El papel potencial del aceite de semillas de calabaza en el metotrexato

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 7321 (2023) Citar este artículo

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Muchos fármacos quimioterapéuticos provocan reacciones pulmonares adversas que conducen a una enfermedad pulmonar grave. Aunque el metotrexato (MTX) se usa para el tratamiento del cáncer y otras enfermedades, es altamente tóxico con múltiples efectos adversos, incluida la toxicidad pulmonar. Los aceites esenciales representan una frontera abierta para las ciencias farmacéuticas debido a su amplia gama de propiedades farmacológicas. Se utilizó aceite de semillas de calabaza (PSO) para investigar su capacidad para aliviar la toxicidad pulmonar inducida por metotrexato en ratas. El tejido pulmonar del grupo tratado con MTX reveló una disminución de malondialdehído, glutatión y óxido nítrico acompañado de una marcada inhibición de la actividad de la colinesterasa y un aumento de la actividad de la catalasa, el factor de necrosis tumoral-α, la interleucina-6 y los niveles del factor de crecimiento del endotelio vascular. El análisis de PSO reveló que el aceite era rico en ácido hexadecanoico, ésteres metílicos de decano, escualeno, polidecano, docosano y otros derivados. La administración de PSO mejoró los cambios oxidantes/antioxidantes y proinflamatorios inducidos por MTX en el tejido pulmonar. Los exámenes histológicos confirmaron la potencia de PSO en la reducción de las alteraciones histopatológicas inducidas por MTX. El análisis inmunohistoquímico mostró una disminución de la expresión del factor nuclear kappa B y de la caspasa 3 después de la PSO. Los presentes datos indicaron la eficacia protectora de PSO contra la lesión pulmonar inducida por MTX al disminuir el daño oxidativo, la inflamación y la apoptosis y, por lo tanto, podrían recomendarse como terapia adyuvante.

Los agentes quimioterapéuticos se usan ampliamente en neoplasias malignas sólidas y hematológicas. Las enfermedades pulmonares inducidas por la quimioterapia representan desafíos particulares para los profesionales de cuidados intensivos y pulmonares1. Muchos fármacos quimioterapéuticos contra el cáncer pueden causar neumonitis/fibrosis intersticial, que es la manifestación clínica más común asociada con el daño pulmonar inducido por fármacos2.

El metotrexato (MTX) es un antagonista del ácido fólico que inhibe de forma competitiva la dihidrofolato reductasa (DHFR), interrumpiendo la conversión de dihidrofolato en tetrahidrofolato, que es el principal donante de carbono para la síntesis de purinas y pirimidinas3. El metotrexato se utiliza como agente antineoplásico para el tratamiento de diferentes tipos de tumores malignos de órganos sólidos debido a sus efectos terapéuticos. Se usaban dosis altas de MTX para tratar ciertos tipos de cáncer pero desde 1990 se usa en dosis mucho más bajas para tratar enfermedades reumáticas4. El MTX ha demostrado eficacia en el tratamiento de varias otras enfermedades como la psoriasis, la artritis psoriásica, la enfermedad inflamatoria intestinal y la vasculitis de pequeños vasos5,6.

Sin embargo, se informó que el MTX es altamente citotóxico e induce múltiples efectos adversos potenciales. Esto limitó el uso de MTX debido a la alta incidencia de toxicidades asociadas como nefrotoxicidad7, hepatotoxicidad8, toxicidad pulmonar9, toxicidad cardiovascular10 y mucositis gastrointestinal11. La neumonitis por hipersensibilidad es el tipo más frecuente de toxicidad pulmonar relacionada con MTX12. La neumonitis subaguda por MTX se manifiesta por disnea, tos improductiva, fiebre y crepitantes con taquipnea en el examen físico, lo que lleva a la fibrosis pulmonar observada en aproximadamente el 10% de los pacientes con enfermedad de Crohn por MTX13.

La calabaza (Cucurbita spp.) de la familia de las Cucurbitáceas es una planta trepadora anual y un alimento tradicional conocido en Europa desde el siglo XVI. Varios estudios han destacado la eficacia protectora del aceite de semilla de calabaza (PSO) contra muchas enfermedades. Se han reportado sus potencias anticancerígena14, antidiabética15, antioxidante16, antiinflamatoria17, citoprotectora18 y antimutagénica19. Al-Okbi et al.17 informaron que el PSO inhibía significativamente los niveles elevados de factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) y malondialdehído (MDA) en plasma, lo que redujo la gravedad de la inflamación en el modelo de rata artrítica y produjo mejoras significativas en los niveles inflamatorio y oxidativo. biomarcadores de estrés.

Por lo tanto, el presente estudio fue diseñado para investigar el papel del PSO en el alivio de los efectos adversos del MTX en los niveles de parámetros oxidantes (malondialdehído y óxido nítrico) y antioxidantes (glutatión, catalasa y superóxido dismutasa), y las citocinas proinflamatorias (interleucina- 6 y TNF-α) en tejido pulmonar de rata macho adulta. Además, se estimó la actividad de la enzima colinesterasa y los niveles del factor de crecimiento del endotelio vascular responsable de la angiogénesis. Se realizó el análisis de PSO para identificar sus componentes activos. También se realizó la investigación histopatológica del tejido pulmonar además del examen inmunohistoquímico tanto del factor nuclear kappa-B como de la caspasa 3.

Cuarenta ratas albinas macho adultas, que pesaban entre 160 y 200 g, se compraron a un proveedor local. Todos los animales se alojaron y mantuvieron en jaulas en la casa de animales del Departamento de Zoología, Facultad de Ciencias, Universidad de El Cairo, en condiciones estándar de luz y temperatura (12 h de luz/oscuridad). Se alimentó a las ratas con un alimento para perros estándar y se les suministró agua ad libitum. Los animales se mantuvieron en observación durante aproximadamente 4 días para su adaptación antes del inicio del experimento. Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de El Cairo (CU-IACUC) No. CU/I/F/72/19. El estudio se realizó de conformidad con las directrices ARRIVE. Todos los métodos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices y reglamentos pertinentes.

El metotrexato fue suministrado por Mylan Company (Francia). PSO se compró a Elhawag Company for Natural oils and Cosmetics (Egipto) con licencia no. 159, 2150 en 2009. El glutatión, el yoduro de acetiltiocolina, el ácido 5,5'-ditiobis-2-nitrobenzoico (DTNB) y los tampones de fosfato se obtuvieron de Sigma Aldrich.

Se utilizaron cuarenta ratas en el presente experimento y se dividieron en cuatro grupos (diez ratas en cada grupo); grupo control (Cont), grupo aceite de semilla de calabaza (PSO), grupo metotrexato (MTX) y grupo MTX + PSO. El grupo de control recibió una única inyección intraperitoneal (ip) de solución salina (0,9 % NaCl) seguida de una administración oral de solución salina durante 7 días consecutivos. El segundo grupo fue el grupo PSO en el que a las ratas se les inyectó diariamente aceite de semillas de calabaza (PSO) mediante una sonda estomacal oral a una dosis de 1 ml/kg20 durante 7 días consecutivos. El tercer grupo representó el grupo de MTX en el que los animales fueron tratados con una única inyección ip de MTX a una dosis de 20 mg/kg según Saygin et al.21 seguida de una administración oral de solución salina durante 7 días consecutivos. El cuarto grupo fue el grupo MTX + PSO en el que los animales fueron tratados con una única inyección ip de MTX (20 mg/kg) seguida de PSO (1 ml/kg) durante 7 días consecutivos.

Las ratas fueron sacrificadas por decapitación repentina sin anestesia. Después de la decapitación, el tejido pulmonar de cada animal se extrajo cuidadosamente, se lavó con solución salina helada, se secó con papel de filtro, luego se cortó la mitad derecha del pulmón en una placa de vidrio helada y se congeló para su posterior análisis. Se homogeneizaron 5 mg de cada tejido pulmonar congelado en 5 ml de tampón fosfato 20 mM (pH 7,4). Los homogeneizados se centrifugaron a 3000 rpm durante 10 min a 4 °C y los sobrenadantes obtenidos se almacenaron a -25 °C hasta que se realizaron más investigaciones bioquímicas. La otra mitad del pulmón de todas las ratas tratadas se preparó para investigaciones histopatológicas e inmunohistoquímicas.

El análisis GC/MS de PSO se realizó utilizando una columna capilar de sílice fundida TG-5MS, Trace GC Ultra/ISQ Single Quadrupole MS Thermo Scientific (30 m, 0,251 mm, 0,1 mm de espesor de película). Para la detección por GC/MS, se utilizó un sistema de ionización de electrones con una energía de ionización de 70 eV. Se utilizó helio como gas portador a un caudal constante de 1 ml/min. La temperatura del inyector y de la línea de transferencia de MS se fijó en 280 °C. La temperatura del horno se programó a una temperatura inicial de 40 °C (mantener 3 min) hasta 280 °C como temperatura final a una velocidad creciente de 5 °C/min (mantener 5 min).

La cuantificación de todos los componentes identificados se investigó utilizando un área de pico relativa porcentual. Se realizó una identificación tentativa de los compuestos basada en la comparación de sus tiempos de retención relativos y espectros de masas con los datos de la biblioteca NIST, WILLY 9 del sistema GC/MS.

Malondialdehído (MDA; el producto final de la peroxidación lipídica) se determinó en homogeneizados de tejido pulmonar de rata de acuerdo con el método de Ohkawa et al.22 usando el kit No. MD 2529 (Biodiagnostic, Egypt). La reacción del ácido tiobarbitúrico (TBA) con MDA tiene lugar en medio ácido a una temperatura de 95 °C durante 30 min para formar sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS). La absorbancia de las muestras y el patrón se leyó frente al blanco a 534 nm en un espectrofotómetro Helios Alpha Thermospectronic (UVA 111615, Inglaterra). El contenido de malondialdehído en el homogeneizado de tejido pulmonar (muestra) se midió en nmol/g de tejido.

La concentración de GSH se midió utilizando el Kit No. GR 2511 (Bio diagnostic, Egipto) que se basa en el método descrito por Beutler et al.23. Este método se basa en la reducción de 5,5' ditiobis (ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB) con glutatión para producir un compuesto amarillo. El cromógeno reducido fue directamente proporcional a la concentración de glutatión reducido y su absorbancia se midió espectrofotométricamente a 405 nm. La concentración de GSH se expresó en mmol/g de tejido.

El óxido nítrico (NO) se sintetiza en el sistema biológico mediante la enzima óxido nítrico sintasa (NOS). Los productos finales del NO in vivo son nitrito (NO2-) y nitrato (NO3-). La determinación del contenido de NO se realizó según el método de Montgomery y Dymock24 que depende de la adición del reactivo de Griess en medio ácido. El reactivo de Griess convierte el nitrito en un compuesto azoico de color púrpura intenso. El ácido nitroso formado diazotiza la sulfanilamida y el producto se acopla con N-(1-naftil) etilendiamina. La absorbancia del colorante azoico de color púrpura rojizo formado se midió espectrofotométricamente a 540 nm en un espectrofotómetro Helios Alpha Thermospectronic (UVA 111615, Inglaterra).

La actividad de catalasa en homogeneizado de tejido pulmonar de rata se determinó por el método de Aebi25 usando el Kit No. CA 2517 (Biodiagnostic, Egypt). El método se basa en la reacción de CAT con una cantidad conocida de H2O2, ya que cada unidad de CAT descompone 1 µM de H2O2 por min a 25 °C, a pH 7.0. La reacción se detiene después de exactamente 1 min con inhibidor de catalasa. En presencia de peroxidasa de rábano picante (HRP), el H2O2 restante reacciona con el ácido 3,5 dicloro-2-hidroxibenceno sulfónico (DHBS) y 4-amino-fenazona (AAP) para formar un tinte de quinona imina cuya intensidad de color es inversamente proporcional a la cantidad de catalasa en la muestra. La descomposición de H2O2 fue seguida directamente por la disminución de la absorbancia a 240 nm. La diferencia en la absorbancia por unidad de tiempo es una medida de la actividad CAT.

La actividad de superóxido dismutasa (SOD) en homogeneizado de tejido pulmonar se analizó de acuerdo con el procedimiento de Nishikimi et al.26. El ensayo depende de la capacidad de la SOD para inhibir la reacción del colorante de nitroazul tetrazolio mediada por metosulfato de fenazina. SOD cataliza la dismutación del anión superóxido a oxígeno molecular y peróxido de hidrógeno. El aumento de absorbancia se midió a 560 nm durante 5 min a 25 °C para el blanco y la muestra.

El presente estudio utilizó una modificación del método de Ellman et al.27 descrito por Gorun et al.28. El método mide la tasa de producción de tiocolina a medida que avanza la hidrólisis de acetiltiocolina. ChE se incuba con acetiltiocolina durante un intervalo de tiempo específico y luego se detiene la reacción con un reactivo que contiene el indicador de color DTNB. El color se leyó inmediatamente a 412 nm y la actividad ChE se determinó como µmol SH/g tejido/min (grupo sulfhidrilo SH).

El factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) se midió utilizando el kit Elisa de TNF-α de rata, n.º de catálogo SG-20127, que se obtuvo de SinoGeneClon Biotech Co., Ltd. (Hangzhou, China). El color desarrollado se leyó a 450 nm usando un lector de placas de microtitulación. A continuación, se calculó la concentración a partir de una curva estándar.

La interleucina-6 (IL-6) se midió usando el kit Elisa de interleucina-6 de rata, número de catálogo SG-2026, que fue suministrado por SinoGeneClon Biotech Co., Ltd. (Hangzhou, China). El cambio de color se midió a una longitud de onda de 450 nm utilizando un lector de placas de microtitulación. A continuación, se determinó la concentración de IL-6 en las muestras a partir de una curva estándar.

El factor de crecimiento de células endoteliales vasculares (VEGF) se midió usando el kit Elisa de factor de crecimiento endotelial vascular de rata, número de catálogo SG-20402, que se adquirió de SinoGeneClon Biotech Co., Ltd. (Hangzhou, China). El cambio de color se midió a una longitud de onda de 450 nm. Luego se calculó la concentración comparando la densidad óptica de las muestras con la curva estándar.

Se recogieron secciones de pulmón de diferentes grupos y se conservaron en formalina tamponada neutra al 10% para evaluación histopatológica e inmunohistoquímica. Después de los pasos de deshidratación con alcohol e inclusión en parafina, los tejidos se cortaron a 5 µm de espesor en portaobjetos de vidrio. Se usaron tinciones de hematoxilina y eosina (H&E) para teñir las secciones de tejido. Las secciones de pulmón se examinaron con un microscopio de campo claro (Olympus BX43) y se capturaron imágenes digitales con una cámara digital fija (Olympus DP27). El sistema de puntuación pulmonar se realizó como se mencionó anteriormente29.

Sectas de pulmón. (5 μm) se cortaron de bloques de parafina en portaobjetos de vidrio cargados positivamente. Los pasos ordinarios de desparafinización y rehidratación se realizaron mediante una serie de grados de alcohol. Se llevó a cabo la recuperación del epítopo inducida por calor. Las secciones de pulmón se lavaron y luego se aplicó el bloqueo de proteínas usando albúmina de suero bovino (BSA) y peróxido de hidrógeno. Después de eso, los anticuerpos primarios (anti-NF-κB p65 monoclonal de ratón (sc-8008) se incubaron con caspasa-3 (sc-65497, Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, TX, EE. UU.) a una dilución de 1:150 durante la noche a 4 ° C. Después de eso, las secciones de tejido se incubaron con anticuerpo secundario anti-ratón de cabra marcado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Abcam, Cambridge, Reino Unido) durante 2 h y luego con el kit de detección de sustrato de 3,3′-diaminobencidina (DAB) ( Thermo Scientific). La contratinción se realizó con hematoxilina de Mayer, deshidratación seguida de aclaramiento de xileno y montaje en dibutilftalato poliestireno xileno (DPX). El % del área de reacción positiva se cuantificó con software digital (Cell Sens dimension, software Olympus). Paso de control negativo se logró omitiendo el paso de incubación del anticuerpo primario.

Todos los datos se expresaron como media ± error estándar de la media (SEM). La significancia se determinó en p < 0,05. Las comparaciones entre las medias de diferentes grupos de animales y las de los animales de control se llevaron a cabo utilizando un análisis de varianza (ANOVA) de una vía para cada intervalo de tiempo. Todos los análisis estadísticos se realizaron con SPSS (Statistical Package for Social Sciences, versión 14). Cuando fue estadísticamente significativa, la prueba ANOVA fue seguida por Duncan como prueba post hoc para comparaciones múltiples.

Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de El Cairo (IACUC) No. CU/I/F/72/19.

La identificación de los componentes del aceite de semilla de calabaza (PSO) se realizó en base a la comparación de su tiempo de retención relativo y espectros de masas con los datos de la biblioteca NIST, Willy 9 del sistema GC/MS. El espectro de los componentes desconocidos se comparó con el espectro de los componentes conocidos almacenados en la biblioteca Willy 9. Se determinaron el tiempo de retención, el nombre, el peso molecular y la estructura de los componentes de los materiales de prueba. El análisis GC/MS de PSO ha mostrado sus constituyentes fitoquímicos y sus picos (Fig. 1), que contribuyen a la actividad medicinal de la planta. La identificación de los componentes activos del PSO con su tiempo de retención y composición porcentual reveló que el PSO utilizado en este estudio era rico en ácido hexadecanoico (42,06 %), ésteres metílicos de decano (25,9 %), escualeno (11,16 %), polidecano (5,56 %). ), docosano (2,56%) y otros derivados (Cuadro 1).

El cromatograma y el espectro de los compuestos identificados del aceite de semilla de calabaza (PSO) usando la columna capilar de sílice fundida Trace GC Ultra / ISQ Single Quadrupole MS, TG-5MS.

Una sola inyección ip de MTX causó una marcada disminución en los niveles de MDA en el pulmón de ratas macho adultas después de ocho días de tratamiento (Fig. 2). La disminución observada en el nivel de MDA fue significativa al valor de p ˂ 0,05 en comparación con el grupo control, registrando una diferencia porcentual de -26,72%. La administración oral de PSO durante ocho días consecutivos indujo un ligero aumento no significativo en los niveles de MDA en los pulmones de ratas en comparación con el grupo control. El tratamiento de ratas inyectadas con MTX con PSO evitó el cambio en el nivel de MDA.

El efecto de la administración oral de aceite de semilla de calabaza (PSO) sobre los niveles de malondialdehído (MDA) (I), glutatión (GSH) (II), óxido nítrico (NO) (III) y catalasa (CAT) (IV), superóxido dismutasa ( SOD) (V), y actividades de colinesterasa (ChE) (VI) en pulmones de ratas intoxicadas con metotroxato. Letras diferentes indican medias significativamente diferentes (valor p ˂ 0,05). Mismas letras indican cambios no significativos.

La inyección intraperitoneal de MTX provocó una disminución no significativa de los niveles de GSH en los pulmones de las ratas tratadas con MTX en comparación con el grupo control y el grupo de MTX tratado con PSO (fig. 2). Sin embargo, la administración oral diaria de PSO indujo un aumento no significativo en el contenido de GSH en el tejido pulmonar de ratas tratadas con MTX + PSO en comparación con el valor de control.

Los datos representados en la Fig. 2 revelaron que una sola inyección de MTX a ratas macho adultas indujo una marcada disminución en los niveles de NO en el registro pulmonar: 49,13 % por debajo de los niveles de control. La administración oral de PSO mejoró ligeramente los niveles de NO de −49,13 a −37,68 % en tejido pulmonar de rata en comparación con los valores de control.

Los presentes datos demostraron que las ratas inyectadas con MTX mostraron un aumento significativo en la actividad CAT, siendo un 44,3% por encima de los valores de control. El tratamiento de ratas intoxicadas con MTX con PSO indujo un aumento en la actividad de CAT con una diferencia porcentual del 41,1% en comparación con el grupo control (Fig. 2).

El análisis de los datos relativos a la actividad de SOD en el tejido pulmonar de los grupos investigados produjo cambios no significativos con una ligera disminución en la actividad enzimática después de los tratamientos con PSO y MTX solos o combinados entre sí (Fig. 2).

Se encontró que una sola inyección de MTX inducía una marcada inhibición en la actividad enzimática de la colinesterasa registrando un 40,5% por debajo de los valores de control (Fig. 2). Cuando las ratas intoxicadas con MTX fueron tratadas diariamente con PSO durante ocho días, se obtuvo una mejora en la actividad enzimática, siendo -34,8% pero aún significativamente menor que el grupo control.

Una sola inyección ip de MTX indujo una elevación significativa en el nivel de TNF-α en los pulmones de ratas registrando una diferencia porcentual del 19,10 % frente a los valores de control (Fig. 3). El tratamiento diario de ratas intoxicadas con MTX con PSO durante ocho días mejoró el aumento de TNF-α en el tejido pulmonar y redujo la diferencia porcentual a -5,11 % en comparación con el grupo de control.

El efecto de la administración oral de aceite de semilla de calabaza (PSO) en los niveles del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) (I), la interleucina-6 (IL-6) (II) y el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) (III) en pulmones de ratas intoxicadas con metotrexato. Letras diferentes indican medias significativamente diferentes (valor p ˂ 0,05). Mismas letras indican cambios no significativos.

Los niveles de interleucina-6 (IL-6) en el tejido pulmonar de las ratas tratadas con PSO mostraron una disminución no significativa (-31,77 %) en comparación con el grupo control (Fig. 3). Por el contrario, la inyección de MTX provocó un aumento no significativo de IL-6 registrando un 26,93% por encima del grupo control. La administración oral diaria de PSO a ratas inyectadas con MTX durante ocho días atenuó el aumento de IL-6 resultante de la inyección de MTX reduciendo la diferencia porcentual de 26,93 a 2,32%.

Se registró un marcado aumento en los niveles de VEGF en tejido pulmonar de ratas inyectadas con MTX (Fig. 3). El aumento observado fue significativo al valor de p ˂ 0,05 frente a los grupos de control y PSO y registró un 45,98 % en comparación con los valores de control. El tratamiento de ratas inyectadas con MTX con PSO indujo una disminución no significativa de los niveles de VEGF tras 8 días de tratamiento, reduciéndose la diferencia porcentual del 45,98% tras MTX a -26,89% tras PSO.

Las secciones de pulmón de los grupos control y PSO mostraron una estructura histológica normal del tejido pulmonar sin alteraciones detectables. Por el contrario, el examen del grupo MTX reveló una lesión pulmonar grave. El tejido intersticial estaba marcadamente expandido con infiltración de numerosas células mononucleares inflamatorias asociadas con abundante edema y áreas hemorrágicas variables. Los bronquios y los bronquiolos mostraban exudados mucosos en sus lúmenes mezclados con células epiteliales desprendidas, células inflamatorias y restos de tejido. La administración de PSO a ratas intoxicadas con MTX indujo una marcada protección del tejido pulmonar que se caracterizó por un menor número de infiltración de células inflamatorias, edema leve y hemorragias que ocupaban los alvéolos pulmonares y los tabiques interalveolares. El sistema de puntuación pulmonar reveló un aumento significativo en el grupo MTX en comparación con los grupos control o PSO en todos los parámetros evaluados. Sin embargo, el grupo MTX + PSO mostró una disminución significativa en comparación con el grupo MTX en cuanto a edema e inflamación (Fig. 4).

Efecto de PSO en la recuperación del tejido pulmonar de la lesión pulmonar inducida por MTX (H&E). Los grupos control y PSO mostraron una estructura histológica normal de alvéolos pulmonares, bronquios y tejido intersticial. El grupo MTX mostró una neumonía intersticial severa con abundante edema y abundante infiltración de células inflamatorias mononucleares, el mayor aumento (20x) mostró que la luz bronquiolar estaba ocluida con exudado mucoso y células inflamatorias con células epiteliales descamadas. El grupo MTX + PSO mostró una marcada reducción de la reacción inflamatoria en el parénquima pulmonar. El gráfico representa la puntuación de lesión pulmonar de diferentes grupos. Los valores se expresan como medias ± SE. @ significativo de Con, # significativo de MTX. Se considera diferencia significativa a p < 0,05.

La evaluación de caspasa-3 y NF-kβ se realizó en secciones de pulmón de diferentes grupos. Con respecto a la tinción inmune de caspasa-3, el control y PSO mostraron una expresión de débil a negativa en el revestimiento alveolar y en el tejido intersticial. Sin embargo, se detectó una fuerte expresión positiva de caspasa-3 en el tejido intersticial, los alvéolos y el epitelio de revestimiento de los bronquios y bronquiolos del grupo MTX. Se detectó expresión moderada en el grupo MTX + PSO. Se obtuvieron resultados similares en la tinción inmune de NF-kβ. El análisis estadístico del % de expresión del área mostró un aumento significativo en el grupo MTX en comparación con otros grupos con respecto a la tinción de caspasa-3 y NF-kβ (Fig. 5).

Tinción inmunohistoquímica de caspasa-3 y NF-kβ en diferentes grupos. Los grupos control y PSO mostraron expresión limitada a negativa en ambos marcadores. MTX mostró una fuerte expresión positiva en las secciones de pulmón inflamado con respecto a caspasa-3 y NF-kβ. Se detecta una disminución notable en la tinción inmune en el grupo MTX + PSO tanto de caspasa-3 como de NF-kβ. Los gráficos representan el porcentaje de área de expresión de marcadores inmunitarios en diferentes grupos. Los valores se expresan como medias ± SE. @ significativo de Con, # significativo de MTX. Se considera diferencia significativa a p < 0,05.

El daño pulmonar puede resultar de la toxicidad pulmonar inducida por fármacos o de la inflamación mediada por autoinmunidad12. El uso terapéutico del MTX está limitado por su toxicidad21 que conduce a la alteración de la pauta posológica oa la retirada total del fármaco12.

Los niveles elevados de marcadores inflamatorios, TNF-α, IL-6 y VEGF, en el presente estudio, demuestran claramente los efectos proinflamatorios citotóxicos del MTX en el tejido pulmonar. El aumento de las citocinas proinflamatorias puede explicarse por la capacidad del MTX para regular al alza la expresión y secreción de estas citocinas, lo que puede aumentar aún más la producción de ROS y el daño subsiguiente del tejido pulmonar.

En comparación con otros órganos, los pulmones son muy vulnerables ya que están directamente expuestos a altos niveles de oxígeno atmosférico. Por lo tanto, el epitelio respiratorio es un objetivo importante para el estrés oxidativo. Por lo tanto, los sistemas de defensa antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos en el pulmón son ricos y altamente eficientes para protegerlo del daño inducido por oxidantes30.

El presente estudio reveló que una sola inyección de MTX provocó una disminución significativa en el contenido de los marcadores oxidativos MDA y NO, y una disminución no significativa en los niveles de GSH y la actividad de SOD en pulmones de rata. Sin embargo, se registró una elevación en la actividad CAT en el tejido pulmonar de ratas inyectadas con MTX.

El estrés oxidativo induce un daño mediado por radicales en las biomembranas celulares que provocan la peroxidación lipídica, lo que conduce a la generación de productos oxidados capaces de modificar el ADN, las proteínas y otras macromoléculas31. Las especies reactivas de oxígeno (ROS) se dirigen a las principales macromoléculas celulares que conducen a su daño y, posteriormente, a la muerte celular en respuesta a la agresión oxidativa. Esto desencadena el inicio y la progresión del daño tisular y el oxígeno puede aumentar la exposición activa a los radicales libres32. La presente inflamación inducida por MTX sugiere que la producción de ROS puede estar en progreso. El aumento de la enzima CAT apoya esta noción.

Los resultados del examen histopatológico del presente estudio indicaron una lesión pulmonar grave en el grupo tratado con MTX, que reveló un marcado tejido intersticial expandido con numerosas células inflamatorias mononucleares, infiltración, edema abundante y áreas hemorrágicas variables con exudados mucosos en la luz de los bronquios y bronquiolos mixtos. con células epiteliales desprendidas, células inflamatorias y restos de tejido. Asimismo, se ha demostrado que la toxicidad pulmonar inducida por MTX se correlacionó con la neumonitis por hipersensibilidad33 caracterizada por infiltración intersticial de linfocitos con hiperplasia, formación de pequeñas áreas granulomatosas y en ocasiones infiltración eosinofílica, otros patrones de neumonitis obstructiva, neumonía intersticial aguda, fibrosis pulmonar y derrame pleural34.

Los hallazgos presentes no concuerdan con el aumento informado en el nivel de MDA y la disminución en las actividades de CAT y SOD en pulmón de rata después de MTX35. Esto puede explicarse por el corto intervalo de tiempo aplicado en el presente estudio. Por lo tanto, la actividad de SOD y el nivel de GSH no cambiaron en comparación con el control. Sin embargo, el aumento presente en la actividad de CAT después de MTX sugiere que esta enzima es el primer antioxidante en responder a la generación de radicales libres en el tejido pulmonar.

Las alteraciones histopatológicas observadas en el presente estudio indican lesión pulmonar severa por MTX. La progresión del daño tisular conducirá finalmente a la disminución de los niveles de MDA debido a la muerte celular. Varios estudios histopatológicos revelaron que la lesión pulmonar inducida por MTX causaba inflamación y congestión linfocitaria significativa con hiperplasia de neumocitos, degeneración epitelial y depósito de tejido fibroso36. La lesión de las células epiteliales pulmonares que recubren los espacios aéreos aumenta la secreción de moco, aumenta la entrada de neutrófilos en los pulmones y activa los factores de transcripción y la expresión génica de mediadores proinflamatorios37. Esto explica la presencia de exudados mucosos en la luz de los bronquios y bronquiolos entre varias células y restos de tejido en las secciones de pulmón de ratas tratadas con MTX.

La catalasa cataliza la dismutación del peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno38. En el pulmón, la CAT se localiza en neumocitos alveolares tipo II y macrófagos39. Se considera que es la enzima antioxidante más importante que consume peróxido de hidrógeno exógeno en los neumocitos tipo II, que son los tipos de células más resistentes en el pulmón40. El aumento significativo en la actividad de CAT, en el presente estudio, en el tejido pulmonar después de la inyección de MTX enfatiza la importancia de la catalasa como un antioxidante importante que confiere protección al pulmón en condiciones de mayor estrés oxidativo.

Hay tres isoformas de NOS en el sistema respiratorio humano. Se detectó NOS neuronal (nNOS) en el sistema nervioso no adrenérgico no colinérgico, los nervios de las vías respiratorias y el epitelio. La NOS endotelial (eNOS) está presente principalmente en las células endoteliales de la vasculatura pulmonar, mientras que la NOS inductiva (iNOS) se ha asociado con respuestas proinflamatorias y antiinflamatorias. Todas las isoformas transforman la L-arginina en L-citrulina y liberan óxido nítrico41. Cualquier cambio en su actividad puede conducir a la alteración del nivel de NO y contribuir a la patogenia de diversas enfermedades respiratorias42.

Se ha reportado que la eNOS es activada por TNF-α y otros estímulos inflamatorios43. Se puede sugerir que la activación de eNOS por las citoquinas inflamatorias elevadas inducidas por MTX puede conducir a la generación de NO que interactúa con peroxinitrito productor de radicales superóxido44. Este es un oxidante fuerte y puede precipitar el daño celular ya sea directamente por la nitración de la tirosina que conduce a la disfunción irreversible de proteínas importantes, o indirectamente al iniciar la producción de otras moléculas reactivas con toxicidad celular42,45. Se informó que el NO ejerce efectos vasoprotectores sobre el endotelio manteniendo los vasos sanguíneos dilatados y también controlando la presión arterial46. La reducción del NO puede interferir con sus efectos vasoprotectores, promoviendo así la toxicidad del MTX en el tejido pulmonar.

Varios estudios señalaron los efectos terapéuticos prometedores de PSO14,15,16,17,18,19. Los presentes resultados revelaron que la capacidad de PSO para atenuar los cambios bioquímicos inducidos por MTX en el pulmón de rata fue evidente después de la administración de PSO durante 8 días consecutivos. PSO mantuvo MDA y GSH cerca de los niveles de control y mejoró ligeramente los niveles de NO en tejido pulmonar de rata en comparación con los valores de control. El tratamiento de ratas inyectadas con MTX con PSO también mantuvo la mayor actividad de CAT en el tejido pulmonar.

El análisis de PSO mediante GC/MS, en el presente estudio, mostró su riqueza en ácido hexadecanoico, ésteres metílicos de decano, escualeno, polidecano, docosano y otros derivados. Los ácidos hexadecanoico y octadecanoico fueron documentados como agentes antioxidantes47, anticancerígenos48, antiapoptóticos49 y antiinflamatorios47. Los presentes resultados relacionados con el análisis de los componentes activos de PSO estaban en línea con otros estudios que informaron altas cantidades de ácidos grasos libres (ácidos oleico, linoleico, palmítico y esteárico) en el aceite de calabaza50,51. Además, los resultados del presente estudio también concuerdan con los de Omar y Sarhan52, quienes atribuyeron a su composición la mejora en el modelo de neumonía por aspiración de ácido después del tratamiento con aceite de semilla de calabaza.

El escualeno es un triterpeno isoprenoide lipofílico que contribuye al efecto antioxidante del aceite de calabaza como protector contra la peroxidación lipídica de la membrana53. Se informó que la oxidación del escualeno ocurre antes que la de otros lípidos, bloqueando las reacciones peroxidativas ya que rompe las cadenas de peroxidación lipídica, estabilizando y protegiendo así las membranas celulares54. Además, la evidencia emergente apoyó la participación del escualeno en la regulación de la expresión y activación de glutatión peroxidasa, CAT, SOD y glutatión S-transferasa, la prevención de alteraciones de SOD y CAT y la reconstitución de GSH55.

Además, se informó que PSO disminuye la actividad de GST que cataliza la conjugación de GSH y la actividad de GR, pero eleva el nivel de GSH, lo que indica una menor renovación de GSH, un regulador esencial del estado redox celular56. La presente actividad elevada de CAT reflejó mayores concentraciones de peróxido de hidrógeno en el tejido pulmonar de ratas expuestas a MTX, y la persistencia de PSO en la reducción de la alta afluencia de peróxido de hidrógeno.

Se puede sugerir que la capacidad de PSO para mantener los niveles elevados de CAT inducidos por MTX, en el presente estudio, se debió a los potentes componentes antioxidantes de PSO. La elevada actividad de CAT puede indicar una mayor producción de radicales libres como peróxido de hidrógeno y respalda el papel de CAT como uno de los antioxidantes importantes en el tejido pulmonar. Varios informes confirmaron la potencia de diferentes constituyentes de PSO. Eraslan et al.57 sugirieron que el aceite de semilla de calabaza podría haber causado alteraciones fisiológicas en las actividades de la SOD pulmonar, la CAT cerebral y la GSH-Px hepática después de la intoxicación subaguda con aflatoxinas en ratones debido a su potencial para eliminar los radicales libres generados en condiciones biológicas normales. De manera similar, también se ha informado que el aceite/extracto/aislado de semilla de calabaza altera las mismas actividades enzimáticas antioxidantes58. Recientemente, se ha informado que el tratamiento de ratones diabéticos con escualeno al 2% aumentó la actividad de la catalasa hepática y la glutatión peroxidasa, mientras que una dosis de 600 mg de escualeno aumentó la actividad de la catalasa y la superóxido dismutasa y redujo los niveles de peróxido de hidrógeno59.

De acuerdo con los presentes hallazgos, Shaban et al.60 sugirieron que las actividades antioxidantes de los extractos de granada podrían estar relacionadas con sus componentes, incluidos los componentes fenólicos, los ácidos grasos (como el ácido punícico y los ácidos α-linolénicos conjugados), los fitoesteroles y los triterpenoides. . Además, Habashy et al.61 encontraron que la mejora del sistema de defensa antioxidante por la fracción de polifenoles de Vitis vinifera (VVPF) en el tejido pulmonar fue mayor que en otros órganos estudiados y sugirieron que esto puede deberse al potente poder reductor de VVPF y su capacidad para apagar el radical ABTS. Esta potencia se relacionó con el contenido fenólico de VVPF, incluidos los ácidos vainílico, gálico, cafeico, p-cumárico, siríngico, ferúlico, salicílico y elágico, junto con los flavonoides y el resveratrol y su eficacia en la eliminación de radicales peróxido, superóxido e hidróxido62 .

Omar y Sarhan52 encontraron que el aceite de calabaza atenuaba parcialmente las alteraciones histológicas y ultraestructurales y reducía la expresión inmunitaria de la NO sintasa inducible en el tejido pulmonar del modelo de neumonía por aspiración ácida inducida experimentalmente.

Por lo tanto, el fracaso de PSO para restaurar la disminución actual en los niveles de NO puede deberse a la expresión reducida de iNOS que afecta la producción de NO en el tejido pulmonar de las ratas tratadas con MTX. Esto puede ser beneficioso para reducir el estrés nitrosativo y la formación de peroxinitritos en estos animales.

En el presente estudio, la inyección de MTX resultó en una marcada reducción de la actividad de la colinesterasa (ChE) en el tejido pulmonar. Además de su papel clásico en la hidrolización de la acetilcolina (ACh) en los sistemas nerviosos central y periférico, la acetilcolinesterasa (AChE) también se asoció con respuestas de estrés e inflamación63. Se observaron alteraciones estructurales y de expresión anormal de AChE en diferentes tumores, ya que la actividad reducida puede contribuir al crecimiento del cáncer de pulmón64. Por otro lado, se encontró que la AChE está involucrada en la supresión tumoral por su participación en la apoptosis, lo que indica su papel potencial como marcador y regulador de la apoptosis y el desarrollo tumoral65.

La reducción actual en la actividad de ChE en el tejido pulmonar de ratas intoxicadas con MTX puede deberse al estado de inflamación y la posterior generación de ROS que se desarrolló en el tejido pulmonar. El estudio de Tsakiris et al.66 reveló que la AChE es muy sensible a los radicales libres y que los radicales hidroxilo participan en la inhibición de la AChE. La disminución de la actividad enzimática también puede estar relacionada con el mecanismo de acción del MTX debido a la implicación de la enzima en la tumorogénesis y proliferación.

Los informes pioneros destacaron el papel potencial del ácido oleico en el sistema colinérgico67 y mostraron una actividad similar a la colina acetiltransferasa (ChAT) responsable de una mayor producción de ACh por parte de sinaptosomas de cerebro de rata aislados unidos a las membranas plasmáticas neuronales. Además, se ha informado que el ácido oleico aumenta la captación de colina68 y afecta la expresión de ChAT, que probablemente promueve la producción de ACh69. Además, Abed et al.70 informaron que el escualeno y el ácido palmítico exhibieron diferentes tasas de inhibición contra la AChE.

La incapacidad de PSO para restaurar la actividad de ChE en intoxicados con MTX puede explicarse por dos mecanismos. En primer lugar, los componentes de PSO aumentan la captación de colina y la actividad de colina acetiltransferasa e inhiben la actividad de ChE y, por lo tanto, promueven la transmisión colinérgica. En segundo lugar, la disminución de ChE puede ser un mecanismo compensatorio que tiene como objetivo aumentar la ACh, ya que las fuentes neuronales o no neuronales de ACh podrían disminuir la inflamación por su acción local sobre los macrófagos, a través del receptor de ACh nicotínico alfa-7, reduciendo así la translocación nuclear de la transcripción. factor NF-κB y producción de macrófagos de la citocina proinflamatoria TNF-α71.

Los niveles elevados de TNF-alfa e IL-6, en el presente estudio, indican que el MTX tiene efectos proinflamatorios en el tejido pulmonar.

El TNF-alfa es una potente citocina proinflamatoria responsable de la patogenia de las enfermedades inflamatorias crónicas y el estrés oxidativo. Sus acciones se logran regulando el crecimiento, proliferación, diferenciación y viabilidad de los leucocitos activados, induciendo la liberación celular de otras citoquinas y quimioquinas72 y asegurando la muerte de las células dañadas por apoptosis17. La unión del TNF-α a su receptor desencadenó y propagó las cascadas de señalización que conducen al desarrollo de inflamación local o sistémica que activa el NF-κB formando un mecanismo de retroalimentación positiva que potenció el proceso inflamatorio17,72.

IL-6 es una citocina pleiotrópica que tiene propiedades tanto proinflamatorias como antiinflamatorias. Es producido por diferentes células inmunitarias y se sinergiza con TNF-alfa e IL-1 para promover la respuesta inflamatoria sistémica73.

Los estudios documentaron un aumento de TNF-alfa, interleucina-1 (IL-1), interleucina-8 (IL-8) y proteína quimiotáctica de monocitos-1 en la toxicidad pulmonar aguda inducida por MTX74,75. Kurt et al.76 atribuyeron los altos niveles de TNF-alfa, MDA, mieloperoxidasa (un componente del sistema de defensa antioxidante) y tejido endotelial-1 (un potente vasoconstrictor) a la inhibición de la infiltración de macrófagos tisulares en el pulmón de ratas intoxicadas con MTX que afecta la síntesis de interleucinas. El aumento actual tanto de TNF-alfa como de IL-6 confirma un papel proinflamatorio de estas citoquinas en la toxicidad inducida por MTX.

Se ha sugerido que la acción del MTX sobre las citocinas proinflamatorias está mediada por NF-kB. La inyección de MTX, en el presente estudio, mostró una fuerte expresión positiva de NF-kB en las secciones de pulmón inflamado. La activación de NF-kB puede desencadenar cascadas involucradas en la expresión de iNOS e inicio de inflamación, proliferación celular, respuesta inmune y apoptosis77. Es activado por numerosos estímulos como citocinas proinflamatorias (TNF-alfa o IL-1β)78. Por lo tanto, la presente expresión incrementada de NF-kB puede estar mediada por la activación de TNF-α e IL-6 en el tejido pulmonar de rata por inyección de MTX.

Los presentes resultados destacaron la inhibición de las citoquinas proinflamatorias como uno de los mecanismos por los cuales el PSO supera la toxicidad del MTX.

Se informó que el aceite de calabaza contiene polifenoles y otros fitoquímicos bioactivos con efectos antiinflamatorios79. Lai et al.80 indicaron que la reducción del infiltrado celular inflamatorio y el porcentaje de área de fibras colágenas después de la administración de aceite de calabaza en el pulmón del grupo de aceite de calabaza y aspiración ácida se atribuyeron a los constituyentes de ácidos grasos libres insaturados en el aceite de calabaza.

Al-Okbi et al.17 atribuyeron la bioactividad del PSO al ácido linoleico que representaba un tercio del total de ácidos grasos. Los ácidos grasos omega-3 pueden regular la síntesis de mediadores lipídicos, la liberación de citoquinas y activar los glóbulos blancos y las células endoteliales, regulando así la respuesta inflamatoria excesiva del cuerpo para reducir la inflamación pulmonar47,81.

Los resultados del presente estudio sobre el nivel del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) indicaron una elevación significativa del nivel de VEGF en tejido pulmonar de rata del grupo tratado con MTX.

La fuente predominante de VEGF en el pulmón es el epitelio alveolar, además de las células del músculo liso, los macrófagos y las células endoteliales que expresan VEGF. Los altos niveles de VEGF persisten en los pulmones en la edad adulta82, lo que sugiere su papel en el mantenimiento normal de los pulmones y en la patogenia del síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA)83.

Por lo tanto, el aumento en los niveles de VEGF pulmonar, en el presente estudio, después de MTX podría ser secundario al aumento en la producción de citocinas, ya que se ha informado que el TNF-α y la IL-6 regulan al alza la producción de VEGF en la artritis reumatoide (AR)84.

Se ha informado que la aplicación de ácidos grasos omega-3 redujo rápidamente la reacción inflamatoria del tejido pulmonar, al transformar el leucotrieno B4, que agrava la reacción inflamatoria, en leucotrieno serie B5 (menos activo), reduciendo así el edema pulmonar y mejorando la permeabilidad vascular pulmonar85 . Huang et al.86 concluyeron que los ácidos omega-3 pueden mejorar la función respiratoria y el estado respiratorio de los pacientes con lesión pulmonar aguda (ALI) y sugirieron que los ácidos grasos omega-3 podrían ser una estrategia potencial efectiva y segura para el tratamiento de ALI. La restauración actual de los niveles de VEGF después del tratamiento con PSO puede atribuirse a las potentes propiedades antiinflamatorias de los componentes de PSO.

La apoptosis es un proceso crítico y vital que ocurre durante la toxicidad inducida químicamente. El presente estudio mostró una marcada expresión positiva fuerte del marcador apoptótico caspasa-3 en el tejido intersticial, alvéolos y epitelio de revestimiento de bronquios y bronquiolos del grupo MTX mediante análisis inmunohistoquímico. Caspasa-3 es un elemento clave en el proceso apoptótico y señala la inducción de la muerte celular79. La caspasa-3 se consideró un valioso marcador de apoptosis87. Esto puede explicar la lesión pulmonar grave detectada en ratas intoxicadas con MTX.

Los presentes hallazgos concuerdan con los resultados de Kurt et al.76 quienes encontraron un daño histológico similar en el grupo de MTX con alta expresión de caspasa-3. Los autores atribuyeron estos cambios a niveles excesivos de citoquinas, secreción endotelial-1 y formación de ROS, que activan la vía de la caspasa-3 y causan daño pulmonar. El desmoronamiento de las cadenas peptídicas, la modificación de la carga eléctrica con el entrecruzamiento de proteínas y la oxidación de aminoácidos específicos, debido a las ERO y el aumento de la susceptibilidad a la proteólisis por proteasas precisas88, pueden ser la base de la fuerte expresión positiva de caspasa-3 y NF-κB detectada en el análisis inmunohistoquímico en el presente estudio en el tejido intersticial pulmonar, alvéolos y epitelio de revestimiento de bronquios y bronquiolos del grupo MTX.

En el presente estudio, el PSO produjo su efecto protector al reducir la inflamación y la apoptosis, atenuando y aliviando así el daño pulmonar inducido por MTX, como se evidencia en el examen histopatológico que mostró una marcada protección del tejido pulmonar con un menor número de células inflamatorias, leve edema y hemorragia. en el grupo MTX + PSO. Usando la técnica inmunohistoquímica, PSO también demostró ejercer un efecto antiapoptótico al reducir la expresión de caspacio 3 en el tejido pulmonar de ratas inyectadas con MTX.

De acuerdo con los resultados del presente estudio, se puede concluir que una sola inyección de MTX induce toxicidad pulmonar mediada por el aumento de ROS, citocinas proinflamatorias y factores de transcripción (NF-kappa). Estas alteraciones conducen eventualmente a la apoptosis y daño pulmonar severo. Un hallazgo novedoso del presente estudio fue la reducción de la citotoxicidad y, por lo tanto, de la lesión pulmonar inducida por MTX después de la PSO. La administración oral de PSO mejoró la mayoría de los cambios inducidos por MTX a través de la potente actividad antioxidante, antiinflamatoria y antiapoptótica de sus constituyentes. Los hallazgos bioquímicos coincidieron con el examen histológico indicando una marcada protección del tejido pulmonar después de la PSO. La limitación del presente estudio fue el uso de una dosis única de MTX y el corto período experimental.

Por tanto, la toxicidad pulmonar del MTX debe tenerse en cuenta durante su uso en quimioterapia y en el tratamiento de la AR y otras enfermedades, especialmente en pacientes que padecen trastornos pulmonares. Los pacientes bajo tratamiento con MTX también deben ser monitoreados regularmente para asegurar que sus pulmones no se vean afectados por el tratamiento con MTX. El uso de antioxidantes naturales y agentes antiinflamatorios también es muy recomendable en pacientes bajo quimioterapia.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado. Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con las directrices ARRIVE.

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Financiamiento de acceso abierto proporcionado por The Science, Technology & Innovation Funding Authority (STDF) en cooperación con The Egyptian Knowledge Bank (EKB). Este trabajo fue apoyado por fondos de investigación de la Universidad de El Cairo.

Departamento de Zoología, Facultad de Ciencias, Universidad de El Cairo, Giza, Egipto

Aya M. Abosrea, Heba S. Aboul Ezz, Sahar M. Mahmoud y Nawal A. Ahmed

Departamento de Patología, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad de El Cairo, Giza, Egipto

Mohamed R. Mousa

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Todos los autores contribuyeron a la concepción y el diseño del estudio. La preparación del material, la recopilación de datos y los análisis bioquímicos fueron realizados por AMA, HSAE, SMM Los estudios histológicos e inmunohistoquímicos fueron realizados por MRM El primer borrador del manuscrito fue escrito por AMA y todos los autores comentaron las versiones anteriores del manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final. La revisión final y aprobación fueron realizadas por NAA Los autores dan su consentimiento para la publicación.

Correspondencia a Heba S. Aboul Ezz.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Abosrea, AM, Aboul Ezz, HS, Mahmoud, SM et al. El papel potencial del aceite de semillas de calabaza en la toxicidad pulmonar inducida por metotrexato. Informe científico 13, 7321 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34143-6

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Recibido: 15 julio 2022

Aceptado: 25 de abril de 2023

Publicado: 05 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34143-6

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