un pico

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 592 (2023) Citar este artículo

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Los anticuerpos neutralizantes ejercen un potente efecto inhibidor sobre la entrada viral; sin embargo, son menos efectivos en modelos terapéuticos que en modelos profilácticos, presumiblemente debido a su eficacia limitada en la eliminación de células productoras de virus a través de la citotoxicidad mediada por Fc. En este documento, presentamos una estrategia de participación de células T biespecíficas (S-BiTE) dirigidas a picos de SARS-CoV-2 para controlar la infección por SARS-CoV-2. Este enfoque bloquea la entrada de virus libres en las células permisivas compitiendo con los receptores de membrana y elimina las células infectadas por virus a través de una poderosa citotoxicidad mediada por células T. S-BiTE es eficaz contra la variante original y Delta del SARS-CoV2 con una eficacia similar, lo que sugiere su aplicación potencial contra las variantes que escapan del sistema inmunitario. Además, en el modelo de ratón humanizado con infección viva por SARS-COV-2, los ratones tratados con S-BiTE mostraron una carga viral significativamente menor que el grupo tratado solo con neutralización. La estrategia S-BiTE puede tener amplias aplicaciones para combatir otras infecciones por coronavirus.

La aparición del nuevo coronavirus humano SARS-CoV-2 ha provocado una pandemia mundial de enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19), lo que ha obstaculizado los sistemas económicos y de salud a nivel mundial1,2,3. Se ha demostrado que diferentes formatos de vacunación confieren protección contra las cepas originales o mutadas del SARS-CoV-2 con diferentes eficacias. Se informa que las vacunas basadas en ARNm, vector adenoviral y virus inactivado tienen una eficacia del 95 %, 66,9 % y 65,9 %, respectivamente, para prevenir la COVID-194,5,6. A pesar de la disponibilidad de estas vacunas funcionales, la aparición de variantes de escape inmunitario ralentizó significativamente el control de la pandemia7,8.

Se están evaluando varias moléculas pequeñas dirigidas a la entrada o replicación del SARS-CoV-2 en las células9 y algunas de ellas han sido autorizadas para uso clínico10. Entre ellos, Paxlovid ha demostrado el beneficio clínico de reducir el riesgo de progresión a COVID-19 grave o muerte11,12,13. Los anticuerpos neutralizantes se han utilizado clínicamente contra el virus sincitial respiratorio y la enfermedad por el virus del Ébola14,15, y también se desarrollaron rápidamente contra la infección por SARS-CoV-2 para ejercer una potente actividad neutralizante en modelos preclínicos y clínicos15,16,17,18,19. La enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) es un receptor de entrada clave para el SARS-CoV-21. Varios estudios han informado los efectos antivirales de las terapias basadas en ACE2 soluble, que funcionan como un inhibidor competitivo de ACE membranoso220,21,22,23. Para mejorar aún más la eficacia, se han desarrollado anticuerpos biespecíficos dirigidos a dos epítopos24,25,26,27 y proteínas de fusión biespecíficas con brazo de anticuerpo y brazo ACE2 soluble28,29 para mejorar la neutralización y evitar la mutación del SARS-CoV-2. Sin embargo, debido a la alta tasa de mutación del SARS-CoV-2, estas terapias eventualmente enfrentarán desafíos de escape al tratamiento o resistencia. Además, se ha informado que las mutaciones de pico están asociadas con la capacidad de neutralización reducida de los anticuerpos monoclonales y los anticuerpos séricos en individuos vacunados y convalecientes30,31,32,33,34,35,36,37,38. Por lo tanto, para lograr el potencial terapéutico óptimo, se debe desarrollar un enfoque novedoso, además de la utilización de anticuerpos neutralizantes e inhibidores moleculares pequeños. Para abordar esta necesidad, en este documento, presentamos una estrategia de participación de células T biespecíficas (S-BiTE) dirigidas a picos de SARS-CoV-2 para controlar la infección por SARS-CoV-2.

Las células T se consideran las células inmunitarias más eficaces para eliminar las células infectadas por virus o las células cancerosas39,40. BiTE, una potente estrategia de activación de células T, se ha utilizado ampliamente para tratar varios tipos de cáncer41, pero se sabe poco sobre su efecto sobre la infección por SARS-CoV-2. Por lo tanto, diseñamos una proteína de fusión, S-BiTE, que consta del dominio extracelular ACE2 (aminoácido 1–740) para bloquear la entrada viral y el fragmento variable de cadena única anti-CD3ε (scFv) para activar las células T y eliminar virus- células productoras (Fig. 1a y Fig. 1a complementaria).

a Un diagrama esquemático del mecanismo anti-SARS-CoV-2 potencial del activador de células T biespecífico (S-BiTE, por sus siglas en inglés) utilizado en este estudio. b Curvas de unión ELISA de S-BiTE a RBD inmovilizado del pico SARS-CoV-2. c MFI de la unión de S-BiTE a células de pico 293 según lo determinado por citometría de flujo. d Intensidad de fluorescencia media (MFI) de la unión de S-BiTE o anti-CD3 parental a células T humanas primarias. e, f Lentivirus seudotipados con el pico SARS-CoV-2 se incubaron con células 293-ACE2 (e) o células A549-ACE2 (f) en presencia de la concentración indicada de S-BiTE. Las células fluorescentes positivas para IRFP se midieron mediante citometría de flujo. La infección relativa se calculó como la relación entre la lectura de IRFP en presencia de S-BiTE y la lectura de IRFP en ausencia de S-BiTE. Se realizó ANOVA unidireccional con comparación múltiple y corrección de Dunnett y se mostró la significación. Todos los datos se muestran como media ± SEM. Se muestran los resultados representativos de uno de los tres experimentos repetidos (n = 3/grupo) (b–f).

El SARS-CoV-2 ingresa a las células permisivas a través de ACE2 de manera dependiente del pico de SARS-CoV-21,42. Debido a la interacción fuerte y específica entre ACE2 y SARS-CoV-2 spike43, utilizamos el dominio extracelular de ACE2 como un ligando específico para identificar células que expresan picos, que imitan a las células infectadas por SARS-CoV-2 in vivo. Este dominio extracelular ACE2 monovalente tiene una afinidad relativamente alta por el dominio de unión al receptor (RBD) de la proteína de fusión pico-Fc y las células 293-pico que expresan pico (Fig. 1b, c). La otra porción de la proteína de fusión es la porción scFv anti-CD3ε monovalente que mostró una afinidad significativamente reducida por CD3ε en comparación con el anticuerpo anti-CD3 bivalente parental (Fig. 1d y Fig. 1b complementaria), lo que desfavorece la unión y activación de Células T en ausencia del pico SARS-CoV-244,45.

La porción ACE2 de S-BiTE podría funcionar como un receptor competitivo y bloqueador de entrada de SARS-CoV-2. Para probar esta hipótesis, realizamos un ensayo de bloqueo de SARS-CoV-2 pseudotipado in vitro y descubrimos que S-BiTE bloqueó significativamente la infección por SARS-CoV-2 pseudotipado en células permisivas 293-ACE2 y A549-ACE2 (Fig. 1e-f) .

La capacidad de S-BiTE para activar las células T se investigó en un ensayo de activación de células T in vitro con células cocultivadas diseñadas para expresar el pico de SARS-CoV-2. S-BiTE activó específicamente las células T para liberar IFN-γ y TNF en presencia de células de pico 293 de una manera dependiente de la dosis (Fig. 2a, b y Fig. 2a, b complementaria). En el mismo entorno experimental, no hubo activación de células T en respuesta a las células 293 con pico negativo, incluso con la concentración más alta probada de S-BiTE, lo que sugiere la alta especificidad de la interacción ACE2-pico. Se observó la misma activación de células T específicas y sensibles en respuesta a las células A549 epiteliales de pulmón que expresan picos (Fig. 2c, d y Fig. 2c, d complementaria). Para investigar más a fondo si el aumento de la activación de las células T podría conducir a la muerte de las células objetivo, realizamos un ensayo de eliminación de células basado en citometría de flujo. S-BiTE indujo una fuerte citotoxicidad hacia las células 293 y A549 que expresan picos, en lugar de hacia las células de control negativas de picos correspondientes (Fig. 2e, f, Fig. 2e, f complementaria y Fig. 3 complementaria). Para confirmar aún más su especificidad, establecimos un CD20 dirigido a BiTE y realizamos un ensayo de activación de células T in vitro similar, S-BiTE induce más activación de células T que el control CD20-BiTE dependiente de la expresión de picos (Fig. 5 complementaria). Estos resultados demuestran que S-BiTE puede inducir la activación de células T humanas mediada por CD3 y la eliminación de células que expresan picos de SARS-CoV-2.

Se cocultivaron células 293, 293-spike, A549, A549-spike, Raji o Raji-spike con células T primarias humanas en presencia de la concentración indicada de S-BiTE. a–d Después de 24 h, los niveles de IFN-γ y TNF en el sobrenadante celular se analizaron mediante el ensayo CBA. e, f Después de 48 h, se determinó la citotoxicidad midiendo las células CD45- mediante citometría de flujo. Se cocultivaron células h, i Raji o Raji-spike con células NK primarias humanas y se complementaron con suero AB humano o células T humanas en presencia de la concentración indicada de ACE2-Fc o S-BiTE. La citotoxicidad mediada por ADCC, CDC o células T se analizó mediante citometría de flujo. Se realizó ANOVA de dos vías con comparación múltiple y corrección de Dunnett y se mostró la significación. Todos los datos se muestran como media ± SEM. Se muestran los resultados representativos de uno de los tres experimentos repetidos (n = 3/grupo) (a–i).

Numerosos estudios han demostrado un fuerte efecto inhibitorio de los anticuerpos neutralizantes sobre la entrada viral en las células permisivas14,15,46,47. Sin embargo, solo unos pocos anticuerpos neutralizantes terapéuticos han sido aprobados para uso clínico48. La eficacia clínica de los anticuerpos neutralizantes puede verse limitada por la aparición de mutaciones virales que permiten escapar de la neutralización o la capacidad relativamente débil de los anticuerpos neutralizantes para eliminar las células infectadas por virus. Una publicación reciente mostró que los anticuerpos de neutralización son menos efectivos cuando se administran 2 h después de la infección en comparación con su administración 24 h antes de la infección49. Por lo tanto, comparamos la citotoxicidad de las proteínas de fusión S-BiTE y ACE2-IgG1 Fc humana in vitro. Aunque IgG1 Fc es el isotipo más potente en la mediación de la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC)50, ACE2-Fc mostró efectos citotóxicos débiles a través de ADCC y CDC in vitro (Fig. 2g, h) . En el mismo entorno, S-BiTE exhibió un efecto de destrucción más de 2000 veces mayor en las células Raji que expresan picos (Fig. 2i).

La eliminación de las células infectadas por virus para evitar la producción de más virus es fundamental para el control viral, especialmente en las primeras etapas de la infección. Por lo tanto, evaluamos la capacidad de S-BiTE para prevenir la liberación de virus en nuestro sistema de producción de SARS-CoV-2 pseudotipado. Para imitar las células productoras de virus, se transfectaron 293 células con cuatro plásmidos que codifican componentes virales (Fig. 3a). Tras el cocultivo con las células 293 modificadas, S-BiTE desencadenó significativamente la activación de las células T, la destrucción de las células productoras de virus y la reducción de la liberación de virus (Fig. 3b-d). Es importante destacar que, en estas condiciones, la presencia de virus libres en el medio de cultivo no afectó la activación de células T mediada por S-BiTE y la citotoxicidad hacia las células que expresan picos. De manera consistente, el virus pseudotipado en el sobrenadante se redujo significativamente después del tratamiento con S-BiTE (Fig. 3e, f). En conjunto, estos resultados indican que S-BiTE es superior a la estrategia terapéutica Ab dirigida por Fc para controlar la infección viral a nivel celular.

un esquema que ilustra los experimentos de cocultivo para controlar el efecto de S-BiTE en las células productoras de virus. Las células b – d Lenti-X 293 T se transfectaron con plásmidos SARS-CoV-2 pseudotipados. Después de 24 h, se agregaron células T primarias humanas al cultivo en presencia de la concentración indicada de S-BiTE. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se analizaron los niveles de TNF e IFN-γ en el sobrenadante mediante el ensayo CBA (n = 3/grupo) (b). Se tomaron imágenes de las células liberadoras de virus restantes mediante microscopía fluorescente (c) y se analizaron mediante citometría de flujo (d) (n = 6/grupo). e, f El virus liberado en el sobrenadante se usó para infectar células 293-ACE2, y las células que expresan GFP infectadas con virus se analizaron mediante microscopía fluorescente (e) y citometría de flujo (f) (n = 5/grupo). Se realizó ANOVA unidireccional con comparación múltiple y corrección de Dunnett y se mostró la significación. Barra de escala: 120 μm. Todos los datos se muestran como media ± SEM. Se muestran los resultados representativos de uno de los tres experimentos repetidos (b-f).

Dada la potente citotoxicidad in vitro de S-BiTE hacia las células que expresan picos, también se evaluó su citotoxicidad in vivo. Similar a la de otras moléculas similares a BiTE informadas, la vida media de S-BiTE en ratones es de aproximadamente 1,5 h (Fig. 4 complementaria). A pesar de su corta vida media, se demostró que un solo tratamiento de S-BiTE elimina las células diana con pico positivo en un grado significativo en el ensayo de eliminación de células in vivo, lo que sugiere el alto potencial de S-BiTE para eliminar las células infectadas por virus. in vivo (Fig. 4a y Fig. 6 complementaria). Para probar si S-BiTE podría inducir la activación no deseada de células T o el agotamiento de células T, lo cual es fundamental para su perfil de seguridad. Se administró S-BiTE a ratones humanizados hACE2 y hCD3e. Nuestros datos mostraron que no hay una diferencia significativa en los subtipos de células inmunitarias, el marcador de activación de células T y la infiltración de células inmunitarias en los tejidos principales (Fig. 7 complementaria).

a Aproximadamente 2 × 106 células Raji y Raji-spike marcadas con CFSE se mezclaron con 5 × 106 células T y se inyectaron por vía intraperitoneal en ratones NSG (n = 5/grupo). Los ratones se trataron con PBS o S-BiTE y las células de la cavidad peritoneal se recogieron y analizaron mediante citometría de flujo 6 horas después del tratamiento. b La producción continua de S-BiTE mediante S-BiTE-MSC de ingeniería estable se midió mediante ELISA después de 1 mes de cultivo (n = 2/grupo). c S-BiTE-MSC se inyectó a ratones NSG (n = 6/grupo) y los niveles séricos de S-BiTE se determinaron mediante ELISA en los puntos de tiempo indicados. d, e S-BiTE-MSC (n = 6/grupo) (d) o MSC (n = 9/grupo) (e) se inyectaron en ratones NSG y la biodistribución en el tejido indicado se analizó mediante q-PCR . Se realizaron pruebas T de Student no apareadas (a) y ANOVA unidireccional con comparación y corrección múltiple de Dunnett (b-e) y se mostró la significación. Todos los datos se muestran como media ± SEM. Se muestran los resultados representativos a–c de uno de cuatro experimentos repetidos. d, e se muestran los resultados combinados de tres experimentos independientes.

Además, dado que las células madre mesenquimales (MSC) se han utilizado ampliamente para tratar diversas enfermedades y se ha demostrado que tienen buenos perfiles de seguridad en entornos clínicos51, para satisfacer las necesidades clínicas urgentes, diseñamos MSC para secretar S-BiTE de manera estable (Fig. 4b). La expresión sérica de S-BiTE en ratones duró más de 14 días después de una sola infusión (Fig. 4c). Es importante destacar que, cuando verificamos la biodistribución de las MSC, tanto las MSC modificadas como las no modificadas se ubicaron preferentemente en los pulmones (Fig. 4d, e), lo que sugiere su posible aplicación en el tratamiento de la neumonía inducida por SARS-CoV-2. Este enfoque de administración de S-BiTE basado en MSC proporciona una posible opción clínica lista para el tratamiento de pacientes graves con COVID-19.

Dada la citotoxicidad potencial de S-BiTE en la eliminación de líneas celulares que expresan picos, probamos más la eficacia de S-BiTE en células infectadas por virus vivos. Para establecer la infección, infectamos células A549-ACE2 con SARS-CoV-2 vivo durante 2 h. Luego, se añadió S-BiTE a las células infectadas en presencia de células T. De acuerdo con los resultados del ensayo de pseudovirus, S-BiTE inhibió significativamente la replicación viral en células A549-ACE2 permisivas (Fig. 5a, b y Fig. 5 complementaria).

a, b Se infectaron células A549-ACE2 con SARS-CoV-2 vivo a una MOI de 0,05. Después de 2 h, los virus libres se eliminaron mediante lavado con PBS y se agregaron células T primarias humanas al cultivo en presencia de la concentración indicada de S-BiTE. A las 24 h (a) y 48 h (b) después de la infección, se analizó la replicación del SARS-CoV-2 en las células mediante PCR cuantitativa en tiempo real (n = 9/grupo). Se realizó ANOVA unidireccional con comparación múltiple y corrección de Dunnett y se mostró la significancia. Todos los datos se muestran como media ± SEM. Se muestran los resultados representativos de uno de los tres experimentos (a, b).

Debido a su alta tasa de mutación, el SARS-CoV-2 ha evolucionado rápidamente, dando lugar a la aparición de muchas variantes con capacidad de escape inmunitario o capacidades mejoradas de proliferación y transmisión en todo el mundo. Entre estas variantes, se ha informado que la variante Delta aumenta la carga viral en los pacientes, lo que contribuye a la rápida propagación mundial de esta variante52. Se ha informado que la eficacia de los anticuerpos de neutralización contra la variante Delta es de 3 a 5 veces menor que la de la cepa SARS-CoV-2 original30,38. Por lo tanto, investigamos si S-BiTE es eficaz contra el pico de la variante Delta.

Primero probamos la unión de S-BiTE a células que expresan Delta-spike. S-BiTE se unió al pico 293-Delta a un EC50 de 3,45 nM, que es similar al observado para el pico WT (Fig. 6a). Luego investigamos si S-BiTE podría causar la lisis de las células que expresan Delta-spike en presencia de células T. S-BiTE podría activar específicamente las células T para liberar IFN-γ y TNF en presencia de células 293-Delta-spike o células A549-Delta-spike de una manera dependiente de la dosis (Fig. 6b, c). De acuerdo con el aumento de la activación de las células T, S-BiTE también indujo una fuerte citotoxicidad hacia las células 293 y A549 que expresan picos de Delta, en lugar de hacia las células de control negativas de picos correspondientes (Fig. 6d, e). Estos resultados demuestran que S-BiTE puede inducir la activación mediada por CD3 de las células T humanas y matar las células que expresan un pico de SARS-CoV-2 mutado, lo que puede ser útil para el tratamiento de las variantes del SARS-CoV-2 que escapan al sistema inmunitario.

Se determinó un MFI de la unión de S-BiTE a células de punta 293-Delta mediante citometría de flujo. Se cocultivaron células b–e 293, 293-Delta spike, A549 y A549-Delta spike con células T primarias humanas en presencia de la concentración indicada de S-BiTE. Después de 24 h, los niveles de IFN-γ y TNF en el sobrenadante se analizaron mediante el ensayo CBA (b, c). Después de 48 h, se determinó la citotoxicidad midiendo las células CD45- mediante citometría de flujo (d, e). Se muestran los resultados representativos de uno de los tres experimentos (n = 3/grupo) (a–e). Se realizó ANOVA de dos vías con comparación múltiple y corrección de Dunnett y se mostró la significación. Todos los datos se muestran como media ± SEM.

Para explorar la eficacia de protección de S-BiTE contra el desafío con el virus SARS-CoV2 Delta-variant in vivo, se eligieron ratones transgénicos hACE2-hCD3ε como modelo in vivo. En ratones transgénicos hACE2-hCD3ε, hACE2 proporciona el receptor de entrada para la infección por SARS-CoV2, y hCD3ε proporciona el objetivo de activación de células T por S-BiTE. Para comparar la eficacia de protección de S-BiTE con el agente neutralizante, también se incluyó un grupo tratado con ACE2 soluble. El peso corporal del grupo ACE2 y S-BiTE disminuyó significativamente menos en comparación con el grupo PBS (Fig. 7a). Dado que el pulmón y el intestino son dos tejidos principales infectados por SARS-CoV2 en este ratón transgénico, se midió y comparó el número de copias de ARN viral a 3 ppp. Las copias de ARN en el pulmón del grupo ACE2 y del grupo S-BiTE fueron significativamente más bajas que las del grupo PBS, reduciéndose a aproximadamente 10−2 y 10−3 del grupo PBS, respectivamente (Fig. 7b, c). Es importante destacar que las copias de ARN del grupo S-BiTE se redujeron a aproximadamente 10-2 del grupo ACE2, lo que sugiere la poderosa protección de la activación de células T mediada por S-BiTE, lo que es consistente con nuestra observación in vitro. Estos resultados demuestran que S-BiTE puede inducir tanto la neutralización como la activación de células T mediada por CD3 in vivo, lo que proporciona una protección de doble capa contra las variantes del SARS-CoV-2 que escapan al sistema inmunitario y puede ser un tratamiento potencial para la COVID-19.

a–c Todos los ratones transgénicos hACE2-hCD3ε (n = 4/grupo) se desafiaron por vía intranasal con SARS-CoV2 Delta-variant, y se administraron por vía intranasal 25 μg de S-BiTE -1, 24 y 48 h después de la infección. Se usaron como controles el mismo mol de ACE2 soluble o el mismo volumen de PBS. a El peso corporal de los ratones se registró y normalizó en los puntos de tiempo indicados. b, c El título de virus en pulmones e intestinos de tres grupos se determinó a 3 dpi mediante qRT-PCR. Se realizaron pruebas T de Student no apareadas (a–c) y se mostró significancia (n = 4/grupo). Todos los datos se muestran como media ± SEM.

Este estudio presenta S-BiTE como una estrategia terapéutica atractiva para el tratamiento de COVID-19 y otras enfermedades causadas por coronavirus que utilizan ACE2 como su receptor. S-BiTE podría bloquear la entrada viral al competir con el pico SARS-CoV-2 en la unión a la membrana ACE2. Además, S-BiTE estimuló las poderosas capacidades citotóxicas de las células T y aumentó la sensibilidad para eliminar las células que expresan picos infectadas por virus. Este diseño funcional dual puede prevenir simultáneamente la propagación viral y reducir la producción de virus.

En comparación con la estrategia de anticuerpos de neutralización ampliamente utilizada, el concepto S-BiTE tiene dos ventajas distintas. La primera ventaja es el uso de ACE2, el receptor de entrada para el SARS-CoV-2, como un grupo objetivo ya que, en teoría, ningún mutante del SARS-CoV-2 debería poder escapar del tratamiento con S-BiTE dirigido a ACE2. Sin embargo, debido a los diferentes epítopos de unión de los anticuerpos de neutralización, es posible que los nuevos mutantes de SARS-CoV-2 puedan escapar del tratamiento de anticuerpos de neutralización prediseñado; Se ha informado que los anticuerpos de individuos vacunados y convalecientes muestran capacidades de reneutralización reducidas contra variantes mutadas del SARS-CoV-230,31,32,33,34,35,36,37,38. Se han utilizado diferentes enfoques para mejorar la capacidad de los anticuerpos de neutralización contra las variantes de escape del SARS-CoV-2, como cócteles de anticuerpos53,54 y anticuerpos biespecíficos25,55. Dirigirse a múltiples epítopos que no se superponen, incluido RBD, puede mejorar suficientemente la afinidad contra la proteína de pico y evitar que se escapen las variantes. Un diseño biespecífico único, ACE-MAB (STI-4920)28, se compone de un ACE2 extracelular truncado y un anticuerpo contra otro epítopo del pico SARS-CoV-2. Este diseño puede neutralizar simultáneamente el SARS-CoV-2 al competir con la membrana ACE2 y bloquear la unión de CD147 para reducir la inflamación pulmonar y la tormenta de citoquinas. La segunda ventaja es el uso de la fracción anti-CD3 para activar las células T, lo que marca la diferencia entre nuestra estrategia y los anticuerpos de neutralización monoclonales, biespecíficos o premezclados. Las células T son críticas para eliminar células infectadas por virus y células tumorales con alta sensibilidad. Al activar las células T, S-BiTE es mucho más eficaz para eliminar las células infectadas por virus que la citotoxicidad mediada por anticuerpos. En el diseño actual, no incluimos una porción Fc en S-BiTE, lo que resultó en una vida media corta in vivo. La función de S-BiTE in vivo puede mejorarse mediante ingeniería adicional con Fc para mejorar su vida media. Además, debido a que involucran diferentes conceptos de diseño, es posible desarrollar una terapia combinada que incluya anticuerpos de neutralización y S-BiTE: los anticuerpos de neutralización se enfocarían en prevenir la propagación viral y S-BiTE se enfocaría en eliminar las células fuente productoras de virus. Se puede aplicar una estrategia similar con una combinación de inhibidores de la replicación viral y S-BiTE. Además, aunque usamos ACE2 como grupo objetivo, creemos que los anticuerpos contra los picos también se pueden usar como grupos objetivo. La unión a epítopos conservados y la activación de células T inducida por la unión son clave en la ingeniería de BiTE basada en anticuerpos contra la infección por SARS-CoV-2. Un enfoque similar ha demostrado que la proteína de fusión ACE2-anti-CD3 puede desencadenar una activación eficaz de las células T CD8 in vitro contra la línea celular que expresa picos56. Nuestro trabajo ha demostrado que es suficiente para activar las células T y su eficacia para controlar la infección viva por SARS-CoV2 tanto in vitro como in vivo.

Una limitación de nuestro estudio es el uso de ratones transgénicos ACE2 y la falta de datos clínicos de apoyo en humanos. La expresión de ACE2 está bajo el control del promotor ubicuo, que puede no reflejar la distribución fisiológica de ACE2. Un enfoque alternativo implicaría estudios en ratones knock-in ACE2 humanos. Sin embargo, debido a que nos enfocamos en la neutralización del virus mediada por picos y la activación de las células T en lugar del ciclo de vida viral, predecimos que la eficacia sería similar en los ratones knock-in ACE2 humanos. No obstante, el conocimiento sobre la tasa de infección de las células epiteliales alveolares tipo II y otras células ACE2+ en ratones knock-in ACE2 en diferentes etapas de infección proporcionará información valiosa desde la perspectiva de evaluar la eficacia y la seguridad57.

En resumen, S-BiTE se puede utilizar en una estrategia basada en células T con la capacidad de neutralizar virus y eliminar las células productoras de virus. Se justifica una mayor optimización de la estabilidad de la molécula BiTE, la selección de la fracción objetivo, la capacidad de neutralización, la seguridad y las estrategias de combinación con terapias antiinflamatorias para mejorar el valor clínico del enfoque S-BiTE en el control de la infección por SARS-CoV-2.

Las células Lenti-X 293 T se adquirieron de Clontech (Mountain View, CA, EE. UU.). La línea celular A549 se obtuvo de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE. UU.). Las células Raji fueron proporcionadas por Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences (Shanghai, China). Las PBMC humanas de sangre de cordón umbilical, células NK y MSC fueron proporcionadas por Shanghai Longyao Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, China). Los plásmidos que codifican el pico SARS-CoV-2 y ACE2 se obtuvieron de Molecular Cloud (Nanjing, China) y se subclonaron en el vector plásmido lentiviral pCDH-EF (System Biosciences, Mountain View, CA, EE. UU.) con el marcador de resistencia a la puromicina.

Para establecer las líneas celulares que expresan SARS-CoV-2 spike-, SARS-CoV-2 Delta spike- o ACE2, se infectaron células Lenti-X 293 T, A549 o Raji con SARS-CoV-2 spike-, Lentivirus que expresa SARS-CoV-2 Delta Spike o ACE2. Después de la selección con puromicina, las células resistentes agrupadas se identificaron mediante análisis de citometría de flujo. El medio de cultivo celular se complementó con suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor al 10 %, 2 mmol/L de L-glutamina, 100 unidades/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina. Las células Lenti-X 293 T, las células A549 y sus derivados se cultivaron en DMEM completo. Las células Raji y sus derivados se cultivaron en medio RPMI completo.

Para la producción de proteínas de fusión S-BiTE, ACE2-Fc y RBD-Fc, las secuencias de ADN que codifican las proteínas indicadas se clonaron en el vector pCDH-EF (System Biosciences). Los plásmidos que contenían la proteína de fusión indicada se transfectaron en células Lenti-X 293 T y los sobrenadantes se recolectaron y purificaron usando una columna Diamond Protein A o Ni Bestarose FF de acuerdo con el protocolo del fabricante (Bestchrom, Shanghai, China).

Las células T Lenti-X 293 se transfectaron con plásmidos del componente del paquete de lentivirus, Gap/pol (n.º 12251, Addgene), RSV-Rev (n.º 12253, Addgene), pCDH-EF-IRFP-luc y pcDNA3.1(+)- 2019-nCoV-spike-P2A-eGFP (#MC_0101087, Nube Molecular). Los sobrenadantes que contenían partículas de lentivirus se recolectaron 48 y 72 h después de la transfección para uso directo o concentración por ultracentrifugación. El título viral en TU/ml se determinó mediante análisis de citometría de flujo de las células 293-ACE2 transducidas.

En el ensayo de neutralización del virus, S-BiTE se diluyó en serie a las concentraciones indicadas en medio Eagle modificado de Dulbecco completo (DMEM). Se inocularon partículas lentivirales pseudotipadas en monocapas de 293-ACE2 o A549-ACE2 en placas de 96 pocillos en presencia de 10 μg/ml de polibreno y concentración indicada de S-BiTE, y se incubaron a 37 °C durante 48 h. Para infectar células A549-ACE2, se utilizó un giro de 60 min a 2500 rpm a 32 °C para mejorar la eficacia de la infección. La actividad del indicador IRFP se midió utilizando CytoFLEX S (Beckman Coulter). El porcentaje de infectividad se calculó como la relación entre la lectura de IRFP en presencia de la proteína de fusión y la lectura de IRFP en ausencia de la proteína de fusión. Las concentraciones inhibitorias medias máximas (IC50) se determinaron utilizando una regresión logística de 4 parámetros (GraphPad Prism, versión 8).

Las suspensiones de células individuales se tiñeron con anticuerpos conjugados. Las muestras de los experimentos in vivo se preincubaron con anti-CD16/32 (receptor anti-FcγIII/II, clon 2.4G2) durante 10 minutos antes de la tinción con anticuerpos. Todos los anticuerpos monoclonales marcados con fluorescencia se adquirieron de Biolegend (San Diego, CA, EE. UU.) o eBioscience (San Diego, CA, EE. UU.). Todos los anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia se adquirieron de Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA, EE. UU.). Las muestras se analizaron en un CytoFLEX S (Beckman Coulter) y los datos se analizaron utilizando el software FlowJo (TreeStar, Inc.).

Las placas ELISA (Jet Biofil, Guangzhou, China) se recubrieron con 2 μg/mL de RBD-Fc a 4 °C durante la noche. Las placas se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía Tween-20 al 0,05 % y se bloquearon con FBS al 2 % en PBS a temperatura ambiente durante 1 hora. Se añadieron muestras diluidas que contenían S-BiTE y las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego, las placas se lavaron tres veces y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpo secundario Fab anti-ratón de cabra conjugado con fosfatasa alcalina (AP) (Jackson ImmunoResearch Laboratories) diluido a 1:2000 en tampón de bloqueo. La actividad AP se midió a 405 nm utilizando un lector de microplacas SpectraMax 190 (Molecular Devices, San Jose, CA) con fosfato de p-nitrofenilo (Guangzhou Howei Pharmaceutical Technology Co. Ltd., Guangzhou, China) como sustrato. Los valores de unión a la mitad de la concentración efectiva máxima (EC50) se calcularon utilizando GraphPad Prism versión 8.

293-CD3 y células T primarias humanas se incubaron con las muestras que contenían S-BiTE indicadas a 4 °C durante 30 min, se lavaron tres veces con FBS al 2 % en PBS, se incubaron con 2 μg/mL de RBD-hFc a 4 °C. C durante 30 min, se lavó tres veces y se incubó con anticuerpos IgG Fc antihumanos de cabra conjugados con Alexa Fluor 647 diluidos 1:200 (Jackson ImmunoResearch Laboratories). A continuación, las células se sometieron a análisis de citometría de flujo.

Las células 293-spike o 293-Delta-spike se incubaron con las muestras que contenían S-BiTE indicadas a 4 °C durante 30 min, se lavaron tres veces con FBS al 2 % en PBS y se incubaron con Alexa Fluor 647 diluido 1:200 conjugado. anticuerpos Fab anti-ratón de cabra (Jackson ImmunoResearch Laboratories). A continuación, las células se sometieron a análisis de citometría de flujo.

Lentivirus fue producido por transfección transitoria de células Lenti-X 293 T con un sistema de cuatro plásmidos. Los sobrenadantes que contenían las partículas lentivirales se recogieron a las 48 y 72 h después de la transfección y se usaron para establecer líneas celulares estables.

Las células T humanas se estimularon con anti-CD3 (0,25 μg/mL; Bio X Cell, Líbano, NH, EE. UU.) y anti-CD28 (1 μg/mL; Bio X Cell) durante 2 días, descansaron durante 3 días y se usaron para el ensayo de activación y destrucción in vitro en RPMI 1640 completo suplementado con IL-2 (50 UI/mL) (Beijing Four Rings Bio-Pharmaceutical Co., Beijing, China) e IL-21 (4 ng/mL; Biolegend). Aproximadamente 1 × 105 células T se cocultivaron con 2,5 × 104 células Raji o Raji-spike; 3,75 × 104 células de 293, 293 picos o 293 picos Delta; o 1,25 × 104 células A549, A549-spike o A549-Delta en presencia de diversas concentraciones de S-BiTE. Después de 1 día, los niveles de TNF e IFN-γ en el sobrenadante se analizaron mediante un ensayo de matriz de perlas citométricas (CBA) de acuerdo con el protocolo del fabricante (BD Biosciences, San José, CA). Después de 2 días, se realizó el ensayo de destrucción usando citometría de flujo. Se usó anticuerpo anti-CD45 para distinguir las células T de las células 293 o A549. Se usaron anticuerpos anti-CD3 y anti-CD19 para distinguir las células T de las células derivadas de Raji.

Las células A549 y A549-spike se marcaron con CFSE (MedChemExpress, Shanghai, China) y CellTraceTM violeta (Life Technologies Corporation, Eugene, OR, EE. UU.), respectivamente, de acuerdo con el protocolo del fabricante. Luego, se sembraron 1,5 × 104 células A549 y A549 marcadas con colorante fluorescente en una placa de 96 pocillos. Después de 6 h, se añadieron al cultivo 1 × 105 células T y varias concentraciones de S-BiTE. La eficiencia de destrucción se determinó utilizando Operetta CLS (PerkinElmer, Waltham, MA, EE. UU.).

Las células T Lenti-X 293 se transfectaron con Gag/Pol (#12251, Addgene), RSV-Rev (#12253, Addgene), pcDNA3.1(+)-2019-nCoV-spike-P2A-eGFP (#MC_0101087, MolecularCloud ) y pCDH-EF-GFP-luc en placas de 24 pocillos. Después de 24 h, se agregaron 1 × 105 células T al cultivo con o sin estimulación con S-BiTE. Los sobrenadantes se recogieron a las 48 h después de la transfección. El título viral se midió infectando células 293-ACE2. Los niveles de TNF e IFN-γ en el sobrenadante se analizaron mediante el ensayo CBA. Se tomaron imágenes de las células liberadoras de virus restantes mediante microscopía fluorescente REVOLVE (ECHO, San Diego, CA, EE. UU.) y se analizaron mediante citometría de flujo.

El ensayo de inhibición de SARS-CoV-2 vivo se realizó en una instalación de nivel de bioseguridad 3 (BSL3) en la Universidad de Fudan. Las células A549-ACE2 se sembraron en placas de 24 pocillos y se infectaron con SARS-CoV-2 vivo (GenBank: MT121215.1) a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,05. Después de 2 h, los virus libres se eliminaron lavando con PBS. Se añadieron células T primarias humanas al cultivo en presencia de 1 ó 10 μg/ml de S-BiTE. A las 24 hy 48 h después de la infección, se recogieron las células y se aisló el ARNm. Se utilizó la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR) para analizar el título viral del ARNm del SARS-CoV-2 con el kit One-Step PrimeScript RT-PCR (Takara, Shiga, Japón) con los siguientes cebadores:

SARS-CoV-2-NF: GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT;

SARS-CoV-2-NR: CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG;

SARS-CoV-2-N-sonda: 5'-FAM- TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'.

A los ratones transgénicos hACE2-hCD3ε se les administraron por vía intranasal veinticinco µg de S-BiTE, un mol igual de ACE2-His o un volumen igual de PBS. Una hora después, los ratones se infectaron por vía intranasal con 10 000 UFP de la variante Delta del SARS-CoV2. Se administraron veinticinco μg de S-BiTE, igual mol de ACE2-His o igual volumen de PBS 24 y 48 h después de la infección. Tres días después, se recolectaron los pulmones e intestinos de tres grupos para aislamiento de ARN y RT-PCR.

Se adquirieron ratones hembra C57BL/6 J de seis a ocho semanas de edad de Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Beijing, China). Se adquirieron ratones transgénicos hACE2-hCD3ε de ocho a diez semanas de edad, ratones hembra NOD-PrkdcscidIL2rγtm1 (NSG) de seis a ocho semanas de edad de Shanghai Model Organisms Center, Inc. (Shanghai, China). Todos los ratones se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos. El cuidado y el uso de animales se realizaron de acuerdo con los protocolos y las pautas institucionales y de los NIH, y todos los estudios fueron aprobados por el Comité de uso y cuidado de animales de la Universidad Jiao Tong de Shanghai y el Cuidado de animales de laboratorio institucional de la Universidad de Fudan (20220609-001).

Las células Raji y Raji-spike se marcaron con 5 o 50 μM de CFSE, respectivamente, de acuerdo con el protocolo del fabricante (MedChemExpress). Aproximadamente 2 × 106 células Raji y Raji-spike marcadas con CFSE se mezclaron con 5 × 106 células T y se inyectaron por vía intraperitoneal en ratones NSG. Los ratones se trataron con PBS o S-BiTE y las células de la cavidad peritoneal se recogieron y analizaron mediante citometría de flujo 6 h después del tratamiento.

El número de réplicas biológicas independientes (n) de cada experimento se anotó en las leyendas de las figuras. Todos los intentos de replicación fueron exitosos. Todos los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad Prism 8. Las barras de error representan la desviación estándar (SD) o el error estándar de la media (SEM). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando la prueba t de Student y análisis de varianza (ANOVA) de una o dos vías con corrección de comparaciones múltiples de Dunnett.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los principales datos que respaldan los resultados de este estudio están disponibles en el documento y su información complementaria. Los datos de origen para todas las figuras se pueden encontrar en Datos complementarios 1. Los conjuntos de datos sin procesar y analizados generados durante el estudio son demasiado grandes para compartirlos públicamente, pero están disponibles para fines de investigación de los autores correspondientes a pedido razonable.

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Agradecemos a los miembros de la Instalación Central de Microbiología y Parasitología de SHMC y al Laboratorio de Bioseguridad de Nivel 3 de la Facultad de Medicina de Shanghai de la Universidad de Fudan, especialmente a Qian Wang, Di Qu y Gaowei Hu. XY recibió el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvención n.° 32261143731 y 81971467) y la Fundación Sheng Yushou. LL recibió el apoyo del Programa Nacional Clave de I+D de China con el número de subvención (2021YFC2300703 y 2022YFC2604102), el Proyecto Principal de Ciencia y Tecnología Municipal de Shanghái (ZD2021CY001 a LL y WX) y el Programa del Líder de Investigación Académica/Tecnológica de Shanghái (subvención n.º 20XD1420300) .

Estos autores contribuyeron por igual: Fanlin Li, Wei Xu, Xiaoqing Zhang, Wanting Wang.

Centro Sheng Yushou de Biología Celular e Inmunología, Facultad de Ciencias de la Vida y Biotecnología, Universidad Jiao Tong de Shanghái, Shanghái, 200240, China

Fanlin Li, Xiaoqing Zhang, Wanting Wang, Ping Han, Haiyong Wang, Yanqin Xu, Min Li, Lilv Fan, Huihui Zhang, Qiang Dai, Hao Lin, Xinyue Qi, Jie Liang y Xuanming Yang

Laboratorio de Investigación Internacional Conjunto de Ciencias Metabólicas y del Desarrollo, Universidad Jiao Tong de Shanghái, Shanghái, 200240, China

Fanlin Li, Wanting Wang, Ping Han, Haiyong Wang, Yanqin Xu, Min Li, Lilv Fan, Huihui Zhang, Qiang Dai, Hao Lin, Xinyue Qi, Jie Liang y Xuanming Yang

Laboratorio Clave de Virología Médica Molecular (MOE/NHC/CAMS), Instituto de Enfermedades Infecciosas y Bioseguridad de Shanghái, Facultad de Ciencias Médicas Básicas y Laboratorio de Bioseguridad Nivel 3, Universidad de Fudan, Shanghái, 200032, China

Wei Xu, Shan Su, Shibo Jiang, Youhua Xie y Lu Lu

Departamento de Fisiología, Universidad Médica Naval, Shanghái, 200433, China

Xiaoqing Zhang

Shanghai Longyao Biotechnology Limited, Shanghái, 201203, China

Wang Xin

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XY, LL y YH.X. diseñó el proyecto. FL, WX, XZ, WW, SS, PH, HW, YQ.X., ML, LF, HZ, QD, HL, XQ, JL, XW, SJ y XY realizaron los experimentos. FL, XZ, WX, WW y XY analizaron los resultados y escribieron el manuscrito con aportes de todos los coautores.

Correspondencia a Youhua Xie, Lu Lu o Xuanming Yang.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Este manuscrito ha sido revisado previamente en otra revista de Nature Portfolio. Communications Biology agradece a luca Varani, Roberto Speck y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Zhijuan Qiu y David Favero. Un archivo de revisión por pares está disponible. Este documento solo contiene comentarios de los revisores y cartas de refutación para las versiones consideradas en Communications Biology.

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Reimpresiones y permisos

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Recibido: 21 febrero 2023

Aceptado: 18 de mayo de 2023

Publicado: 01 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04955-3

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