Exploración de las actividades antimicrobiana, antioxidante, anticancerígena, de biocompatibilidad y larvicida de las nanopartículas de selenio fabricadas por la cepa de hongos endófitos Penicillium verhagenii

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 9054 (2023) Citar este artículo

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En este documento, se utilizaron cuatro cepas de hongos endófitos que viven en raíces sanas de ajo para producir nanopartículas de selenio (Se-NP) mediante síntesis verde. Se encontró que Penicillium verhagenii es el productor de Se-NP más eficiente con un color rojo rubí que mostró una resonancia de plasmón superficial máxima a 270 nm. Las Se-NP formadas eran cristalinas, esféricas y bien dispuestas sin agregación, y tenían un tamaño de 25 a 75 nm con un valor de potencial zeta de -32 mV, lo que indica una alta estabilidad. Se observaron actividades biomédicas dependientes de la concentración de las Se-NP basadas en P. verhagenii, incluida una actividad antimicrobiana prometedora contra diferentes patógenos (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Candida albicans, C. glabrata, C. tropicalis y C. parapsilosis) con una concentración inhibitoria mínima (MIC) de 12,5–100 µg mL–1. Las Se-NP biosintetizadas mostraron una alta actividad antioxidante con porcentajes de eliminación de DPPH de 86,8 ± 0,6 % a una concentración de 1000 µg mL–1 y disminuyó a 19,3 ± 4,5 % a 1,95 µg mL–1. Curiosamente, las Se-NP también mostraron actividad anticancerígena contra las líneas celulares PC3 y MCF7 con IC50 de 225,7 ± 3,6 y 283,8 ± 7,5 µg mL–1, respectivamente, mientras que permanecieron biocompatibles con las líneas celulares normales WI38 y Vero. Además, las Se-NP sintetizadas en verde fueron eficaces contra larvas en estadio de un insecto médico, Aedes albopictus, con una mortalidad máxima de 85,1 ± 3,1, 67,2 ± 1,2, 62,10 ± 1,4 y 51,0 ± 1,0 % a una concentración de 50 µg mL–1 para larvas de I, II, III y IV estadio, respectivamente. Estos datos destacan la eficacia de las cepas de hongos endófitos para la síntesis rentable y ecológica de Se-NP con diferentes aplicaciones.

El selenio es un oligoelemento importante para el florecimiento de microorganismos y un micronutriente esencial para la salud animal y humana. A pesar de sus propiedades beneficiosas, se rige por una ventana terapéutica estrecha. La ingesta excesiva de compuestos de selenio orgánicos e inorgánicos puede provocar toxicidad. Afortunadamente, las nanopartículas de selenio (Se-NP) son menos tóxicas que los compuestos de selenio orgánicos e inorgánicos1. Los nanomateriales (1–100 nm) son únicos en muchas propiedades químicas y físicas que los distinguen de sus contrapartes en materiales a granel. Estos materiales han sido adoptados y aplicados en campos agrícolas, ambientales y médicos2,3. Además, las Se-NP biosintetizadas se distinguen de las fabricadas por métodos químicos y físicos en que son más compatibles con los tejidos y órganos humanos4. Las rutas de síntesis biológica se han explorado utilizando plantas y hongos para producir nanopartículas de manera sostenible y ambientalmente segura5,6. Los endófitos son microorganismos que incluyen hongos, bacterias y actinomicetos que colonizan los tejidos internos de las plantas sin causar ningún síntoma patológico o dañino7. Recientemente, los microbios endófitos han surgido en el campo de la nanobiosíntesis debido a su producción eficiente de metabolitos activos potencialmente utilizados para la fabricación de NP de diferentes formas y tamaños con gran estabilidad. En este contexto, los hongos endófitos son superiores a otras especies fúngicas en cuanto a la cantidad y actividad de los metabolitos producidos8. Estudios previos indicaron que los endófitos podrían lograr muchos metabolitos secundarios biológicamente activos dentro de la planta huésped, como flavonoides, alcaloides, saponinas, sesquiterpenos, ciclopéptidos, policetonas, ácidos orgánicos y lactonas. Además, la planta huésped y sus simbiontes endófitos comparten muchas propiedades biológicas, como actividades anticancerígenas, antimicrobianas, anti-VIH y antiinflamatorias9.

Allium sativum L. (Ajo) es una planta perenne ampliamente utilizada durante más de 4000 años como agente de curado en la medicina tradicional. Los papiros egipcios registraron recetas para el uso del ajo en el tratamiento de mordeduras de serpientes, rinitis y trastornos cardíacos. En la antigua Grecia, el ajo se usaba para tratar problemas pulmonares e intestinales. También se usó en la Segunda Guerra Mundial para tratar úlceras y heridas de los heridos. En general, el ajo tiene muchas propiedades antifúngicas, antimicrobianas, anticancerígenas, antiprotozoarias, antihipertensivas, anticoagulantes, anticonvulsivas, anticoagulantes, antipiréticas, antipiréticas, analgésicas y antioxidantes10.

Se han utilizado diferentes especies de hongos como catalizadores para la biosíntesis de Se-NP, incluidos Trichoderma harzianum, Aureobasidium pullulans, Phoma glomerata y Mortierella humilis, además de los hongos endófitos de Aspergillus quadrilineatus, Aspergillus ochraceus, Aspergillus terreus y Fusarium equiseti11,12. . Recientemente, se han informado las aplicaciones médicas prometedoras de Se-NPs mico-sintetizadas derivadas de Penicillium citrinum y su eficacia como anticancerígenos y antioxidantes13. Además, las Se-NP biogénicas obtenidas por el endófito Penicillium crustosum demostraron una potente eficacia anticancerígena y antimicrobiana de amplio espectro (contra bacterias gramnegativas, grampositivas y cuatro especies diferentes de Candida) y una actividad catalítica duradera para la degradación del azul de metileno. Estas actividades fueron más pronunciadas bajo iluminación ligera que en condiciones de oscuridad14. Además, los mosquitos son considerados el principal vector de transmisión de agentes causantes de enfermedades humanas y animales como virus, protozoos, hongos y bacterias. Enfermedades mortales como la fiebre amarilla, el dengue, la filariasis, la malaria, el chikungunya, el virus del Nilo Occidental y el virus del Zika son enfermedades transmitidas por vectores de mosquitos15. Las Se-NP especialmente sintetizadas por enfoques ecológicos, debido a sus bajos impactos negativos en los humanos y el ecosistema, exhiben una alta actividad mosquitocida16.

En consecuencia, el estudio actual se diseñó para explorar la capacidad de los hongos endófitos para fabricar Se-NP de una manera fácil, eficiente y ambientalmente segura. En primer lugar, se aislaron e identificaron diferentes cepas de hongos endófitos a partir de tejidos de ajo. Se exploró su potencial en la biosíntesis de Se-NP. A continuación, las NP formadas se caracterizaron mediante espectroscopia UV-Vis, transformada de Fourier infrarroja (FT-IR), difracción de rayos X (XRD), microscopía electrónica de transmisión (TEM), dispersión de luz dinámica (DLS) y potencial zeta. Finalmente, se investigaron sus propiedades antibacterianas, anti-Candida, antioxidantes, anticancerígenas, de biocompatibilidad y larvicidas.

Los hongos endófitos son uno de los organismos importantes que tienen una amplia gama de aplicaciones biomédicas y biotecnológicas, incluida la producción de metabolitos activos, la utilización como biofertilizantes debido a su actividad promotora del crecimiento de las plantas, el control de fitopatógenos y la síntesis verde de nanomateriales de propiedades únicas17,18 . En el estudio actual, las raíces de ajo se utilizaron como fuente para el aislamiento de cepas de hongos endófitos. Se obtuvieron cuatro aislamientos fúngicos designados como AR.1–AR.4 a partir de raíces sanas recolectadas. Estas cepas fueron identificadas utilizando métodos tradicionales basados ​​en caracterizaciones microscópicas y de cultivo como Penicillium sp. (AR.1), Aspergillus niger (AR.2), Alternaria alternata (AR.3) y Penicillium sp. (AR.4) (Fig. 1). En un estudio similar, doce cepas de hongos endófitos pertenecientes a Aspergillus spp., Alternaria spp., Penicillium spp., Cladosporium sp., Chaetomium sp. y Fusarium sp. fueron aislados de Allium sativum19.

Aislamiento e identificación primaria de cepas fúngicas aisladas de la raíz de Allium sativum.

Recientemente, los investigadores tendieron a producir nuevos compuestos activos con un enfoque ecológico. Entre estos compuestos activos, los nanomateriales poseen una alta actividad en varios campos de la agricultura, la medicina y la industria20. Se prefiere la síntesis de estos materiales mediante enfoques ecológicos para evitar los impactos negativos que se originan en los enfoques químicos y físicos21. Los microbios endófitos, incluidos hongos, bacterias y actinomicetos, se consideran fuentes prometedoras para la síntesis ecológica de nanomateriales debido a la secreción de enormes metabolitos activos que se utilizan como agentes reductores y protectores8. En el estudio actual, se investigó la eficacia de las cepas de hongos endófitos en la síntesis de Se-NP. Una vez que se agregó el precursor metálico (Na2SO3) al filtrado de biomasa fúngica, el color cambió de incoloro a rojo, el cual aumentó gradualmente, lo que indica la formación de Se0 debido a la reducción de SeO32–. La mezcla anterior permaneció durante 24 h en condiciones de oscuridad para confirmar la reducción completa del metal y ningún cambio de color adicional. Recientemente, la reducción completa del Na2SO3 por acción de los metabolitos secretados por la cepa del hongo endófito P. crustosum, mientras que la forma Se0 se completó después de 24 h de incubación14. Además, la fabricación de Se-NP a través de la reducción de Na2SO3 utilizando metabolitos secretados por Trichoderma atroviride se observó después de 24 horas, y no se notó ningún cambio de color adicional22.

Aquí, después de 24 h, se midió la absorbancia del color formado para detectar la resonancia de plasmón superficial máxima (SPR). Como se muestra, el período de incubación mostró un impacto positivo en la intensidad del color sin ningún cambio en el rango de SPR. La Figura 2 muestra que el pico de absorción se registró en longitudes de onda de 270 nm, 265 nm, 265 nm y 280 nm para cepas de hongos endófitos de AR.1, AR.2, AR.3 y AR.4, respectivamente. Curiosamente, la intensidad de color máxima y el pico máximo de absorción de SPR se registraron para la cepa AR.1. Los resultados obtenidos fueron compatibles con los informados de que el SPR máximo para Se-NP sintetizados por cepas fúngicas se encuentra en el rango de 250 a 300 nm. Por ejemplo, entre 75 cepas de hongos endófitos, solo cuatro cepas identificadas como Aspergillus quadrilineatus, A. ochraceus, A. terreus y Fusarium equiseti mostraron una alta actividad para la síntesis de Se-NP en función del cambio de color y la SPR máxima que apareció a 265 nm11. Además, la SPR máxima de Se-NP fabricadas por Penicillium corylophilum y la cepa de hongos endófitos P. crustosum se observó a 275 y 270 nm, respectivamente14,23.

Espectroscopia UV-Vis de Se-NP fabricadas por cuatro cepas de hongos endófitos para seleccionar los aislados más potentes en función de la SPR máxima.

De acuerdo con los datos de la espectroscopia UV-Vis, la cepa fúngica endofítica designada como AR.1 fue seleccionada como la cepa más potente para la síntesis verde de Se-NP. Esta cepa se ha sometido a una identificación molecular basada en la amplificación y secuenciación de genes espaciadores transcritos internos (ITS) y se identificó como Penicillium verhagenii (Fig. 3). La secuencia ITS de la cepa endofítica AR.1 se depositó en GenBank con el número de acceso OP471232. Penicillium se compone de distintas especies que se ven favorecidas por su capacidad para producir varios metabolitos activos que se utilizan como agentes reductores y estabilizadores durante la síntesis verde 24.

Árbol filogenético de la cepa fúngica endofítica más potente.

Como se mencionó, el cambio de color seguido de la detección de SPR máxima mediante espectroscopia UV-Vis fue el primer monitor para la formación exitosa de Se-NP. El aislado fúngico endófito AR.1 mostró la mayor intensidad de color y pico de absorción a 270 nm, lo que corresponde a la SPR para Se-NP. Los grupos funcionales que existen en la biomasa fúngica y su actividad en la reducción y estabilización de las Se-NP sintetizadas se investigaron mediante análisis infrarrojo transformado de Fourier (FT-IR). Como se muestra, el filtrado de biomasa fúngica contenía solo cuatro picos en los números de onda 3380, 2068, 1634, 535 cm–1, mientras que en el caso de las Se-NP, el número de picos aumentó a nueve en los números de onda 3400, 2880, 1565, 1415, 1380, 920, 780, 512 y 410 cm–1 (Fig. 4A). El pico fuerte y ancho a 3380 cm–1 podría atribuirse a los grupos de proteínas y aminoácidos O–H y N–H25,26, este pico se desplazó a 3400 cm–1 en Se-NP. El pico de amplitud de 2068 cm–1 está relacionado con la porción de carbohidrato secretada por las cepas de hongos endófitos. Además, el pico a 1634 cm–1 corresponde al grupo carbonilo (C=O) que se superpone con el grupo de polisacáridos NH que se estira presente en el filtrado de biomasa4. Este pico se desplazó a 1565 cm–1 después de la síntesis verde de Se-NP. Un pico de 535 cm–1 en el filtrado de biomasa podría atribuirse al estiramiento C–l del compuesto halo. La presencia de otros picos en el gráfico FT-IR de las Se-NP podría estar relacionada con la interacción entre los metabolitos en el filtrado de biomasa con el selenito de sodio durante la reducción y el taponado de las Se-NP tal como se han formado. El pico medio en 2880 cm–1 significa alcano de estiramiento C–H, mientras que los picos medios en el rango de 1380–1420 cm–1 podrían haber correspondido a la flexión O–H del ácido carboxílico27,28. Los picos en el rango de 400 a 800 cm–1 corresponden a la flexión y el estiramiento del Se-O que resultó de la reacción de las Se-NP con los grupos carbonilo que finalmente formaron una capa de recubrimiento alrededor de la superficie de las Se-NP que evita la agregación y la aglomeración. como se informó anteriormente29. Según el análisis FT-IR, la presencia de diferentes metabolitos en los filtrados de biomasa fúngica, como proteínas, polisacáridos, carbohidratos y aminoácidos, mostró un papel crucial en la reducción del selenito de sodio para formar Se-NP, seguido de la formación de un recubrimiento que mejora la Estabilidad de las NPs y evita la agregación.

Caracterización de Se-NP sintetizadas usando FT-IR (A) y XRD (B).

La estructura cristalina de las Se-NP formadas se investigó mediante análisis de difracción de rayos X (XRD) (Fig. 4B). Como se muestra, el patrón XRD mostró ocho picos de absorción de (100), (101), (110), (102), (111), (201), (112) y (202) que coincidieron con la difracción de Bragg en valores de 2θ de 23,5°, 29,3°, 41,3°, 45,51°, 52,53°, 55,71° y 62,74°, respectivamente. El patrón XRD obtenido se comparó con los que confirmaron la estructura cristalina de Se-NP según la tarjeta estándar JCPDS No. 06-0362. El patrón XRD obtenido es compatible con los estudios publicados sobre la síntesis verde de Se-NPs14,30,31. La ausencia de picos adicionales en el gráfico XRD indicó la alta pureza de las Se-NP sintetizadas (verificadas por espectros EDX). El tamaño de cristalito promedio de Se-NP se calculó en función del análisis XRD utilizando la ecuación de Debye-Scherrer para que sea de 55 nm. En un estudio reciente, los tamaños promedio de cristalitos fabricados por cuatro tinciones de hongos endófitos, Aspergillus quadrilineatus, A. ochraceus, A. terreus y Fusarium equiseti, se calcularon según el análisis XRD en 55,4, 45,2, 30,9 y 30,1 nm, respectivamente11.

Las características morfológicas de las Se-NP sintetizadas por hongos, como el tamaño, la forma y la agregación, son factores principales que afectan las actividades biológicas y se investigaron mediante análisis de microscopía electrónica de transmisión (TEM). Las Figuras 5A y B muestran la forma esférica de las Se-NP sintetizadas que están bien dispuestas sin aglomeración y tienen tamaños en el rango de 25 a 75 nm con un tamaño promedio de 44,1 ± 15,4 nm. La imagen TEM de Se-NP formada a una concentración de 1,5 mM mediante el aprovechamiento de metabolitos de Acinetobacter sp. SW30 mostró la fabricación exitosa de una forma esférica con un tamaño de 78 nm32. La incorporación de NP en diferentes aplicaciones depende principalmente de varios factores, como el agente de protección, la carga superficial, la forma, el tamaño y la aglomeración21. A medida que disminuía el tamaño, aumentaba la actividad. Por ejemplo, las Se-NP sintetizadas por filtrado de biomasa de Pantoea aglomerans mostraron una mayor actividad antioxidante en tamaños más pequeños33. Además, las actividades de las NP varían según la forma. Por ejemplo, las Se-NP mostraron una alta actividad antioxidante para la forma cúbica y una alta actividad antimicrobiana para la forma esférica34.

(A) Microscopía electrónica de transmisión que muestra la forma esférica, (B) la distribución del tamaño, (C) la dispersión dinámica de la luz y (D) el análisis del potencial zeta de las Se-NP fabricadas por la cepa fúngica endofítica P. verhagenii.

El tamaño de las Se-NP basadas en hongos en solución coloidal se detectó mediante dispersión dinámica de luz (DLS). Como se muestra, el tamaño hidrodinámico promedio de las Se-NP sintetizadas fue de 91,2 nm (Fig. 5C). En el estudio actual, el tamaño promedio obtenido por DLS es mayor que los obtenidos por TEM y XRD. Este hallazgo podría atribuirse a que el DLS mide el residuo hidrodinámico (estado hidratado) mientras que el TEM calcula el diámetro del estado sólido35. Además, el DLS se ve afectado por los agentes de recubrimiento y la distribución no homogénea que aumenta los tamaños36,37. En un estudio similar, los tamaños de partícula promedio de Se-NP obtenidos por TEM fueron de 15 a 40 nm, mientras que los obtenidos por DLS fueron de 20 a 60 nm 4, lo que se explica por el recubrimiento hidrodinámico alrededor de las partículas.

La estabilidad de las Se-NP sintetizadas se investigó mediante el potencial Zeta, que mide la carga eléctrica en la superficie de la NP. En el estudio actual, los Se-NP basados ​​en hongos tienen un valor de potencial Zeta de -32 mV que se refiere a la alta estabilidad (Fig. 5D). De manera similar, el valor del potencial Zeta de las Se-NP fabricadas con extracto acuoso de Carica papaya fue de −32 mV38. La estabilidad de las Se-NP fabricadas en el estudio actual podría atribuirse a la presencia de una carga negativa que aumenta la fuerza electrostática negativa entre las partículas y, por lo tanto, mejora la dispersión. Además, la estabilidad de las NP se puede clasificar de acuerdo con los valores de potencial Zeta de la siguiente manera: estabilidad inestable, moderada, estable y alta para los valores de ± 0–10, ± 10–20, ± 20–30, ˃ ± 30, respectivamente39 . Además, la ausencia de cargas dobles (positiva y negativa) y la presencia de una sola carga (negativa) en las superficies de las NP podría aumentar la estabilidad ya que la dispersión entre las partículas lleva la misma carga para evitar la agregación. Dhanjal y Cameotra40 informaron que la presencia de cargas positivas en la superficie de algunas partículas y cargas negativas en otras en la misma solución favorece su agregación.

La mayor parte de la mortalidad o morbilidad en todo el mundo se debe a enfermedades infecciosas microbianas. Las infecciones bacterianas aumentan día a día debido al abuso de antibióticos que conduce a la aparición de cepas resistentes a los antibióticos6,41. Además, las cepas de Candida son hongos oportunistas y se consideran el agente más común de enfermedades infecciosas como candidiasis oral, candidemia, vaginitis, infecciones sistemáticas y candidiasis cutánea en pacientes inmunocomprometidos42. Por lo tanto, es importante construir nuevos compuestos activos, seguros y rentables para superar estos desafíos. Los iones de selenio mostraron eficacia como agentes antimicrobianos y anteriormente se usaban como aditivos para los champús anticaspa debido a su prometedora actividad antifúngica43. Desafortunadamente, se utilizan en pequeñas cantidades debido a su toxicidad para las células de los mamíferos38. Por lo tanto, los investigadores se centraron en reducir su toxicidad convirtiéndolos a escala nanométrica.

En el estudio actual, la actividad de las Se-NP sintetizadas verdes para inhibir el crecimiento de bacterias patógenas representadas por Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis y Staphylococcus aureus, así como diferentes especies patógenas de Candida designadas como C. albicans, C. glabrata , C. tropicalis y C. parapsilosis se investigaron mediante el método de difusión en pozos. El análisis de datos mostró que la actividad antimicrobiana de Se-NP dependía de la concentración. Los hallazgos obtenidos fueron compatibles con la literatura publicada. Por ejemplo, las Se-NP formadas por la acción de los metabolitos en el extracto acuoso de Ceropegia bulbosa mostraron una alta actividad antimicrobiana contra B. subtilis y E. coli a 100 µg mL–1 seguido de concentraciones de 75, 50 y 25 µg. mL–116. En el estudio actual, la mayor actividad antibacteriana y anti-Candida se registró a 400 µg mL–1 con zonas de inhibición de 15,7 ± 0,6, 15,3 ± 0,6, 20,7 ± 0,7, 18,3 ± 0,6, 18,3 ± 0,6, 17,7 ± 0,5, 17,3 ± 0,5 y 16,7 ± 0,6 mm para B. subtilis, S. aureus, P. aeruginosa, E. coli, C. albicans, C. tropicalis, C. glabrata y C. parapsilosism respectivamente (Fig. 6A,B). La actividad disminuyó a bajas concentraciones a 12,3 ± 0,6, 11,7 ± 0,5, 16,7 ± 0,7, 14,0 ± 0,0, 12,3 ± 0,6, 14,0 ± 0,0, 13,0 ± 1,0 y 12,7 ± 0,6 a 200 µg mL–1 de Se sintetizado. NP para la misma secuencia de los organismos de prueba mencionados anteriormente. Las Se-NP formadas por extracto acuoso de hojas de Withania somnifera mostraron actividad antibacteriana contra B. subtilis, S. aureus y Klebsiella pneumoniae con la zona de inhibiciones de 14,0 ± 0,0, 19,7 ± 0,6 y 12,0 ± 0,0 mm, respectivamente. sin actividad contra E. coli6. Además, las Se-NPs fabricadas por filtrado de biomasa de Penicillium corylophilum mostraron una amplia actividad antibacteriana contra bacterias Gram-positivas (B. subtilis y S. aureus) y Gram-negativas (P. aeruginosa y E. coli)23.

Actividad antimicrobiana de Se-NPs fabricadas por una cepa fúngica endofítica de P. verhagenii contra bacterias Gram-positivas y Gram-negativas (A) y hongos unicelulares (B) a diferentes concentraciones. Las letras diferentes a la misma concentración denotan que los datos son diferencias significativas (p ≤ 0,005) (n = 3).

La concentración inhibitoria mínima (MIC) es la concentración más baja que tiene la eficacia para inhibir el crecimiento microbiano. La elección de los compuestos bioactivos que se incorporarán al sector biomédico depende de la evaluación del valor MIC44. Aquí, los Se-NP sintetizados mostraron valores MIC variados según el organismo. Por ejemplo, el valor de MIC para bacterias Gram-positivas fue de 50 µg mL–1, mientras que para bacterias Gram-negativas, P. aeruginosa y E. coli, fue de 12,5 y 25 µg mL–1, respectivamente (Fig. 6A). Por otro lado, el valor de MIC para los hongos unicelulares probados estuvo en el rango de 50–100 µg mL–1 (Fig. 6B). Recientemente, el valor de MIC de las Se-NP sintetizadas en verde contra especies de Candida se varió para estar en el rango de 25–200 µg mL–1 según el tipo de especie14. Además, la actividad antibacteriana y los valores de MIC se variaron de acuerdo con el enfoque biosintético. Por ejemplo, el valor de MIC de las Se-NP sintetizadas por Aspergillus quadrilineatus y A. ochraceus contra E. coli fue de 62,5 µg mL–1, mientras que para las fabricadas por A. terreus y Fusarium equiseti11 fue de 250 µg mL–1. Este hallazgo se puede atribuir al agente de protección secretado por microorganismos o plantas que tienen un papel crucial en la estabilización de los nanomateriales8,45. Según los datos obtenidos, las Se-NP formadas por la cepa fúngica endofítica P. verhagenii mostraron una alta actividad antimicrobiana hacia las bacterias patógenas y Candida spp.

La actividad antibacteriana de las Se-NP podría estar relacionada con la estructura de la pared celular, que en las cepas Gram-positivas está compuesta por capas gruesas de peptidoglicano en comparación con las capas delgadas en las cepas Gram-negativas. Esta diferencia puede afectar la difusión de NP dentro de las células. La gruesa capa de peptidoglicano puede prevenir o retrasar la difusión de Se-NP, lo que conduce a una menor actividad antimicrobiana hacia las bacterias Gram-positivas que hacia las bacterias Gram-negativas46. La actividad hacia las bacterias Gram-positivas se puede atribuir a la alta repulsión electrostática de las Se-NP hacia la carga negativa del lipopolisacárido que existe en altas cantidades en las bacterias Gram-negativas que en las Gram-positivas. Esto conduce a una alta deposición de Se-NP en la superficie de las cepas Gram-positivas que finalmente provocan la muerte celular47. Otro mecanismo antimicrobiano de las Se-NP podría ser la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) al ingresar a las células microbianas. Estas ERO, como H2O2, O2•– y •OH, pueden destruir la función de permeabilidad selectiva de la membrana citoplasmática, aumentar el estrés dentro de la célula, provocar la inhibición de la replicación del ADN, destruir la síntesis de proteínas e inhibir el metabolismo celular normal. Todas estas disfunciones conducen a la muerte celular48,49.

Curiosamente, la síntesis verde mediada por hongos de Se-NP exhibió una alta actividad contra diferentes cepas de Candida. Este hallazgo podría estar relacionado con su actividad para destruir el perfil de esteroles en la pared celular de Candida al inhibir la vía de biosíntesis de ergoesteroles50. Además, una alta acumulación de Se-NP en la pared celular de Candida conduce a la reacción de Se con aminoácidos que contienen azufre, como la metionina y la cisteína51. Como consecuencia de esta interacción, se formó la nueva estructura que era S-Se-S y modificó la estructura de las proteínas provocando el bloqueo de sus funciones catalíticas52.

La actividad de eliminación de radicales libres por parte de Se-NP sintetizadas en verde se investigó mediante el método DPPH en comparación con el control (ácido ascórbico) (Fig. 7). El análisis de datos mostró que la actividad de eliminación de radicales libres es de naturaleza dependiente de la concentración. La actividad está directamente relacionada con la concentración de Se-NP sintetizadas en verde. El hallazgo obtenido fue compatible con la literatura publicada que informó que la actividad depuradora de las Se-NP fabricadas por plantas, hongos y actinomicetos dependía de sus concentraciones4,11,53. La máxima actividad secuestrante de DPPH se registró a 1000 µg mL–1 con porcentajes de 86,8 ± 0,6 % en comparación con el ácido ascórbico a la misma concentración que registró un porcentaje de 97,3 ± 0,2 % (Fig. 7). La actividad de eliminación de DPPH alcanzó el 19,3 ± 4,5 % con la concentración más baja de Se-NP de 1,95 µg mL–1. Esto indica que las Se-NP sintetizadas poseen actividad antioxidante a bajas concentraciones. En un estudio similar, las Se-NP fabricadas por cepas de hongos endófitos de A. quadrilineatus, A. ochraceus, A. terreus y F. equiseti mostraron actividad de eliminación de DPPH con porcentajes de 93,8 ± 9,5, 83,6 ± 6,3, 79,2 ± 9,3, y 79,8 ± 4,7 %, respectivamente a 1000 µg mL–1 en comparación con una actividad depuradora del 100 % para el ácido ascórbico. Estos porcentajes alcanzaron 25,8 ± 2,1, 28,4 ± 2,6, 18,0 ± 3,5 y 10,3 ± 2,1% a una concentración de 25 µg mL–1 en comparación con el control (21,3 ± 1,5%) a la misma concentración11. En el estudio actual, los valores de EC50 (concentración efectiva para eliminar el 50 % de los radicales libres) fueron 28,7 ± 1,6 µg mL–1 y 5,4 ± 0,8 µg mL–1 para Se-NP y ácido ascórbico, respectivamente. Nuestros datos eran incompatibles con los registrados de que la EC50 de las Se-NP sintetizadas por el filtrado de biomasa de la cepa fúngica Monascus purpureus fue de 85,9 µg mL–154, lo que indica la actividad antioxidante prometedora de las Se-NP sintetizadas aquí.

Actividad de eliminación de DPPH de las Se-NP sintetizadas por P. verhagenii endofítico en comparación con el ácido ascórbico como control.

Las sustancias antioxidantes o captadores de radicales libres son aquellas que impiden el daño celular causado por moléculas inestables o radicales libres sintetizados bajo estreses tales como patógenos, contaminantes, sustancias radiactivas, toxinas, etc.55. Los principales síntomas de estos radicales libres son el reumatismo, la disfunción inmunológica, el Parkinson, la leucemia, el infarto, los trastornos metabólicos y la insuficiencia respiratoria56. El origen de estos captadores de radicales libres son fuentes naturales, como fenoles, flavonoides, fitoestrógenos y taninos, o fuentes sintéticas, como nanomateriales38. Las nanopartículas metálicas y de óxidos metálicos se caracterizan por su capacidad como captadores de radicales libres33,56. La actividad de las Se-NP como antioxidantes podría atribuirse a su eficacia en el aumento de selenoenzimas como la glutatión peroxidasa que protege a las células del efecto deletéreo de los radicales libres en condiciones in vivo4,45. Además, los antioxidantes de las NPs podrían deberse a la inhibición y neutralización de la formación de radicales libres DPPH por transferencia de electrones57. Además, las propiedades únicas de las NP, especialmente las de gran tamaño, pueden mejorar la actividad antioxidante58.

La actividad anticancerígena de las Se-NP sintetizadas en verde se investigó frente a dos células cancerosas designadas como MCF7 y PC3, mientras que la biocompatibilidad se evaluó frente a dos células normales representadas como Vero y WI38. La viabilidad celular y la proliferación celular debido al tratamiento con Se-NP se evaluaron mediante el método de ensayo MTT. El análisis de datos mostró que la síntesis verde de Se-NP mediada por cepas fúngicas endófitas tiene una actividad anticancerígena prometedora contra las líneas celulares de cáncer probadas de una manera basada en la concentración. A bajas concentraciones (≤ 62,5 µg mL–1), las Se-NP no tienen efectos significativos sobre la viabilidad de las líneas celulares cancerosas y normales (la viabilidad celular en el rango de 89 a 99 % para todas las células), mientras que a una concentración de 125 µg mL–1, la viabilidad de PC3 fue del 89,7 ± 0,9 % en comparación con las líneas celulares cancerosas de MCF7 (99,6 ± 3,2 %) y dos líneas celulares normales (98,4 ± 3,1 % y 99,9 ± 1,2 % para Vero y WI38, respectivamente) (Fig. 8). Al aumentar la concentración de Se-NP a 500 µg mL–1, la viabilidad de las líneas celulares cancerosas disminuyó considerablemente, alcanzando el 26,3 ± 1,8 % y el 8,3 ± 0,9 % para MCF7 y PC3, respectivamente, en comparación con la viabilidad de las líneas celulares normales (44,4 ± 0,7 % y 43,1 ± 0,9 % para Vero y WI38, respectivamente). Compatible con los resultados obtenidos, la actividad de las Se-NPs fitosintetizadas dependía de las concentraciones contra las líneas celulares cancerosas de MCF-7, Caco-2, IMR-32 y la línea celular normal Vero38. Además, la actividad antiproliferativa de las Se-NP sintetizadas mediante el aprovechamiento de metabolitos de Acinetobacter sp. SW30 contra 4T1, MCF7, NIH/3T3 y HEK293 fueron de manera dependiente de la concentración32. El análisis de datos mostró que la toxicidad de la síntesis verde mediada por hongos de Se-NP fue la más alta contra PC3 en comparación con MCF7 (Fig. 8). Por otro lado, la sensibilidad de dos células normales hacia varias concentraciones de Se-NP fue similar, excepto que a 250 µg mL–1, la viabilidad de WI38 disminuyó en comparación con las células Vero.

Viabilidad celular usando el método de ensayo MTT de células cancerosas (PC3 y MCF7) y células normales (Vero y WI38) después del tratamiento con varias concentraciones de Se-NP.

La IC50 (concentración para inhibir el 50 % de la viabilidad celular) de Se-NP se evaluó en 225,7 ± 3,6, 283,8 ± 7,5, 454,8 ± 29,9 y 472,8 ± 5,8 µg mL–1 para PC3, MCF7, WI38 y células Vero. líneas, respectivamente. Los datos obtenidos revelan la orientación del objetivo de Se-NP hacia líneas celulares cancerosas en bajas concentraciones en comparación con las líneas celulares normales. Este hallazgo confirmó la capacidad de integrar Se-NP en sectores biomédicos a una concentración inferior a 300 µg mL–1 para ser más activos contra las células cancerosas con efectos insignificantes en las células normales. Los efectos citotóxicos mínimos de las Se-NP sintetizadas hacia las células normales podrían estar relacionados con el equilibrio redox normal, como se informó anteriormente59.

El examen microscópico de las células tratadas con Se-NP mostró la destrucción total o parcial de una monocapa de células epiteliales en altas concentraciones (ver datos complementarios, Fig. S1, S2, S3, S4). Además, a estas concentraciones, las células tienden a ser redondeadas o granulosas, encogerse, flotar y disminuir en el número total. Estos impactos negativos se redujeron a bajas concentraciones, especialmente para las células normales. El pequeño tamaño es la razón de la actividad citotóxica debido a su eficacia para penetrar en las membranas celulares de los mamíferos e interactuar con componentes celulares como proteínas, ácidos nucleicos y aminoácidos que conducen a la disfunción celular60. Además, la presencia de Se-NP dentro de las células puede aumentar la generación de ROS que tienen efectos nocivos sobre las mitocondrias y, en última instancia, la muerte apoptótica14. Shiny et al. informaron que la exposición de células de carcinoma de pulmón (A549) a nanopartículas de plata y platino conduce a la destrucción del citoesqueleto celular y, por lo tanto, a la liberación de enzimas específicas llamadas enzimas LDH citosólicas que son responsables de la lisis de las células60.

El uso de sustancias químicas para el control de mosquitos vectores tuvo impactos negativos no solo en la salud humana sino también en el medio ambiente y la aparición de nuevos vectores resistentes61. Por lo tanto, es urgente construir compuestos activos seguros, ecológicos, rentables y de efecto rápido. En este documento, las Se-NP basadas en hongos mostraron una alta mortalidad contra las larvas de diferentes estadios (I, II, III y IV) de Aedes albopictus en varias concentraciones (10, 20, 30, 40 y 50 µg mL–1) (Tabla 1). Como se muestra, la actividad de las Se-NP contra las larvas en estadio dependía de la concentración. El hallazgo obtenido fue compatible con la literatura sobre el efecto de los nanomateriales sintetizados verdes contra los mosquitos vectores62,63. El análisis de los datos mostró que la mortalidad más alta (85,1 ± 3,1 %) para la larva I instar se registró a una concentración de 50 µg mL–1, mientras que este porcentaje disminuyó al disminuir la concentración hasta llegar a 59,0 ± 2,0 % a 10 µg mL– 1. Por otro lado, las Se-NPs tal como se formaron mostraron una alta actividad contra la larva en estadio IV con porcentajes de mortalidad de 31.3 ± 1.5, 34.1 ± 0.0, 42.2 ± 1.0, 46.2 ± 1.6 y 51.0 ± 1.0% para concentraciones de 10–50 µg mL–1, respectivamente.

El análisis de varianza reveló que la CL50 y la CL90 para las larvas de estadio I, II, III y IV de A. albopictus fueron (15,2, 33,6, 45,5 y 54,3 µg mL–1) y (132,8, 138,9, 142,4 y 180,3 µg mL–1), respectivamente (tabla 1). En un estudio similar, la CL50 y la CL90 de Se-NP de origen vegetal contra el estadio larvario de A. albopictus estuvieron en los rangos de (15,2–52,3 mg L–1) y (132,7–178,3 mg L–1), respectivamente16. Las Se-NP fabricadas con extracto acuoso de hojas de Clausena dentata mostraron actividad larvicida frente a Culex quinquefasciatus, Aedes Aegypti y Anopheles stephensi con valores de CL50 de 99,6, 104,1 y 240,7 mg L–1, respectivamente64.

La actividad de Se-NPs hacia A. albopictus podría atribuirse a su eficacia para penetrar la membrana celular e interactuar con diferentes componentes celulares que conducen a la disfunción16. Además, la presencia de Se-NP dentro de la célula puede aumentar el estrés oxidativo que es el último en la muerte celular al generar ROS tóxicas. Además, las Se-NP pueden destruir las células al reaccionar con el grupo -SH de aminoácidos o ácidos nucleicos que contienen fósforo65.

Las raíces de ajo (Allium sativum L.) de plantas sanas fueron recolectadas y utilizadas como fuente para el aislamiento de hongos endófitos. Nuestro trabajo cumple con los lineamientos y la legislación institucional, nacional e internacional. El ajo es común en todo el mundo y no necesita permisos ni licencias ya que la especie con la que estamos trabajando es un cultivo cosmopolita que no está en riesgo ni es endémico según la UICN. Las muestras de raíces se recolectaron de tierras agrícolas en la gobernación de El-Menofia, Egipto (30° 38′ 40,9″ N 30° 56′ 49,9″ E) con permiso (número: EM2/2022) de la oficina agrícola local de la gobernación. Se recolectaron raíces de plantas de ajo sanas y se mantuvieron en bolsas de polietileno esterilizadas antes de ser trasladadas al Laboratorio utilizando una hielera. Durante la recolección de muestras, se obtuvieron cinco plantas individuales y, de cada planta, se recolectaron tres raíces individuales.

Las raíces recolectadas se enjuagan tres veces con agua del grifo para eliminar cualquier partícula adherida, seguido de un enjuague con H2O destilada esterilizada. Posteriormente, las raíces se sometieron a esterilización superficial sumergiéndolas en las siguientes soluciones en este orden: H2O destilada esterilizada durante 60 s, etanol (70 %) durante 30 s, hipoclorito de sodio (2,5 %) durante cuatro minutos, etanol (70 % ) durante 30 s, y finalmente lavar las raíces con dis esterilizado. H2O. Para confirmar el proceso de esterilización de la superficie, el esterilizado dis. El agua del último lavado se inoculó en medios de agar apropiados para el crecimiento de diferentes microorganismos (agar nutritivo para bacterias, Czapek Dox para hongos y nitrato de almidón para actinomicetos). Las placas inoculadas se incubaron en condiciones apropiadas y se observaron diariamente para comprobar el crecimiento de microbios. La ausencia de crecimiento microbiano en los medios de agar inoculados indica el éxito del proceso de esterilización superficial.

Las raíces esterilizadas se cortaron en pequeños segmentos (4 mm/segmento) y se colocaron diez partes por planta individual sobre la superficie de la placa de agar Czapek Dox (5 segmentos/placa) suplementada con cloranfenicol para suprimir el crecimiento bacteriano. Las placas se incubaron a 25 ± 2 °C durante 15 días y se observaron diariamente para comprobar la aparición de crecimiento de hongos en los tejidos internos de la planta, por lo que se recogieron y se reinocularon en una placa nueva. Los aislados fúngicos purificados se identificaron en función de las características morfológicas y culturales de acuerdo con las claves estándar para Penicillium spp.66, Aspergillus spp.67 y Alternaria spp.68.

Se investigó la eficacia de cepas fúngicas endofíticas aisladas para actuar como biocatalizador para fabricar Se-NP. Un disco (10 mm) de cada cepa fúngica se inoculó por separado en 100 ml de caldo Czapek Dox y se incubó a 25 ± 2 °C durante 7 días en condiciones de agitación (150 rpm). Al final del período de incubación, la biomasa fúngica se recogió mediante filtración de medio de caldo inoculado usando Whatman No.1 y se lavó tres veces con un disco esterilizado. H2O para eliminar cualquier componente del medio adherido. Se suspendieron aproximadamente 7 g de biomasa recolectada para cada cepa fúngica en 100 mL dis. H2O y se incubó a 25 ± 2 °C durante 24 h seguido de centrifugación para recolectar el filtrado de biomasa que se usó para fabricar Se-NP de la siguiente manera: se disolvieron 85,5 mg de precursor de metal (Na2SO3) en 10 mL dis. H2O y se agrega a 90 mL de biomasa fúngica para obtener una concentración final de 5 mM. La mezcla se sometió a agitación a 40 °C durante una hora y se ajustó el pH a 8 usando NaOH 1N, antes de dejarla a temperatura ambiente durante la noche en condiciones de oscuridad. La conversión de color de incoloro a rojo rubí indica la formación de Se-NP seguida de la medición de su absorbancia a una longitud de onda en el rango de 200 a 700 nm para detectar la resonancia de plasmón superficial máxima (SPR)31. El filtrado de biomasa fúngica sin precursor metálico se utilizó como control. Se seleccionó la cepa fúngica más potente debido a su eficacia para formar el color rojo rubí más alto y el valor SPR máximo. El resultante se recogió y se enjuagó tres veces con agua destilada. H2O antes de someterse a secado en horno a 200 °C durante 4 h.

El aislado fúngico endófito más potente seleccionado designado como AR.1 se sometió a identificación molecular mediante amplificación y secuenciación de genes ITS de acuerdo con el protocolo de White et al.69. El gen ITS se amplificó utilizando un cebador de ITS1 (5′ CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′) e ITS4 (5′ TCCTCGCTTATTGATATGC 3′). La mezcla de PCR que contenía lo siguiente: MgCl2 0,5 mM, tampón de PCR, polimerasa Taq 2,5 U (QIAGEN, GERMANTOWN, MD-20874, EE. UU.), 0,5 µM de cada cebador, dNTP 2,25 mM, ADN genómico extraído (5 ng). La serie se logró con el termociclador DNA Engine (PTC-200, BIO-RAD, EE. UU.) y se ajustó a 94 °C durante tres minutos, seguido de 30 ciclos a 94 °C durante medio minuto, 55 °C durante medio minuto, 72 °C durante un minuto y finalmente 72 °C durante diez minutos. Los productos de la PCR se comprobaron con gel de agarosa (1 %) antes de secuenciarlos en GATC Biotech [una empresa que utiliza un secuenciador de ADN (ABI-3730xl) como socio de Sigma Aldrich, El Cairo, Egipto]. Las secuencias obtenidas fueron comparadas por la base de datos depositada en GenBank por el paquete de software ClustalX 1.8 (http://www.clustal.org/clustal2)70,71. El análisis filogenético se logró utilizando el software del método de unión de vecinos (MEGA v6.1), con confianza probada mediante análisis de arranque (1000 repeticiones).

Se utilizó la transformada de Fourier infrarroja (FT-IR) (modelo Cary-660) para detectar los diferentes grupos funcionales en la biomasa fúngica, así como en las NP de Se formadas. En este análisis, se mezclaron 10 mg de Se-NP sintetizadas con KBr y se presionaron para formar un disco sujeto a exploración a una longitud de onda en el rango de 400–4000 cm-122. La estructura cristalográfica de la síntesis verde mediada por hongos de Se-NP se evaluó mediante difracción de rayos X (XRD, PANalytical-X'Pert-Pro-MRD) que contenía electrodo CuKα como fuente de rayos X (λ = 1,54 Å). El análisis se logró a corriente y voltaje de 30 mA y 40 kV respectivamente en el rango de valores de 2θ de 10°–80°. El tamaño de los cristalitos se calculó en función del análisis XRD mediante la ecuación de Debye-Scherrer de la siguiente manera:

donde K es una constante de Scherrer que era 0,94, λ es la longitud de onda de los rayos X que era 1,54, β es el ancho total del pico de difracción a la mitad del máximo y θ es el ángulo de difracción.

Las características morfológicas (forma y tamaño) se comprobaron mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM, JEOL, Ltd-1010, Tokio, Japón). El polvo verde de Se-NPs sintetizado se suspendió en H2O bajo ultrasonicación y se agregaron unas gotas en la rejilla de carbono TEM. La rejilla cargada se dejó secar antes de ser sometida a análisis72,73.

Se utilizó la dispersión de luz dinámica (DLS) (Nano-ZS, Malvern Ltd, Malvern, Reino Unido) para investigar la distribución de tamaños en la solución coloidal. Las Se-NP sintetizadas se dispersaron en un solvente de alta pureza (MiliQ H2O) para evitar la aparición de sombras en la señal durante el análisis de dispersión. Además, la carga superficial de las Se-NP sintetizadas se evaluó utilizando un aparato Zeta-sizer (Nano-ZS, Malvern, Reino Unido)74.

Se investigó la actividad de las Se-NP de origen fúngico como agentes antimicrobianos frente a un grupo de microbios patógenos, incluidos Escherichia coli ATCC8739, Pseudomonas aeruginosa ATCC9027 (bacterias gramnegativas), Bacillus subtilis ATCC6633 y Staphylococcus aureus ATCC6538 (bacterias grampositivas). Además, la actividad se evaluó frente a un grupo de cepas clínicas de Candida designadas como C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis y C. parapsilosis que se recolectaron del Laboratorio de Microbiología, Centro Nacional de Investigación, Giza, Egipto. La actividad antimicrobiana se evaluó mediante el método de difusión en pozos de agar75. En este método, las cepas bacterianas y fúngicas seleccionadas se subcultivaron en agar nutritivo (Ready-prepared, Oxoid) y placas de agar sabouraud dextrosa (que contienen gL-1: dextrosa, 40; peptona, 10; agar, 15), respectivamente, durante la noche a temperatura ambiente. 35 ± 2 °C. Después de eso, se recogió una sola colonia de cada organismo y se esparció uniformemente con un hisopo esterilizado en la superficie de la placa de agar Muller-Hinton (Ready Prepared, Oxoid) y luego se hicieron cuatro pocillos (0,6 mm de diámetro) en cada placa. Estos pocillos se llenaron con 100 µL de la solución de Se-NP preparada (400, 300, 200, 100, 50, 25, 12,5 y 6,25 µg mL–1). El sistema solvente (DMSO) estaba funcionando con el experimento como control. Las placas llenas se incubaron a 35 ± 2 °C durante 24 h. Al final del tiempo de incubación, los resultados se registraron como el diámetro de una zona clara formada alrededor de cada pocillo. Se determinó la concentración más baja de Se-NP que inhibe el crecimiento microbiano (valor MIC). El experimento se realizó por triplicado.

La actividad antioxidante de la biosíntesis mediada por hongos de Se-NP se evaluó mediante el método DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazilo). En este método, se prepararon varias concentraciones de Se-NP biosintetizadas (1,95–1000 µg mL–1) en agua altamente pura (Milli-Q H2O). Posteriormente, se agregó un mL de la solución preparada a un tubo de ensayo que contenía un mL de DPPH (preparado en metanol) y 450 µL de tampón Tris-HCl (pH 7.4, 50 mM), se mezcló bien antes de incubarse a 37 °C por media hora en condiciones de agitación (100 rpm) en la oscuridad. Se realizó otro conjunto de experimentos usando ácido ascórbico (control positivo) bajo las mismas condiciones/concentraciones. Además, el control negativo que era DPPH y tampón Tris-HCl en ausencia de Se-NP o ácido ascórbico se ejecutó con el experimento en las mismas condiciones de incubación. Al final del período de incubación, se midió la absorbancia del color formado a 517 nm. Los porcentajes de captación de radicales libres se calcularon utilizando las siguientes ecuaciones 6:

donde AbC y AbT son las absorbancias del control (ácido ascórbico) y del tratamiento (Se-NPs), respectivamente.

Las dos células cancerosas, denominadas MCF7 (cáncer de mama humano) y PC3 (célula de cáncer de próstata), y dos células normales representadas por Vero (célula epitelial de riñón de mono) y WI38 (fibroblasto de pulmón humano) se compraron a Holding Company for Biological Products. y Vacunas (VACSERA), El Cairo, Egipto.

La actividad anticancerígena de las Se-NP frente a dos células cancerosas (MCF y PC3) y la prueba de biocompatibilidad frente a dos células normales (Vero y WI38) se evaluó mediante el método de ensayo MTT. En este método, cada tipo de célula se inoculó en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos con una intensidad de 1 × 105 células/100 µl/pocillo y se incubó a 37 °C durante 24 h en una incubadora con CO2 al 5 %. Una vez formada la lámina monocapa, se enjuagó dos veces con medios de lavado y se agregaron 100 µL de medios de mantenimiento RPMI con suero al 2%. Después de eso, las células en crecimiento se trataron con concentraciones dobles de Se-NP (31.25–1000 μg mL–1) y se incubaron durante 48 h. Se usaron tres pocillos sin Se-NP como control. Después del período de incubación, el medio restante en cada pocillo se descartó y recibió 50 µL de solución de MTT (5 mg mL–1 de solución salina tamponada con fosfato) y se agitó vigorosamente durante 5 min antes de incubar durante 4 h a 37 °C. Después del período completo de incubación, se descartó la solución de MTT y se agregaron 100 µl de DMSO (10 %) para disolver el cristal de formazán formado mediante agitación durante 30 min. La absorbancia del color formado se midió a 570 nm con un lector ELIZA76. Los cambios morfológicos en las células debido al tratamiento con Se-NPs se observaron mediante microscopía invertida (Nikon, ECLIPSE Ts2, Shinjuku, Tokio, Japón), mientras que los porcentajes de viabilidad celular se calcularon mediante la siguiente ecuación:

donde AbT y AbC son las absorbancias de tratamiento y control, respectivamente.

Se investigó la eficacia de las Se-NP en la destrucción de larvas en estadio de Aedes albopictus. Las larvas del mosquito A. albopictus se han obtenido del Centro Médico de Entomología, Giza, Egipto. Las larvas recolectadas se mantuvieron en vasos de plástico llenos de agua desionizada y se conservaron en condiciones de laboratorio. Se usó una mezcla de levadura y alimento para perros (1:1 p/p) para alimentar a las larvas. El experimento se realizó en condiciones de 70% de humedad relativa, 30 °C y fotoperiodo 12:12 h (oscuridad/luz). El experimento se llevó a cabo de acuerdo con el estándar de las directrices de la OMS77. En este método, 25 larvas sanas de cada estadio (I, II, III y IV) se incubaron por separado en un recipiente que contenía 200 mL de agua del grifo mezclada con una concentración de Se-NP (50, 40, 30, 20 y 10 µg). mL–1) durante 48 h. El recipiente que contenía agua del grifo sin Se-NP se utilizó como control. Las larvas se consideraron muertas si perdían su capacidad de llegar a la superficie del agua del grifo después de la alteración del recipiente. Los porcentajes de mortalidad se calcularon mediante la siguiente ecuación:

donde A es la mortalidad en control y B es la mortalidad en tratamiento. El experimento se llevó a cabo en cinco repeticiones para cada concentración de Se-NPs.

Se utilizó el paquete estadístico SPSS v17 para analizar los datos obtenidos y representados por medio de tres réplicas independientes. Se utilizó la prueba t o ANOVA seguida de la prueba Tukey HSD a p < 0,05 para medir la diferencia entre tratamientos. Los porcentajes de mortalidad de las larvas se midieron mediante análisis probit, con LC50 y LC90 calculados utilizando el método de Finney.

"Nuestro trabajo cumple con los lineamientos y la legislación institucional, nacional e internacional".

Entre cuatro cepas de hongos endófitos que colonizaron raíces de ajo, P. verhagenii fue seleccionada como la mejor productora de Se-NP. La cepa seleccionada fue identificada por métodos tradicionales así como por secuenciación de genes ITS. Los Se-NP sintetizados se caracterizaron mediante espectroscopia UV-Vis, FT-IR, XRD, TEM, DLS y análisis de potencial Zeta. Se investigaron la actividad antimicrobiana, antioxidante, la citotoxicidad in vitro contra el cáncer y las líneas celulares normales, y la actividad larvicida. Los datos mostraron zonas de inhibición variadas debido al tratamiento de bacterias Gram positivas, Gram negativas y hongos unicelulares patógenos con diferentes concentraciones y valores de CIM en el rango de 12,5–100 µg mL–1. La actividad de captación de radicales libres se investigó utilizando el método DPPH en comparación con el ácido ascórbico. Las Se-NP revelan una variada actividad de eliminación de DPPH según las concentraciones en los rangos de 31 a 87%. Además, las Se-NP se dirigen a las células cancerosas, MCF7 y PC3 con bajas concentraciones en comparación con las células normales, WI38 y Vero. Este hallazgo promueve su integración en el tratamiento del cáncer sin efectos despreciables sobre las células normales. Además, las Se-NP tal como se forman se pueden utilizar como agente larvicida para un insecto biomédico, A. albopictus, con porcentajes de mortalidad del 51 % para larvas en estadio IV y del 85 % para larvas en estadio I a una concentración de 50 µg·mL –1. Los datos obtenidos confirmaron que los hongos endófitos poseen un alto potencial para fabricar Se-NP activas que pueden integrarse en varios sectores.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable. La secuencia del estudio actual se depositó en NCBI (GenBank) en https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucore/OP471232.

Nanopartículas de selenio

cáncer de mama humano

Célula de cáncer de próstata

Células epiteliales de riñón de mono

fibroblasto de pulmón humano

Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio

2,2-difenil-1-picrilhidrazilo

Espaciador transcrito interno

Dimetilsulfóxido

Organización Mundial de la Salud

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Agradecemos a la Facultad de Ciencias (niños) del Hospital Docente de la Universidad de Tanta de la Universidad de Al-Azhar y a la Facultad de Medicina de la Universidad de Tanta por su asistencia inquebrantable a lo largo de esta investigación.

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por The Science, Technology & Innovation Funding Authority (STDF) en cooperación con The Egyptian Knowledge Bank (EKB). El financiamiento de acceso abierto es proporcionado por la Autoridad de Financiamiento de Ciencia, Tecnología e Innovación (STDF) en cooperación con el Banco de Conocimiento Egipcio (EKB).

Tanta Universal Teaching Hospital, Tanta University, Tanta, Egypt

Abdel-Rahman A. Nassar

Departamento de Botánica y Microbiología, Facultad de Ciencias, Universidad de Al-Azhar, Ciudad de Nasr, El Cairo, 11884, Egipto

Ahmed M. Eid, Hossam M. Atta y Amr Fouda

Departamento de Microbiología Médica e Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad de Tanta, Tanta, Egipto

Wageih S. El Naghy

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Correspondencia a Amr Fouda.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Nassar, A.R.A., Eid, AM, Atta, HM et al. Exploración de las actividades antimicrobiana, antioxidante, anticancerígena, de biocompatibilidad y larvicida de las nanopartículas de selenio fabricadas por la cepa de hongos endófitos Penicillium verhagenii. Informe científico 13, 9054 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35360-9

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Recibido: 03 noviembre 2022

Aceptado: 17 de mayo de 2023

Publicado: 03 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35360-9

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