención terapéutica en S. aureus9. Un segundo sistema regulado por QS es el factor B sigma alternativo (sigB), que modula los sistemas de respuesta al estrés de muchas bacterias grampositivas, incluida S. aureus. SigB también regula rasgos de virulencia como la biosíntesis de carotenoides y los mecanismos de resistencia a los antibióticos24. Además, la eliminación de sigB en una cepa de MRSA condujo a una mayor susceptibilidad a los antibióticos activos en la pared celular, como la meticilina y la oxacilina25. Por lo tanto, una idea intrigante es la aplicación de moléculas disruptoras de QS no antibióticas en combinación con antibióticos establecidos como una nueva terapia de combinación.

Se propone que los disruptores QS producidos por bacterias probióticas podrían utilizarse para combatir la resistencia a los antimicrobianos al ayudar a los antibióticos ineficaces a volver a estados más eficaces contra ciertas cepas de MRSA. Además, debido a la presencia reguladora general de múltiples sistemas QS en MRSA, estos metabolitos probióticos también pueden lograr la interrupción de los factores regulados por QS que contribuyen en gran medida a la virulencia de MRSA (p. ej., supervivencia oxidante). Para analizar las capacidades potenciales de los compuestos probióticos en la reducción de la virulencia, se seleccionó el medio gastado libre de células (CFSM) de la bacteria probiótica del ácido láctico (LAB) Enterococcus faecium NCIMB 30616 ("Ef 30616"). También se investigó una segunda cepa probiótica de bacterias del ácido láctico, Lactococcus lactis ATCC 11454 ("Ll 11454"), para determinar si el efecto se conservaba entre muchas especies probióticas. Además, se seleccionaron dos cepas aisladas clínicas de MRSA como objetivos para comparar la reducción de varios factores clave de virulencia bien descritos en poblaciones de MRSA altamente virulentas20: síntesis de estafiloxantina y carotenoides23, producción de alfa hemolisina, aumento de la supervivencia del peróxido de hidrógeno y resistencia a la destrucción por oxidantes23,26, posesión del elemento genético móvil casete cromosómico estafilocócico (SCC) que contiene los genes para la maquinaria de resistencia a los antibióticos y la regulación y expresión del gen mecA ubicado en el SCC9,17,21,22,27.

Para investigar los efectos del material probiótico, primero se determinaron las concentraciones inhibitorias mínimas (MIC) individuales de dos cepas clínicas de MRSA, la cepa 81M ("MRSA 81M") y la cepa 414M ("MRSA 414M") frente al antibiótico betalactámico cefoxitina, y que resultó en CIM de cefoxitina de 100 µg/mL y 60 µg/mL para cada cepa, respectivamente. Se seleccionó cefoxitina para este estudio porque se ha demostrado que este antibiótico regula fuertemente la vía SSC mecA (PBP2a) para la resistencia a los antibióticos en cepas de MRSA28. La adición de tres concentraciones de CFSM a granel Ef 30616 esterilizado por filtración que contiene metabolitos bioactivos (5, 30 y 60 mg/mL) se agregaron en forma de tablero de ajedrez a un rango de concentraciones de cefoxitina (0–100 µg/mL) con inóculos iniciales iguales de cada cepa MRSA respectiva. Los resultados indican una disminución dependiente de la concentración en la concentración mínima de cefoxitina requerida para reducir la densidad de células de MRSA en más del 90 % cuando se incuba con los metabolitos bioactivos durante 24 h (Fig. 1a,b). Se utilizó el índice de concentración inhibitoria fraccional (FIC) para evaluar la potencia de combinar el compuesto bioactivo no antimicrobiano con cefoxitina29. El FIC es una expresión matemática utilizada para describir los efectos de combinaciones de dos o más antibióticos o de un compuesto antibiótico y no antibiótico; los efectos pueden describirse como antagónicos, indiferentes, aditivos o sinérgicos según lo define el índice FIC30. El índice de criterios para determinar los resultados de los cálculos de FIC entre cefoxitina y el material bioactivo Ef 30616 se implementó de la siguiente manera: se observó un resultado sinérgico si la combinación excedía los efectos aditivos observados de los componentes individuales (FIC ≤ 0,5), un resultado aditivo se observó en la suma de los efectos de los componentes individuales (FIC > 0,5–1,0), se observó un resultado indiferente si la combinación era igual al efecto observado del componente más activo (FIC > 1,0–2,0), y un resultado antagónico El resultado se observó cuando la combinación de los dos compuestos tuvo un efecto reducido en comparación con el componente individual más activo (FIC > 2,0). Los FIC obtenidos para MRSA 81M y 414M muestran una relación inversa para los valores de FIC con el aumento de la concentración de metabolitos bioactivos de Ef 30616 (Fig. 1c). Solo la cepa 81M mostró valores de FIC sinérgicos en todas las concentraciones de CFSM probadas, con una disminución significativa en la CIM tanto a 30 como a 60 mg/ml en relación con el control de CFSM no tratado (p < 0,0001, prueba de comparación múltiple de Dunnett). Sin embargo, la cepa 414M solo tuvo efectos aditivos y no condujo a una CIM significativamente diferente con cualquier concentración de CFSM utilizada. Por lo tanto, las dos cepas de MRSA en este estudio tienen sensibilidad diferencial al material bioactivo cuando se tratan con cefoxitina, lo que indica diferencias específicas de cepa en respuesta a CFSM y/o resistencia a los antibióticos.

Diagramas de calor del porcentaje de inhibición del crecimiento de la CMI de las dos cepas clínicas representativas de MRSA mediante pruebas combinadas del antibiótico betalactámico cefoxitina (0–100 µg/mL) y los metabolitos bioactivos Ef 30616 (0, 5, 30 y 60 mg/mL): (a) gráficas de calor MIC de MRSA 81M y (b) gráficas de calor MIC de MRSA 414M. (c) Valores del índice FIC para los efectos combinados de los metabolitos bioactivos de EfMSI1 y cefoxitina para las cepas MRSA 81M y 414M. (d) Gráfica de calor del porcentaje de inhibición del crecimiento de MRSA 81M para la prueba combinada de cefoxitina (0–100 µg/mL) y metabolitos bioactivos de Ef 30616 (30 mg/mL) MWCO 3000 filtrado (es decir, < 3000 Da) y retenido ( es decir > 3000 Da) (n = 3). Los promedios de réplicas biológicas se muestran para mapas de calor y se presentan como los medios en términos de porcentaje de inhibición del crecimiento (ANOVA, p < 0,05 prueba de comparación múltiple de Dunnett).

Tras la determinación de los valores de FIC, se seleccionó MRSA 81M para realizar más pruebas de CIM, ya que tiene una mayor sensibilidad al material bioactivo (ver arriba) y mostró valores de FIC sinérgicos en todas las concentraciones analizadas, mientras que MRSA 414M no expresó un patrón similar. Se seleccionó la concentración de 30 mg/ml de material bioactivo porque era la concentración más baja que tenía un valor de FIC muy por debajo de 0,5. El material bioactivo Ef 30616 se dividió en dos fracciones usando un filtro centrífugo de corte de peso molecular (MWCO) de 3000 dalton (Da), con la primera fracción que contenía solo el filtrado (< 3000 Da) y la segunda fracción que contenía solo el lavado y retenido resuspendido (> 3000 Da). Se usó nuevamente un método de tablero de ajedrez para determinar la CIM de la cepa MRSA 81M utilizando la misma combinación de concentraciones de cefoxitina (0-100 µg/mL) con el mismo inóculo inicial, y se observó un patrón similar en la CIM reducida en el filtrado (Fig. 1d).

Era necesario confirmar que la reducción en los valores de MIC de MRSA 81M observados con CFSM tanto a granel como fraccionado se debía a péptidos bioactivos y no a moléculas inhibidoras producidas por LAB, como los ácidos orgánicos. Se usó cromatografía de exclusión por tamaño preparativa (SEC-FPLC) para separar el CFSM a granel en fracciones que contenían metabolitos específicos, con péptidos pequeños eluyendo en la fracción cuatro ("fracción peptídica"). Cada una de las fracciones de SEC se resuspendió a una concentración equivalente a 5, 15 o 30 mg/mL del CFSM original y se analizó en una titulación de tablero de ajedrez con cefoxitina para determinar el efecto sobre las CIM de MRSA 81M. Si una o más de las fracciones están enriquecidas en metabolitos bioactivos, se deben observar fuertes efectos aditivos o sinérgicos incluso con bajas concentraciones del material.

Los resultados indican que la fracción cuatro de Ef 30616 pudo reducir las CIM de MRSA 81M de una manera dependiente de la concentración (Fig. 2a). Los valores del índice FIC fueron sinérgicos a 15 y 30 mg/mL de material, y aditivos a 5 mg/mL (Fig. 2b). Como esta fracción no contiene ácidos orgánicos, se puede concluir que los efectos se deben a los pequeños péptidos bioactivos que contiene. También se encontró que la fracción tres disminuía los valores de MIC 81M, sin embargo, esto solo fue sinérgico en la concentración más alta utilizada (Fig. 2b, Fig. S1 complementaria). Ni las fracciones uno ni dos tuvieron ningún efecto sobre la CIM bacteriana (Fig. S1 complementaria), lo que confirma aún más que los péptidos pequeños son las moléculas bioactivas responsables de disminuir la resistencia de MRSA 81M a la cefoxitina.

Gráficas de calor del porcentaje de inhibición del crecimiento de MIC de MRSA 81M en combinación con cefoxitina (0–140 µg/mL) y la fracción cuatro de SEC de (a) Ef 30616 o (b) Ll 11454 a 5, 15 y 30 mg/mL de volumen equivalente material. (c) valores del índice FIC para Ef 30616 fracciones uno a cuatro y (d) Ll 11454 fracciones uno a cuatro. Los promedios de réplicas biológicas se muestran para mapas de calor y se presentan como los medios en términos de porcentaje de inhibición del crecimiento (ANOVA, p < 0,05 prueba de comparación múltiple de Dunnett).

El material bioactivo fraccionado de una segunda bacteria probiótica, L. lactis 11454, también se probó contra MRSA 81M en un ensayo FIC y también se encontró que la fracción peptídica reduce los valores de MIC (Fig. 2c). Hubo efectos sinérgicos de los péptidos Ll 11454 y la cefoxitina en todas las concentraciones probadas, lo que dio como resultado una disminución significativa en la MIC en relación con el control no tratado (Fig. 2d) (p < 0,0001, prueba de comparación múltiple de Dunnett). Curiosamente, a pesar de que la fracción cuatro de Ef 30616 contiene menos material proteico que la fracción Ll 11454 equivalente, el material Ef 30616 aún reduce significativamente el crecimiento de MRSA 81M en cefoxitina, lo que sugiere que los péptidos responsables del efecto son potentes a bajas concentraciones y constituyen solo una pequeña porción de la proteína total en el material. A partir de estos resultados se demuestra que los pequeños péptidos bioactivos resultantes de la fermentación probiótica pueden reducir la resistencia a los antibióticos MRSA.

Las poblaciones de variantes de colonias pequeñas (SCV) pueden surgir en cultivos de S. aureus cuando las células se exponen a factores estresantes ambientales como los antibióticos31. Dichos SCV se observaron cuando los cultivos de MRSA tratados bioactivamente se sembraron en placas de agar sangre. Después de la incubación durante 24 h a 37 ± 1 °C, el cultivo en placas de MRSA 81M tratado con bioactivo reveló pequeñas colonias blancas con anillos de hemólisis mínimos o nulos visibles; comparativamente, las colonias de tipo salvaje 81M no tratadas eran en su mayoría uniformes y mantuvieron su coloración naranja distintiva y su fenotipo hemolítico (Fig. 3a,b). Un total de 30,9% de las colonias de MRSA 81M habían perdido por completo su pigmento naranja y aparecieron como SCV. Se observó un patrón similar para MRSA 414M, sin embargo, solo el 19,5% del total de colonias contadas había perdido su pigmentación (Fig. 3c). El fenotipo de SCV se retuvo cuando el SCV original tratado con bioactivo se volvió a sembrar y se cultivó en placas de agar con sangre (Fig. S2 complementaria). Todos los controles fueron negativos para crecimiento o contaminación en el agar sangre.

(a) Colonias de MRSA 81M que crecen en agar sangre después del tratamiento con 30 mg/ml de material bioactivo Ef 30616 (izquierda) o ningún tratamiento (derecha) y (b) colonias de MRSA 414M que crecen en agar sangre después del tratamiento con 30 mg/ml Ef 30616 material bioactivo (izquierda) o sin tratamiento (derecha). Las flechas indican SCV que carecen de pigmentación carotenoide y hemólisis reducida. (c) Porcentaje de SCV en colonias de tipo salvaje para MRSA 81M (n = 3) y MRSA 414M (n = 3) después de 24 h de incubación a 37 +/− 1 °C con y sin material bioactivo Ef 30616 (30 mg/ mL) (U = 0; p < 0,05; Mann-Whitney). Las barras negras centrales indican la media, y los bigotes superior e inferior el máximo y el mínimo, respectivamente.

Se observó que después de 24 h de incubación a 37 °C ± 1 °C con los metabolitos bioactivos Ef 30616, las células de la cepa 81M mostraron una reducción general significativa en la coloración naranja (Fig. 4a); mientras que MRSA 414M exhibió muy poca pigmentación (Fig. 4b, c). La cuantificación de carotenoides por extracción con metanol y las mediciones de absorbancia a 450 nm (A450) corroboraron la observación visual, ya que hubo una diferencia significativa de seis veces en la concentración de carotenoides medida por absorbancia entre los tratamientos de las células 81M, pero una diferencia de menos de tres veces en la concentración de carotenoides. carotenoide entre tratamientos de las células MRSA 414M (U = 0; p <0.05; Mann-Whitney) (Fig. 4d). Con una síntesis reducida de carotenoides, se planteó la hipótesis de que los metabolitos bioactivos de Ef 30616 aumentarían la sensibilidad de las cepas de MRSA a la muerte por oxidantes. Se añadió peróxido de hidrógeno al 1,5 % v/v a cultivos no tratados y tratados con bioactivos de cada cepa de MRSA respectiva y se incubó a 37 °C ± 1 °C durante 1 h en solución de PBS; los recuentos de células (UFC/mL) se determinaron antes y después de la incubación de 1 h (Fig. S3 complementaria). Las células tratadas con bioactivos mostraron una muerte celular del 99,67 % y > 99,99 % para las cepas MRSA 414M y 81M, respectivamente (W = 0; p < 0,05; rango con signo de Wilcoxon); a diferencia de las células 414M y 81M no tratadas, que exhibieron solo un 16,67 % y un 19,70 % de muerte celular, respectivamente (Fig. 4e). Sin embargo, la reducción en 414M sin tratar no se consideró significativa (W = 5; p > 0,05; rango con signo de Wilcoxon).

Los sedimentos de células de MRSA carecen de pigmentación de carotenoides después de 24 h de incubación con material bioactivo Ef 30616 (30 mg/mL) a 37 °C ± 1 °C: (a) sedimentos de MRSA 81M sin tratar (izquierda) y de MRSA 81M tratado con bioactivo (derecha), (b) gránulos de MRSA 414M sin tratar (izquierda) y de MRSA 414M tratado con bioactivo (derecha), y (c) comparación de los cuatro gránulos (de izquierda a derecha) de MRSA 81M sin tratar, MRSA 81M tratado con bioactivo, MRSA 414M sin tratar y MRSA 414M tratado con bioactivos. (d) Medida de absorbancia de carotenoides a 450 nm (A450) de cada uno de los dos tratamientos descritos para ambas cepas (n = 3) (U = 0; p < 0,05; Mann-Whitney). (e) Disminución porcentual de la supervivencia estafilocócica a peróxido de hidrógeno al 1,5 % v/v para MRSA 81M (n = 3) y MRSA 414M (n = 3) después de 1 h de incubación a 37 °C ± 1 °C en solución de PBS con y sin Tratamiento bioactivo Ef 30616 (30 mg/ml) (W = 0; p < 0,05; rango con signo de Wilcoxon). Las barras negras centrales indican la mediana, y las puntas de los bigotes superior e inferior muestran el máximo y el mínimo, respectivamente, para los diagramas de caja (d) y (e).

Se realizó un análisis de la expresión relativa del ARNm para indicar la relación entre QS y la expresión del gen de virulencia potencialmente afectada por el material bioactivo Ef 30616 (Fig. 5). Dado que se ha demostrado que muchos sistemas relacionados con QS, incluido sigB, se activan más en las últimas etapas de crecimiento exponencial24, se controló la expresión de los genes seleccionados en la fase exponencial tardía y estacionaria temprana para las cepas respectivas. El sistema QS del regulador de genes accesorios (Agr) no mostró una expresión diferencial significativa en relación con el control no tratado para el regulador de la respuesta transcripcional argA. El gen asp23 fue monitoreado como un indicador de la actividad de SigB, como se describió anteriormente32 y los resultados indican que los metabolitos probióticos Ef 30616 interfieren levemente con genes clave relacionados con la detección de quórum a través de SigB en las cepas MRSA 414M y 81M.

Expresión diferencial de genes relacionados con la virulencia de SARM en relación con los controles no tratados de las cepas de SARM 81M y 414M tras la incubación con material bioactivo Ef 30616 (30 mg/ml) a 37 °C ± 1 °C; los cultivos se incubaron hasta la fase exponencial tardía y la fase estacionaria. El rRNA 16s se utilizó como gen de mantenimiento. Los datos se muestran como promedios y las barras indican la desviación estándar (n = 3). Diferencias estadísticamente significativas entre las cepas indicadas con asteriscos (ANOVA; p < 0,05).

La expresión de hla, que codifica la alfa-hemolisina, estaba fuertemente regulada negativamente en la fase estacionaria, particularmente en la cepa 414M. Esto verifica además que los metabolitos bioactivos reducen la hemólisis, como se observó con SCV en placas de agar sangre. Curiosamente, crtM, que codifica la dehidroescualeno sintasa responsable de catalizar el primer paso en la biosíntesis de estafiloxantina, parecía tener una ligera regulación al alza en la cepa 81M durante la fase estacionaria temprana, mientras que la 414M tenía un nivel muy bajo de regulación a la baja. Los resultados de qPCR demuestran diferencias en la expresión génica de virulencia entre las dos cepas de MRSA en respuesta al tratamiento con material bioactivo.

Las cepas MRSA 81M y 414M incubadas con y sin 30 mg/ml de los metabolitos probióticos se evaluaron mediante microscopía óptica y microscopía electrónica de barrido (SEM) después de 4, 6 y 24 h de incubación a 37 °C ± 1 °C. Las imágenes SEM mostraron que las cepas MRSA 81M y 414M tratadas con bioactivos comenzaron a agregarse a las 6 h de incubación y formaron estructuras progresivamente multicapa (Fig. 6d-f, j-l), en relación con las células no tratadas (Fig. 6a-c, g- i). La microscopía óptica mostró además que las células de MRSA tratadas con bioactivos comenzaron a acumularse y formar grupos más prominentes (Fig. 7d-f, j-l). Por el contrario, las células de MRSA no tratadas formaron racimos típicos similares a uvas sin formar racimos de varias capas (Fig. 7a-c, g-i). Además, el tratamiento con el compuesto bioactivo no pareció afectar la forma o el tamaño de las células: las células individuales MRSA 81M y 414M tanto no tratadas como tratadas con bioactivo aparecieron como cocoides.

Microscopía electrónica de barrido que indica la progresión de la formación de biopelículas de cultivos de MRSA 81M y 414M tratados con bioactivos y no tratados, incubados durante un período de 24 h a 37 °C ± 1 °C y con imágenes en los siguientes intervalos: imágenes de MRSA 414M sin tratar en (a) 4 h, (b) 6 h y (c) 24 h, Ef 30616 tratado con bioactivo MRSA 414M a (d) 4 h, (e) 6 h y (f) 24 h, MRSA 81M sin tratar a (g) 4 h , (h) 6 hy (i) 24 h, y MRSA 81 M tratado con bioactivo Ef 30616 en (j) 4 h, (k) 6 hy (l) 24 h. Ampliación = 4000×. Barra de escala = 20 μm.

Imágenes de microscopía óptica de diferentes etapas de crecimiento de cultivos de MRSA 81M y 414M tratados con bioactivo Ef 30616 y no tratados, incubados durante un período de 24 h a 37 °C ± 1 °C y con imágenes en los siguientes intervalos: MRSA 414M sin tratar en (a) 4 h, (b) 6 h y (c) 24 h, MRSA 414M tratado con bioactivos a (d) 4 h, (e) 6 h y (f) 24 h, MRSA 81M sin tratar a (g) 4 h, (h ) 6 hy (i) 24 h, y MRSA 81M tratado con bioactivo Ef 30616 a (j) 4 h, (k) 6 h y (l) 24 h. Objetivo = 10×. Barra de escala = 140 µm.

El presente estudio demuestra que los metabolitos aislados del CFSM de E. faecium cepa 30616 y L. lactis 11454 aumentan la sensibilidad de dos cepas clínicas de MRSA a la cefoxitina, un antibiótico betalactámico que ya no es clínicamente adecuado contra las infecciones por MRSA. Como la cefoxitina actúa impidiendo el entrecruzamiento de las capas de peptidoglicano dentro de la pared celular bacteriana, el impacto de los metabolitos bioactivos probióticos en los componentes de la pared celular es sinérgicamente beneficioso para el mecanismo de acción de la cefoxitina. Nuestros datos indican que los péptidos bioactivos de E. faecium Ef 30616 y L. lactis 11454 pueden actuar como adyuvantes no antimicrobianos junto con un antibiótico y, lo que es más importante, pueden tener el potencial de "resensibilizar" el MRSA a antibióticos que ya no son clínicamente relevantes. como la cefoxitina. Además, nuestros resultados también indican que estos bioactivos Ef 30616 pueden impedir los rasgos de virulencia que respaldan las infecciones por MRSA: resistencia a las especies de oxígeno, biosíntesis de estafiloxantina y producción de hemolisina mediada por los sistemas QS en S. aureus. Dado que los pigmentos carotenoides contribuyen en gran medida a la aptitud estafilocócica, particularmente en la evasión de las células inmunitarias, la inhibición de la síntesis de carotenoides podría ser un objetivo potencial para la intervención terapéutica en las infecciones por S. aureus27. Por último, la aparición de mayores concentraciones de SVC dentro de la población general de MRSA puede indicar un cambio en las células de MRSA con una expresión reducida de genes clave relacionados con QS dentro de la población durante las últimas etapas de crecimiento. Sin embargo, en términos de infecciones por S. aureus relacionadas con biopelículas, la implementación de compuestos probióticos disruptores de QS puede no ser beneficiosa, ya que se ha demostrado que la interrupción de QS brinda ventajas en la selección de SVC y la formación general de biopelículas6,33.

Los valores de FIC para MRSA 81M indicaron que hubo un efecto combinatorio sinérgico para las tres concentraciones de material bioactivo Ef 30616, mientras que los valores de FIC para MRSA 414M solo mostraron un efecto sinérgico en la concentración más alta utilizada. Estos resultados indican diferencias específicas de la cepa en la sensibilidad al antibiótico para las dos cepas de MRSA. Los pozos de control solo bioactivos no mostraron efectos negativos en el crecimiento de MRSA para ambas cepas, lo que indica que el mecanismo de acción de los metabolitos bioactivos no es inherentemente antimicrobiano contra MRSA, y que la inhibición del crecimiento de MRSA solo se observó cuando los metabolitos bioactivos Ef 30616 se combinaron con cefoxitina. Los resultados de la MIC de las fracciones bioactivas muestran claramente que el filtrado contenía la mayor actividad y redujo la MIC de la cefoxitina; sin embargo, se detectó cierta actividad residual en el retenido, lo que dio como resultado que la MIC fuera ligeramente inferior a la del control sin tratar. Además, dos lavados del retenido que se realizaron también mostraron cierta actividad bioactiva residual (Fig. S4 complementaria). Estos resultados indican que la mayoría de los compuestos Ef 30616 que contenían bioactividad contra las dos cepas clínicas de MRSA probadas tenían un tamaño de aproximadamente ≤ 3000 Da.

Al separar el material a granel en fracciones definidas químicamente, se demostró que los péptidos bioactivos son responsables de la reducción observada en la resistencia a la cefoxitina a los antibióticos de la cepa 81M de MRSA. Los filtrados de CFSM y MWCO a granel todavía contienen muchos componentes de medios, como azúcares residuales, proteínas no hidrolizadas y ácidos orgánicos resultantes de la fermentación. Se sabe que las bacterias del ácido láctico inhiben el crecimiento de S. aureus a través de la acidificación del medio ambiente34 y, por lo tanto, era esencial eliminar los ácidos orgánicos que, de lo contrario, podrían afectar la susceptibilidad de S. aureus a la cefoxitina. A pesar de que había mucho menos material en la fracción peptídica Ef 30616 en comparación con Ll 11454, el efecto fue aún lo suficientemente fuerte como para causar una reducción sinérgica en los valores de FIC. Esto sugiere que estas moléculas proteobióticas pueden actuar con potencias extremadamente altas, trabajando en concentraciones muy bajas. Se observaron resultados similares en un estudio realizado por Kou et al.35, en el que los autores encontraron que tan solo 1 µg/mL de una molécula de extinción de quórum sintética podían reducir las CIM de MRSA a los antibióticos betalactámicos de primera generación nafcilina y cefalotina. por 50 veces. Además, se demostró que estas moléculas son eficaces para reducir la muerte cuando se aplican en combinación con cefalotina en un modelo de bacteriemia/sepsis por SARM en ratones36. También se han empleado péptidos artificiales para mejorar la potencia de los antibióticos de primera generación mediante la alteración de la envoltura celular37. Nuestros resultados demuestran claramente que los procesos de fermentación natural de las bacterias del ácido láctico pueden aprovecharse para generar péptidos bioactivos que poseen una potente actividad antivirulenta.

El pigmento dorado que muestran los carotenoides antioxidantes se redujo significativamente para MRSA 81M y MRSA 414M luego del tratamiento con 30 mg/mL de metabolitos bioactivos Ef 30616. Sorprendentemente, aunque el MRSA 414M de tipo salvaje poseía originalmente muy poca pigmentación naranja, el tratamiento con el material bioactivo Ef 30616 hizo que el MRSA 414M perdiera la mayor parte de su pigmento, lo que resultó en un gránulo casi completamente blanco. El cambio en el color del sedimento celular luego de 24 h de incubación con los metabolitos bioactivos Ef 30616 es indicativo de la alteración probiótica de la estructuración adecuada de la pared celular: también se cree que los carotenoides participan en la estabilización de la membrana de S. aureus durante la infección y la patogénesis y en el mantenimiento de la rigidez celular contra defensas del huésped26,38. Además, estos compuestos acumulados en la superficie contribuyen a la virulencia general de S. aureus al brindar protección contra la fotosensibilización y la desecación, así como al actuar como potentes antioxidantes que eliminan las especies reactivas de oxígeno tóxicas que utilizan las células inmunitarias39. La reducción en la coloración amarillo-naranja característica del MRSA coloquialmente conocido como "estafilococo dorado" probablemente se deba a la interrupción de los sistemas de dos componentes relacionados con QS que se informa que son esenciales para la tolerancia al peróxido de hidrógeno en S. aureus, incluido el factor sigma alternativo sigB . Además, aunque los sedimentos celulares fueron casi idénticos en el recuento total de UFC/mL entre el control no tratado y las células MRSA tratadas con bioactivos después de 24 h de incubación, los sedimentos celulares fueron menos densos y formaron sedimentos celulares más grandes (Fig. 4a-c) que parece ser el resultado de la formación avanzada de biopelículas después de la incubación de MRSA con los metabolitos bioactivos de CFSM, como lo revelan las imágenes de microscopía (Figs. 6, 7). La pérdida de componentes de la membrana, como la estafiloxantina, afecta la integridad de la membrana, lo que provoca cambios en el comportamiento de agregación y la formación de biopelículas. Es interesante notar que, aunque las dos cepas de MRSA tratadas con bioactivos mostraron una progresión avanzada en la agregación y la formación de biopelículas, ambas exhibieron una mayor susceptibilidad a la cefoxitina durante 24 h, lo que indica que la agregación y la producción de biopelículas no ayudaron a las células de MRSA a replicarse en la presencia de la cefoxitina. Estos hallazgos son de gran interés ya que las concentraciones subinhibidoras de antibióticos betalactámicos pueden inducir la formación de biopelículas en MRSA, y estos resultados demuestran que los péptidos bioactivos permiten una mayor susceptibilidad de MRSA a los antibióticos incluso durante la formación de biopelículas.

Curiosamente, después de la incubación con peróxido de hidrógeno al 1,5 % v/v, tanto el MRSA 81M como el MRSA 414M tratados con bioactivo mostraron una reducción significativa en la muerte celular en > 99,99 % y 99,67 %, respectivamente, aunque el pigmento naranja persistente parecía permanecer en el bioactivo. SARM tratado. Sin embargo, este bajo nivel de pigmento posiblemente se deba al pigmento intermedio 4,4′-diaponeurosporeno, que se ha indicado previamente a través de la interrupción de sigB40. Dado que MRSA 414M de tipo salvaje parecía tener poca producción de carotenoides (en comparación con MRSA 81M), una teoría alternativa es que los metabolitos bioactivos también pueden alterar el componente intrínseco del sistema agr responsable de detectar entornos oxidativos8. En términos de producción de toxinas, la transcripción de hla varía entre las cepas de MRSA41, y la regulación a la baja por parte del material bioactivo puede ser a través de un mecanismo conservado como la detección de quórum. La reducción de hla se observó fenotípicamente en el crecimiento de colonias de MRSA después del tratamiento con el material bioactivo, que mostró una fuerte reducción de los anillos de hemólisis en medios de agar sangre para ambas cepas. Además, la mayoría de las colonias con hemólisis reducida mostraban morfologías diferentes a las del MRSA de tipo salvaje: las colonias eran pequeñas, de crecimiento lento y habían perdido la mayor parte de su pigmentación original (Fig. 3a,b). Estas colonias se han descrito previamente en cultivos de MRSA como variantes de colonias pequeñas. La interrupción del sistema agr se ha relacionado con SVC dentro de las poblaciones de MRSA de tipo salvaje, y se ha demostrado que muestran una virulencia reducida y una mayor agregación celular. Juntos, estos hallazgos respaldan la noción de que ciertas moléculas proteobióticas Ef 30616 pueden interrumpir la síntesis típica de la pared celular en MRSA al bloquear la producción de carotenoides que actúa como un antioxidante crucial, lo que resulta en una mayor sensibilidad a la eliminación de oxidantes.

Estos resultados demuestran que las moléculas que apagan el quórum generadas naturalmente tienen el potencial de combatir el aumento de bacterias resistentes a los antibióticos a múltiples fármacos. Es posible que a través de la alteración mediada por proteobióticos de las estructuras de la pared celular de MRSA, como la estafiloxantina, la eficacia de la respuesta inmunitaria del huésped pueda aumentar a medida que las células bacterianas se vuelven más sospechosas de muerte mediada por macrófagos a través de la producción de especies reactivas de oxígeno. Aunque estos resultados concuerdan con nuestros hallazgos previos con respecto a la actividad disruptiva de QS de los metabolitos probióticos que se encuentran dentro del CFSM de otras BAL probióticas, se requiere más investigación para dilucidar el mecanismo de acción completo de estos metabolitos bioactivos. Identificar cómo estas moléculas impiden el control de la virulencia mediante detección de quórum también tendrá implicaciones importantes en su aplicación en un entorno clínico para combatir una infección bacteriana. Sin embargo, las tecnologías adyuvantes desarrolladas a partir de bacterias probióticas que interrumpen los sistemas QS de S. aureus son contendientes potencialmente serios para combatir las infecciones por MRSA.

Se obtuvo un cultivo madre congelado de glicerol de Enterococcus faecium 30616 ("Ef 30616") (previamente identificado como Lactobacillus acidophilus cepa DSM 13241, redesignado después de la identificación microbiana MALDI-TOF) del Instituto Canadiense de Investigación para la Seguridad Alimentaria (Universidad de Guelph, Ontario, EE. Canadá). Esta cepa probiótica común se utilizó para producir materiales bioactivos que contenían metabolitos probióticos para todos los experimentos utilizados en este estudio. Se obtuvo una segunda cepa probiótica, Lactococcus lactis 11454 ("Ll 11454") de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) y se usó para producir material que contiene bioactivos para pruebas MIC.

Dos aislados clínicos de la bacteria S. aureus, MRSA 81M SPA t008 ("MRSA 81M") y MRSA 414M SPA t034 ("MRSA 414M"), se obtuvieron del Atlantic Veterinary College (AVC) en la Universidad de Prince Edward Island (Charlottetown , PE, Canadá). La presencia de resistencia a la meticilina a través de la vía del gen SCC mecA en ambas cepas se confirmó con la difusión en disco de oxacilina y los cebadores del gen mecA (Tabla complementaria S1)42. Los aislados clínicos se mantuvieron en placas de agar de soja tríptico (TSA) suplementadas con sangre de carnero desfibrinada estéril al 5% v/v (Cedarlane, Burlington, Ontario, Canadá). Los cultivos de MRSA se cultivaron en medios Mueller Hinton con ajuste de cationes BBL™ (Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, EE. UU.) para todos los ensayos experimentales.

E. faecium Ef 30616 se inoculó en 200 ml de medio De Man, Rogosa and Sharpe (MRS) modificado esterilizado por filtración de 0,22 µm (VWR International, Mississauga, Ontario, Canadá). Este cultivo en botella se incubó sin agitación a 37 ± 1 °C durante 18 h. A continuación, el cultivo se usó para inocular 4 l de medio químicamente definido (CDM) con 200 g de aislado de proteína de suero (Canadian Protein) y 25 g de lactosa. El cultivo en recipiente se incubó estáticamente a 37 ± 1 °C durante 48 h. Después de la incubación, las células Ef 30616 se aislaron de la fase líquida mediante centrifugación a 12 000 × g durante 30 min a 4 °C (Avanti J-20 XPI, Beckman Coulter, Canadá). A continuación, el sobrenadante libre de células que contenía los metabolitos probióticos se congeló a -80 °C y se liofilizó. El sobrenadante libre de células Ef 30616 secado se mantuvo almacenado a largo plazo en forma de polvo a -20 °C hasta que se necesite.

El sobrenadante seco se pesó y se resuspendió en medio Mueller Hinton con ajuste de cationes a la concentración deseada (5, 30 y 60 mg/ml). El pH del material resuspendido se verificó con un medidor de pH Accumet® AE150 (Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.) y se ajustó según fuera necesario a un pH de 7,3 ± 0,1. A continuación, la solución resuspendida se centrifugó a 5000 × g durante 15 min a temperatura ambiente con una Centrifuge 5804 (Eppendorf, Hamburgo, Alemania). El líquido restante se separó del sedimento de desecho y se filtró a través de un filtro de membrana Supor®-800 de 0,45 µm (Pall Corporation, Nueva York, EE. UU.) con un aparato de filtración al vacío Synthware 40/35 (Kemtech America, Los Ángeles, EE. UU.) para eliminar material coloidal restante. A continuación, el filtrado se esterilizó por filtración utilizando un filtro de jeringa Basix™ de 25 mm y 0,2 µm (Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.). Las muestras se almacenaron a -20 °C hasta que se necesitaron.

Se utilizaron filtros centrífugos Amicon® Ultra de 15 ml con un corte de peso molecular (MWCO) de 3000 Da (Millipore Sigma, Burlington, EE. UU.) para la ultrafiltración del sobrenadante sin células probiótico resuspendido. Después de la resuspensión como se describe anteriormente, se agregaron 10 ml del sobrenadante libre de células al tubo de filtro de centrífuga MWCO 3000 y se centrifugó a 5000 rpm durante 1 hora. Se recogió el filtrado de MWCO 3000; la fracción de retenido restante se recogió enjuagando la cabeza del filtro dos veces con 10 ml de medio Mueller Hinton con ajuste de cationes para cada enjuague. Después de los dos enjuagues, se usaron 10 ml adicionales de medio para resuspender y recolectar el retenido. A continuación, todas las fracciones recogidas se esterilizaron por filtración con un filtro de jeringa de 0,2 µm para eliminar cualquier contaminación. Las soluciones líquidas de retenido y filtrado de MWCO 3000 se almacenaron a -20 °C hasta que se necesitaron para los experimentos.

El sobrenadante seco se resuspendió en agua Milli-Q a una concentración de 50 mg/mL y se sonicó durante 15 min para mejorar la solubilización. Después de la resuspensión, las muestras se centrifugaron durante 20 min a 8000 × g y el filtro de sobrenadante se esterilizó con un filtro de jeringa de 0,22 µm. Las muestras se separaron en una columna preparativa XK 26/100 empaquetada con Superdex 30 y se procesaron con un AKTA Explorer (Cytiva Life Sciences, Marlborough, EE. UU.). El material se eluyó con acetonitrilo al 10 % y ácido trifluoroacético al 0,1 % a un caudal de 3 ml/min. La curva de elución se controló midiendo el pH y la absorbancia a 280 y 214 nm. Las eluciones deseadas se recolectaron y combinaron en fracciones definidas, luego se congelaron a -80 °C y luego se liofilizaron. El material liofilizado se almacenó a -80 °C hasta que fue necesario.

El antibiótico seleccionado para la prueba de concentración inhibitoria mínima (MIC) en las dos cepas de MRSA fue la cefoxitina, como se describe en las pautas del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) para la prueba de MIC de especies de estafilococos43. La cefoxitina en polvo (Alfa Aesar, Haverhill, EE. UU.) se pesó con una balanza analítica y se resuspendió en metanol a 10 mg/mL y se almacenó a -20 °C hasta su uso.

Las pruebas de CIM se realizaron con respecto a las directrices del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) para pruebas de CIM de especies de estafilococos43. Los cultivos de la noche a la mañana de cada cepa clínica respectiva de MRSA se diluyeron 1000 veces para obtener aproximadamente 106 CFU/mL como inóculo inicial. Los rangos de dilución para la cefoxitina fueron de 0 a 100 μg/mL. Las CIM de la cepa clínica de MRSA con cefoxitina se determinaron mediante microdilución en caldo con cefoxitina en medio Mueller Hinton con ajuste de cationes en microplacas de fondo plano estándar de 96 pocillos transparentes Costar® (Corning® Inc., Corning, EE. UU.). Se agregaron alícuotas de solo medio como controles de esterilidad y se usaron como control de fondo, mientras que la cefoxitina de 100 µg/mL sirvió bien como control positivo de la destrucción mediada por antibióticos. Todos los volúmenes de muestra de prueba fueron de 200 µL por pocillo con duplicados. Después de la preparación de la muestra y la división en alícuotas, las placas de prueba de MIC se sellaron con parafilm y se incubaron a 35 ± 1 °C y 200 rpm con agitación durante 24 h en un miniagitador de incubación VWR® y la temperatura se controló con un termómetro digital Fisherbrand™ (Fisher Scientific, Waltham, Estados Unidos). Después de la incubación, las placas se enfriaron a temperatura ambiente y se midió la turbidez utilizando un lector de microplacas SpectraMax M2 (Molecular Devices, San José, EE. UU.) a una longitud de onda de 600 nm. Las concentraciones más bajas de cefoxitina que dieron como resultado una reducción de la turbidez del 90 % o mayor en comparación con los respectivos controles de crecimiento positivo se definieron como CIM. Todas las pruebas de CIM se realizaron en tres réplicas biológicas. Después de la prueba de tablero de ajedrez de MIC, como cepa clínica con un MIC alto, se seleccionó MRSA 81M para probar las fracciones de ultrafiltración y SEC del material bioactivo para dilucidar mejor los tamaños y la identidad química de los bioactivos. Las pruebas de MIC de la fracción MWCO 3000 y SEC se realizaron de manera idéntica al método de prueba MIC descrito anteriormente.

Se realizaron análisis de CIM de tablero de ajedrez para tres concentraciones de material bioactivo probiótico predeterminadas para determinar los efectos combinatorios sinérgicos, aditivos o antagónicos con cefoxitina contra las cepas clínicas de MRSA. Los intervalos de dilución del material bioactivo fueron 5, 30 y 60 mg/ml de sobrenadante libre de células Ef 30616 liofilizado, o 5, 15 y 30 mg/ml de fracciones SEC de Ef 30616 y Ll 11454 liofilizadas. Los rangos de dilución para la cefoxitina utilizados en las pruebas de FIC fueron de 0 a 100 µg/mL para el material a granel y de 0 a 140 µg/mL para las fracciones SEC. Las pruebas de FIC se realizaron de manera idéntica al método de prueba de MIC descrito anteriormente. El índice FIC se determinó como se describió previamente30. Se usaron las ecuaciones (1) y (2) para determinar los valores de FIC para cefoxitina o cada material bioactivo, y la ecuación. (3) se utilizó para calcular el índice FIC para determinar el efecto combinatorio de los dos componentes.

donde FICA y FICB son los valores de FIC para el fármaco A y el fármaco B, respectivamente. MICA y MICB son las CIM respectivas del fármaco A y del fármaco B solos. MICC es la MIC del fármaco A y el fármaco B en combinación. El índice FIC (FICi) es la suma de FICA y FICB.

Para los siguientes ensayos fisiológicos y qPCR, cada cepa de MRSA respectiva se cultivó de la siguiente manera. Cada cepa de MRSA se inoculó en 10 mL de medio Mueller Hinton con ajuste de cationes ("sin tratar") y 10 mL de medio Mueller Hinton con ajuste de cationes complementado con 30 mg/mL de material bioactivo probiótico ("tratado") y luego se incubó a 37 ± 1 °C y 200 rpm agitando durante 24 h a menos que se indique lo contrario.

Las muestras se prepararon como se describe anteriormente. Después de la incubación, los carotenoides estafilocócicos se extrajeron utilizando un protocolo de extracción con metanol previamente establecido23. El sobrenadante que contenía los carotenoides extraídos se pipeteó en 200 µL (con duplicados) en una placa estándar de 96 pocillos y se midió la absorbancia a una longitud de onda de 450 nm (A450) con un lector de microplacas SpectraMax M2 (Molecular Devices, San José, EE. UU. ).

Las muestras se prepararon como se describe anteriormente. Después de la incubación, las muestras se centrifugaron a 4000 rpm durante 15 min, se lavaron en una solución de PBS de Dulbecco 1x (VWR Life Science, Radnor, EE. UU.) y se resuspendieron a aproximadamente 109–1010 CFU/ml en una solución de peróxido de hidrógeno al 1,5 % v/v. Luego se realizaron ensayos de susceptibilidad a los oxidantes siguiendo un protocolo previamente establecido23.

Las muestras se prepararon como se describe. Se realizaron diluciones en serie de las muestras y se sembraron 100 µl de muestra diluida por duplicado en placas TSA suplementadas con sangre de oveja desfibrinada estéril al 5 % v/v (Cedarlane, Burlington, Ontario, Canadá). Las placas se incubaron durante 15 a 20 h a 37 ± 1 °C y se analizaron para hemólisis y recuentos de UFC/mL.

Las muestras se prepararon como se describe anteriormente y luego se incubaron a 37 ± 1 °C y 200 rpm con agitación durante 4 h y 6 h para las muestras de MRSA 414M y 5 h y 6 h para las muestras de MRSA 81M. Las extracciones de ARN de las muestras se realizaron de acuerdo con el kit illustra™ RNAspin (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido). Las transcripciones inversas y las síntesis de ADNc se realizaron de acuerdo con el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems, Foster City, EE. UU.). Los experimentos de qPCR se realizaron con un termociclador CFX96™ Real-Time System C1000™ y los análisis de datos se realizaron con el sistema de software CFX Manager 3.1 que lo acompaña (Bio-Rad, Hercules, EE. UU.). Los genes seleccionados y sus pares de cebadores se enumeran en la Tabla complementaria S1.

Las muestras se prepararon como se describe anteriormente y luego se incubaron a 37 ± 1 °C y 200 rpm con agitación durante 4 h, 6 h y 24 h para las muestras 414M y 81M. Después de la incubación, las muestras se tiñeron con Crystal Violet, se prepararon para microscopía óptica y se observaron con el microscopio Upright Revolve 4 equipado con un iPad Pro (ECHO Inc., San Diego, EE. UU.). Las muestras SEM se prepararon como se describió anteriormente44. Las muestras se montaron en trozos con cinta de doble cara y se recubrieron con oro mediante un sistema de vacío Denton y se observaron con un microscopio electrónico de barrido Hitachi TM3000 (Hitachi High-Technologies Corporation, Tokio, Japón) operado a 15 kV.

Los datos de MIC se analizaron mediante ANOVA de dos vías seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett utilizando GraphPad Prism versión 9 (software GraphPad, San Diego, California). Todos los datos de qPCR se analizaron mediante ANOVA utilizando el sistema de software CFX Manager 3.1 (Bio-Rad, Hercules, EE. UU.). Los datos para el ensayo de absorción de carotenoides y el recuento de células porcentuales de SCV se analizaron mediante pruebas estadísticas U de Mann-Whitney utilizando Microsoft Excel. Los datos de eliminación de células con peróxido de hidrógeno se analizaron mediante el rango con signo de Wilcoxon para pruebas estadísticas pareadas utilizando Microsoft Excel. Todas las réplicas indicadas (n) son el valor biológico medio de los duplicados técnicos.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles a pedido del autor correspondiente.

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Los autores desean agradecer al Dr. J Trenton McClure del Atlantic Veterinary College en Charlottetown, PE, Canadá, por proporcionar las cepas clínicas de MRSA, y a Matthew Saab por facilitar la obtención de las cepas. Los autores desean agradecer a Jonathon Roepke por su ayuda con el diseño y la ejecución experimental. Los autores también quisieran agradecer al Instituto Canadiense de Investigación para la Seguridad Alimentaria en Guelph, ON, Canadá, por proporcionar la cepa Enterococcus faecium. Por último, esta investigación fue apoyada en parte por el Consejo Nacional de Investigación de Canadá a través del Programa de Asistencia para la Investigación Industrial para el desarrollo de tecnología.

Departamento de Ingeniería Mecánica, École de Technologie Supérieure (ÉTS), Montreal, QC, H3C 1K3, Canadá

Mónica Angela Cella, Sara Badr y Ali Ahmadi

MicroSintesis Inc., Victoria, PE, COA 2G0, Canadá

Thomas Coulson, Samantha MacEachern, Mahdis Sadat Tabatabaei y Alain Labbe

Instituto Canadiense de Investigación para la Seguridad Alimentaria, Universidad de Guelph, Guelph, ON, N1G 2W1, Canadá

Mansel William Griffiths

Departamento de Ciencias de la Alimentación, Universidad de Guelph, Guelph, ON, N1G 2W1, Canadá

Mansel William Griffiths

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MAC realizó los ensayos de citotoxicidad y las mediciones de carotenoides. MAC y SM realizaron las pruebas de MIC. MST realizó el fraccionamiento SEC. MAC, TC, AL y MWG proporcionaron análisis de datos e información sobre los resultados del ensayo. SB y AA realizaron imágenes y analizaron imágenes de microscopía. MAC y TC escribieron el manuscrito y prepararon las figuras.

Correspondencia a Thomas Coulson o Alain Labbe.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Cella, MA, Coulson, T., MacEachern, S. et al. La interrupción probiótica de la detección de quórum reduce la virulencia y aumenta la sensibilidad a la cefoxitina en Staphylococcus aureus resistente a la meticilina. Informe científico 13, 4373 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-31474-2

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Recibido: 09 noviembre 2022

Aceptado: 13 de marzo de 2023

Publicado: 16 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-31474-2

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La interrupción probiótica de la detección de quórum reduce la virulencia y aumenta la sensibilidad a la cefoxitina en la meticilina