Células ordenadas hiPSC

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 483 (2023) Citar este artículo

1269 Accesos

2 Altmetric

Detalles de métricas

Últimamente, se han empleado numerosos sistemas microfisiológicos para modelar el túbulo proximal renal. Sin embargo, falta investigación sobre el perfeccionamiento de las funciones de la capa epitelial del túbulo proximal: filtración y reabsorción selectivas. En este informe, las células del túbulo proximal pseudo extraídas de organoides renales derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos se combinan y cultivan con células del túbulo proximal inmortalizadas. Se muestra que el tejido cocultivado es un epitelio impermeable que ofrece niveles mejorados de ciertos transportadores, proteínas de la matriz extracelular, colágeno y laminina, y transporte de glucosa y actividad de glicoproteína P superiores. Se detectaron niveles de expresión de ARNm más altos que los obtenidos de cada tipo de célula, lo que sugiere una diafonía sinérgica anómala entre los dos. Además, las mejoras en las características morfológicas y el rendimiento de la capa de tejido del túbulo proximal inmortalizado expuesta, tras la maduración, a las células endoteliales de la vena umbilical humana se cuantifican y comparan minuciosamente. Se mejoró la reabsorción de glucosa y albúmina, así como las tasas de salida de xenobióticos a través de la glicoproteína P. Los datos presentados al corriente destacan las ventajas de la capa epitelial cocultivada y la bicapa no basada en iPSC. Los modelos in vitro presentados aquí pueden ser útiles en estudios personalizados de nefrotoxicidad.

El túbulo proximal ubicado en la franja externa de la médula renal es el sitio principal para la reabsorción de sodio, agua, aminoácidos y otros nutrientes esenciales, como la glucosa y la albúmina, que de otro modo se habrían desperdiciado del filtrado glomerular1,2. Por lo tanto, el órgano tiene una importancia crucial y ha sido objeto de varios intentos de modelado3,4,5,6,7.

Aunque los datos recientes destacan claramente los efectos de la vasculatura endotelial en el epitelio del túbulo proximal6, todavía falta investigación sobre la optimización del propio tejido epitelial, ya que los modelos anteriores han utilizado células primarias o líneas celulares inmortalizadas. Una opción sería utilizar células madre por su reproducibilidad y la capacidad de ofrecer características similares a las in vivo. Sin embargo, no existen fuentes de células madre capaces de producir nefronas en el órgano adulto, ya que todos los progenitores de nefronas se agotan al nacer8,9,10, mientras que la obtención de células progenitoras renales a partir de riñones embrionarios puede parecer éticamente inapropiada.

Como alternativa, dichos progenitores pueden recrearse a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) y diferenciarse directamente en una variedad de tipos de células renales a través de protocolos graduales11,12,13,14. Aunque recientemente se han generado células similares a túbulos proximales a partir de líneas iPSC directamente con fines de evaluación en el chip15, en general, estos productos especializados carecen del nicho 3D presente in vivo.

Con este fin, iniciamos la idea de extraer células de organoides de riñón derivados de hiPSC. Los organoides de riñón derivados de hiPSC recapitulan las últimas etapas de desarrollo, tienen una estructura 3D compleja y contienen células de todos los linajes de riñón, lo que los convierte en fuentes adecuadas de células con más características in vivo. Además, no poseen los desafíos éticos de obtener y diferenciar progenitores de nefronas embrionarias.

Varios estudios han propuesto la idea de generar organoides renales mediante la diferenciación de células pluripotentes humanas (hPSC)13,14,16,17,18. Sin embargo, de las cuatro poblaciones progenitoras implicadas en el desarrollo del riñón humano, es decir, progenitores de nefronas, epiteliales ureterales, endoteliales e intersticiales renales, la mayoría de estos protocolos crean las dos primeras, formando sólo nefronas o conductos colectores. El proceso de diferenciación de hPSC en organoides renales presentado por Takasato et al. recapitula todo el curso de la organogénesis del riñón humano19,20. Tiene la ventaja de producir simultáneamente las cuatro poblaciones progenitoras involucradas en la formación de organoides renales sobre los métodos informados anteriormente. Además, estos organoides contienen las principales estructuras presentes en el riñón humano. En el contexto de la evaluación de la función celular, se argumenta que exponer los organoides a compuestos de interés y evaluar la absorción celular sería problemático porque la polaridad apical/basolateral correcta de las células no se puede afirmar en conjunto15. Pero, ¿qué pasa si esas células se extraen y depositan en una plataforma 2D de manera que se forme la polaridad correcta?

Si bien se han informado métodos para la diferenciación directa de células madre embrionarias humanas (hESCs)21, hPSCs e hiPSCs22 en células similares a túbulos proximales, y se han establecido algunas aplicaciones, el consenso general es que la falta de condiciones similares in vivo como ECM es la razón de su rendimiento no óptimo23.

Para abordar este problema, algunos estudios han propuesto la idea de mezclar estas células con otros tipos de células, como las células primarias. Por ejemplo, recientemente Beauchamp et al. mostró que el cocultivo de fibroblastos cardíacos con cardiomiocitos hiPSC (hiPSC-CM) prolonga la actividad de latidos espontáneos y mejora la frecuencia y la amplitud de las contracciones con respecto a los iPSC-CM puros24. La consiguiente pérdida de expresión de α-SMA indicó un patrón más similar al tejido cardíaco en el cocultivo. Por supuesto, existen otros enfoques ampliamente utilizados, como la estimulación eléctrica, que pueden no ser aplicables a las células renales25.

Aquí, el epitelio del túbulo proximal se formó en un sistema microfisiológico, denominado túbulo proximal en un chip (PToC), utilizando células extraídas de organoides de riñón derivados de hiPSC. Las células que se separaron a través de la separación celular inmunomagnética (MACS) tenían un origen en el túbulo proximal, como lo demuestra la inmunotinción contra las proteínas específicas del túbulo proximal y su expresión génica. Sin embargo, tras el cultivo, los niveles de expresión de estos marcadores caen significativamente tanto a nivel de mRNA como de proteína, lo que deja abierta la cuestión del potencial de las células derivadas de organoides para funcionar correctamente. Además, las células clasificadas tendieron a recuperar su nicho organoide y comenzaron a formar agregados, lo que imposibilitó evaluar el rendimiento de filtración del tejido en la membrana del chip de microfluidos. Establecimos que dicha agregación podría reducirse en gran medida en un cocultivo de proporción 1: 1 con células del túbulo proximal inmortalizadas. Hasta donde sabemos, el concepto de cocultivo de dos tipos de células similares, uno inmortalizado y el otro obtenido a partir de organoides derivados de hiPSC, aún no se ha investigado.

Hasta la fecha, se ha desarrollado una gran cantidad de modelos bioimpresos 3D y microfluídicos 2D para la detección de fármacos y para imitar la función de filtración del túbulo proximal3,4,5,6,7. El argumento ha sido que los modelos 3D son superiores porque están incrustados dentro de una matriz extracelular y, por lo tanto, pueden recapitular el nicho in vivo. Sin embargo, hasta donde sabemos, no se ha realizado ningún análisis cuantitativo para manifestar tal ventaja. En este proyecto, tenemos la intención de revisar la vista convencional formando una bicapa de tejido 2D con un espacio intermedio epitelial/endotelial más estrecho que el de los modelos bioimpresos 3D informados anteriormente7. En última instancia, evaluamos el rendimiento de los procesos de reabsorción y citopepsia de albúmina y glucosa junto con la funcionalidad de la glicoproteína P (Pgp) del transportador de salida, lo que demuestra que incluso un breve contacto con HUVEC mejora sustancialmente las tasas de filtración.

La autoorganización 3D y la nefrogénesis comienzan el día 7, después de recolectar la mezcla de células progenitoras y sedimentarlas en filtros Transwell (Fig. 1a). Se estableció que el organoide contiene un porcentaje y condición óptimos de células del túbulo proximal el día 22. La población de EpCAM+ (túbulos renales) se identificó como un superconjunto de células del túbulo proximal marcadas con un marcador de borde en cepillo, Lotus Tetragonolobus Lectin (LTL), y más específicamente por el transportador de albúmina, megalina (Fig. 1b). Según las estimaciones anteriores, el organoide contiene aproximadamente un 20-30% de la población de células del túbulo proximal19. Se presenta una reconstrucción confocal 3D del organoide (Películas complementarias 1 y 2).

a El protocolo simplificado de diferenciación de hiPSC en mesodermo intermedio y formación de organoides de riñón 3D, seguido de disociación, clasificación y siembra de las células según lo ordenado. Organoide disociado, LTL + y LTL–, se refieren a células organoides disociadas, fracción positiva de MACS y fracción negativa de MACS, respectivamente. b Seleccione imágenes fluorescentes confocales y de campo claro (proyectadas con intensidad z) de organoides renales el día 22. La inmunoquímica es para EpCAM y marcadores de túbulos proximales, LTL y megalin. c Efecto de la concentración de LTL (factores de dilución de 1/50 o 1/100) sobre la especificidad de MACS, N = 4 experimentos y las barras de error representan la desviación estándar de los datos, *p < 0,05. d Niveles de expresión génica relativos obtenidos de células clasificadas y cultivadas durante 7 días en placas de cultivo y PToC: Organoides, células organoides disociadas el día 22; LTL+/–, fracción positiva/negativa de productos MACS. El área blanca corresponde a muestras obtenidas de células disociadas (organoides) y clasificadas, mientras que el área gris indica muestras de células cultivadas durante 7 días. Las barras de error representan la desviación estándar con N = 3 experimentos biológicamente independientes. NS, no significativo para p > 0,05; *p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,01; ***p ≤ 0,001; **** p ≤ 0,0001. e Evolución de células LTL+ cultivadas en la membrana en agregados, barra de escala, 200 μm. El marco amarillo muestra el límite entre el agregado celular y la monocapa. Barra de escala, 200 μm. f Inmunoquímica el día 7 para EpCAM, LTL y megalina, marcadores de túbulos proximales, en células clasificadas extraídas de organoides renales y sembradas en el PToC. Para los escaneos fluorescentes de tejido LTL+ se realizaron en partes seleccionadas en la proximidad de los agregados como se enmarca en (e). Barra de escala, 50 μm.

El día 22, los organoides se disociaron en una suspensión celular. La suspensión se expuso parcialmente a LTL y se sometió a MACS después de determinar la concentración óptima de anticuerpos (Fig. 1c). (Consulte también la sección "Métodos" y la Tabla complementaria 1 para obtener más detalles). También examinamos FACS por su mayor grado de especificidad y caracterizamos los productos clasificados y cultivados (Figuras complementarias 1, 2 y Datos complementarios 1). Sin embargo, finalmente procedimos con MACS debido a su capacidad para producir células con características fenotípicas lo suficientemente similares a las células primarias del túbulo proximal (Películas complementarias 3–6). Posteriormente, las fracciones positivas y negativas de los productos MACS se recogieron y cultivaron durante 7 días en condiciones 2D o lisadas, clasificadas, junto con el resto de la suspensión celular. Para determinar si el compartimento del túbulo proximal de la nefrona estaba presente en nuestros organoides y examinar el efecto del cultivo 2D, realizamos un análisis de ARNm contra una serie de genes relevantes.

Encontramos que el nivel de expresión de CDH6 (K-cadherina), un marcador específico de las células progenitoras del túbulo proximal16,26,27, aumentó durante el cultivo, mientras que el aumento fue más pronunciado para la fracción negativa (LTL–). Es decir, los aumentos fueron 2,2 veces y 6,2 veces para las poblaciones LTL+ y LTL–, respectivamente (Fig. 1d). Por el contrario, el entorno 2D no fue favorable para el resto de los marcadores examinados, ya que los niveles de expresión disminuyeron (ABCB1, CUBN, LRP2, SLC3A1 y posiblemente SLC12A1) o disminuyeron totalmente (SLC22A6 (OAT1)).

El tejido cultivado a partir de células LTL+ cultivadas en los chips (Fig. 3a,b complementaria) comenzó a agregarse y a formar pequeños aglomerados similares a esferoides en la membrana (Fig. 1e). Sin embargo, la inmunotinción confirmó la abundancia de proteínas del túbulo proximal en estas células. EpCAM, LTL y megalin aparecieron con alto contraste, únicamente en agregados de células LTL+ que se formaron lentamente y se hicieron discernibles alrededor de D7 (Fig. 1f). No se observaron agregados en la capa de tejido LTL (Figura complementaria 3c).

Después de MACS, las fracciones LTL+ y LTL– se recolectaron y cultivaron a 107 células mL–1. Además, se examinó un cocultivo 50:50 de cada una de las fracciones con células epiteliales del túbulo proximal renal inmortalizadas (células RPTEC/TERT1, en lo sucesivo denominadas RPTEC) (Fig. 2a). Como se muestra en las imágenes de campo claro (Fig. 2b), las células LTL+ recuperaron su nicho organoide y comenzaron a agregarse. Sin embargo, una vez cocultivadas con células RPTEC, se aplanaron, lo que permitió estudiar la función de barrera. Quedó claro que las células LTL+ y RPTEC se mezclaron bien, proporcionaron una capa confluente y fueron positivas para EpCAM (Fig. 2c). Mientras que, por el contrario, aunque las células LTL- en la mezcla estaban agrupadas, no podían fusionarse en un tejido continuo. La capa epitelial de LTL+/RPTEC se denominará en lo sucesivo cocultivo. Los escaneos láser confocales dirigidos desde el lado apical al basal muestran la expresión de marcadores de túbulos proximales apicales (LTL, ZO-1 y Pgp) y basolaterales (EpCAM) (Películas complementarias 7–9).

a Línea de tiempo (en días) que demuestra el ensayo de cocultivo. Las hiPSC se colocan en placas 23 días antes del cocultivo como se describe anteriormente, seguidas de las RPTEC que se subcultivan el día –5. Los organoides de riñón se cosechan al madurar, se disocian y se mezclan en partes iguales con RPTEC. A continuación, la mezcla de células se introduce en el chip. b Imágenes de campo claro que muestran la evolución de LTL+ y tejidos cocultivados con el tiempo. Las células de fracción positiva solamente comienzan a agregarse desde ∼D4 y forman esferoides separables en D7 (como lo indican las puntas de flecha rojas), lo que hace que el dispositivo no sea práctico para las evaluaciones de filtración. Mientras que no se observa desprendimiento en el cocultivo con RPTEC. Barra de escala, 200 μm. c Imágenes fluorescentes proyectadas de intensidad Z tomadas de muestras inmunoteñidas en D7. DAPI, F-actina y EpCAM están representados en azul, amarillo y verde, respectivamente. Una vez cocultivadas con RPTEC en una proporción de 50/50, las células LTL+ se mezclan bien y forman una capa de tejido confluente. Sin embargo, el cocultivo de la fracción LTL– con RPTEC no produce una capa de tejido confluente. El tejido se desprende parcialmente como lo indican las puntas de flecha blancas. EpCAM se expresa débilmente en todo este tejido y principalmente en los RPTEC. Las líneas discontinuas grises muestran el paradero de la membrana PToC. Barra de escala, 200 μm. d Imágenes fluorescentes, de campo claro y fusionadas del tejido cocultivado en D14. Las filas superiores muestran que el canal está cubierto por células RPTEC y LTL+ por igual en su totalidad. Las imágenes de gran aumento en la fila inferior aclaran que las células disociadas/clasificadas en la mezcla no solo forman pequeños agregados, sino que también se distribuyen casi uniformemente en todo el tejido de cocultivo. Las barras de escala están en 1 mm y 100 μm en las filas superior e inferior, respectivamente. Las líneas discontinuas son para guiar el ojo.

Para las pruebas preliminares, se emplearon hiPSC positivas para GFP en el cultivo del organoide para facilitar el seguimiento de las células clasificadas. Quedó claro que en el tejido de cocultivo ambos tipos de células mantienen su conformidad en toda la capa. Se distinguen células derivadas de organoide que pueblan ~50% del epitelio (Fig. 2d). Para el día 14, los agregados se asimilaron al cocultivo, aunque aún quedaban algunos racimos. En esta etapa se consideró que el tejido estaba listo para ser caracterizado.

Aparentemente, el marcador del borde en cepillo se expresa más fuertemente en las células LTL+ derivadas de organoide renal que en las RPTEC. Además, observamos que en el tejido de cocultivo las células LTL+ secretan su propia ECM en la proximidad de las RPTEC ya que tanto la laminina como el colágeno IV aparecen densamente donde el anticuerpo LTL se expresa fuertemente. La expresión intensa de Pgp en el cocultivo puede sugerir una capacidad mejorada en la eliminación de sustancias exógenas. (Figura 3a).

a Inmunohistoquímica para LTL, laminina-111 (α1β1γ1) heterotrímero, colágeno IV y Pgp en RPTEC de una sola capa y capas de tejido cocultivado el día 14, destacando la mejora de ambas proteínas ECM en este último. Los grupos unidos a laminina y colágeno, que se asemejan morfológicamente a los grupos epiteliales de los islotes in vivo, aparecen principalmente alrededor de las células LTL+ separadas de los organoides, como lo indican las puntas de flecha blancas y verdes. Lo mismo se aplica a la proteína apical del túbulo proximal, Pgp. Barras de escala, 30 μm. b Aparición de uniones estrechas alrededor de grupos de células LTL+ en D7 y en todo el tejido de cocultivo en D14. En (a) y (b), los pares de imágenes se toman de la misma muestra y las barras de escala son de 30 μm. c Evolución de la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) con tiempo de cultivo para las capas de tejido solo RPTEC y cocultivo. En el sistema de cocultivo, la resistencia aumenta más abruptamente y alcanza la primera meseta de dos (punta de flecha verde claro), posiblemente debido a las células LTL+ más pequeñas en la mezcla. La segunda meseta (punta de flecha verde oscuro) ocurre casi al mismo tiempo que la resistencia se satura en el sistema de solo RPTEC y corresponde a la contribución de los RPTEC en la mezcla (punta de flecha azul claro). TEER se normaliza al valor de estado estacionario final del tejido solo RPTEC. N = 3 y 2 experimentos independientes para casos de RPTEC solo y cocultivo, respectivamente. d Micrografías TEM que destacan la aparición y el establecimiento de uniones estrechas (puntas de flecha de color rojo oscuro) en las monocapas de cocultivo en D7 y D14. Barra de escala, 1 μm. V, vacuola. e La inmunocitoquímica para megalina y laminina-111 muestra una mejora en la intensidad de la expresión y la distribución de ambas proteínas en el cocultivo causado por la tensión de cizallamiento inducida por el flujo. Barra de escala, micrografías TEM de 50 μm (f) de células representativas del sistema de cocultivo que comparan las condiciones de cultivo estático y de perfusión. En este último se revela la formación de diversas morfologías de tejido epitelial, como monocapas planas (que cubren casi toda el área de la membrana), monocapas con protuberancias celulares y pilas de células de frente a frente (apical-apical). Todas las micrografías TEM son de las células fijadas en D14. Las barras de escala representan 2 μm y 6 μm para micrografías que representan condiciones estáticas (superior) y perfundidas (inferior), respectivamente. M, mitocondrias; N, núcleo; mem, membrana de PET. g Cuantificación de la longitud/densidad de las microvellosidades y la altura de las células en el sistema de cocultivo en D14. Definimos la densidad de vellosidades como el recuento de protuberancias dividido por la longitud de la periferia de la sección transversal de la membrana celular, medida a partir de instantáneas individuales. La tensión de cizallamiento inducida por el flujo manifestó el crecimiento no solo de microvellosidades más largas y densas, sino también de células más altas, lo que evidencia una traducción de morfología escamosa a cuboide. Todas las muestras están en D14. Con fines de cuantificación, de un total de N = 3 experimentos TEM independientes por condición, se seleccionaron aleatoriamente n = 6, 5 y 24 celdas para medir la longitud de las vellosidades, la densidad de las vellosidades y la altura de las celdas, respectivamente. Las barras de error representan la desviación estándar de los datos.

El efecto sinérgico de combinar células LTL+ con RPTEC también se evidencia por la fuerte aparición de la proteína de unión estrecha. ZO-1 aparece temprano en D7 en el cocultivo (Fig. 3b), correspondiente a la primera meseta observada en el perfil TEER de la Fig. 3c. En estos gráficos, las líneas continuas y discontinuas representan una estimación suavizada de las tendencias TEER para los casos de RPTEC y cocultivo, respectivamente. La primera meseta se produce en una fecha anterior en el cocultivo (como se muestra con una punta de flecha de color verde claro), lo que indica un período de inhibición de contacto más corto. Las células LTL+ son más pequeñas en promedio y exhiben una fase logarítmica más pronunciada. Las resistencias convergen alrededor del día 14, siendo el cocultivo (punta de flecha verde oscuro) ligeramente más resistente que el tejido RPTEC (punta de flecha azul claro). Las uniones estrechas también se visualizan en las imágenes TEM (Fig. 3d). Nuestra estrategia de medición y configuración de TEER se informó anteriormente28,29. Las imágenes archivadas brillantes muestran la evolución de las capas de cultivo de tejidos en los chips TEER con el tiempo (Fig. 3d complementaria). Se verificó la función de barrera clara de la capa epitelial antes de realizar mediciones de transporte en D14 (Fig. 3e complementaria).

Para demostrar y cuantificar los posibles efectos del estímulo mecánico, expusimos el lado apical del tejido al esfuerzo cortante inducido por el flujo. El efecto del flujo de medios en el cultivo de tejidos es doble. A diferencia de la condición de estancamiento, el flujo no solo ayuda a reponer componentes cruciales de los medios, por ejemplo, factores de crecimiento y hormonas, sino que también ejerce una tensión de cizallamiento en el tejido subyacente. Estos dos efectos rara vez se han distinguido en la literatura de los sistemas microfisiológicos renales. Aquí también hicimos circular los medios de cultivo en la condición de cultivo estático, pero con una velocidad de flujo minúscula (1 μL min–1) para garantizar que la tensión de cizallamiento fuera insignificante mientras se mantenía el suministro de componentes del medio. De esta manera pudimos discernir claramente y estudiar el efecto del estímulo mecánico en el lado apical del endotelio. Se sabe que las células del túbulo proximal responden al estímulo de cizallamiento dentro de un cierto rango. Se mide que el esfuerzo cortante continuo a lo largo del túbulo proximal varía de 0,1 a más de 1 dina cm–2 in vivo30,31. Sin embargo, debido a la retroalimentación tubuloglomerular, el flujo instantáneo hacia el túbulo puede ser pulsátil en lugar de uniforme32. Se espera que a un ritmo dado, un flujo pulsátil sea más estimulante.

Anteriormente, Long et al. observaron que la diferenciación celular, la proliferación y, en cierta medida, la endocitosis aumentaban a niveles más bajos de tensión de cizallamiento33. En la condición de medio perfundido, circulamos el medio a una velocidad de 10 μL min–1, lo que resultó en una tensión de cizallamiento promedio de 0,06 dina cm–2, que es aproximadamente los valores mínimos informados in vitro. Como resultado, podríamos inferir que la naturaleza pulsante instantánea de la bomba peristáltica (Fig. 4a, b complementaria) puede desempeñar un papel en las mejoras en la morfología y función celular observadas aquí. La inmunotinción reveló que incluso una cantidad tan pequeña de tensión de cizallamiento afecta notablemente la intensidad y distribución de megalina en los epitelios maduros de los sistemas de bicapa cocultivo y no iPSC.

Se mejoraron varios factores morfológicos y funcionales. Megalin, un cotransportador de albúmina, se redistribuyó en el citosol y es evidente que la secreción de laminina ha mejorado (Fig. 3e). La microscopía electrónica también reveló alteraciones significativas en la morfología de las células. Además de los rasgos característicos de las células maduras del túbulo proximal con estructuras de borde en cepillo, se observaron áreas ricas en vacuolas y mitocondrias en las células cocultivadas. Las células expuestas al medio fluido durante solo 3 días sufrieron una reducción de la superficie apical y basal que es indicativa de un cambio de fenotipo escamoso a cuboideo (Fig. 3f)34,35. También pudimos cuantificar algunos de estos cambios geométricos analizando una gran cantidad de imágenes TEM. Como se ilustra en los gráficos de la Fig. 3g, las células cocultivadas crecieron y desarrollaron microvellosidades más largas y densas. Para tales fines de cuantificación, solo contamos las células en la monocapa y descartamos las pequeñas fracciones del tejido que contenía células estratificadas.

En comparación con cualquier fuente de células, los niveles de expresión de ARNm de ciertos genes clave se elevaron en el epitelio cocultivado (Fig. 4a). Sin embargo, se observaron discrepancias entre estos niveles y los niveles de expresión de proteínas de los marcadores correspondientes, como lo revela la inmunotinción. Por ejemplo, aunque ABCB1 se expresó casi al mismo nivel en las muestras de tejido RPTEC y cocultivo, se encontró más abundantemente Pgp en este último. Los transportadores de glucosa y albúmina, SGLT2 y LRP2, respectivamente, estaban elevados en los niveles de mRNA y proteína. LRP2 sorprendentemente aumentó más de 100 veces.

a Los niveles de expresión de ciertos genes en el cocultivo RPTEC/LTL+ muestran una mejora con respecto a los de cada componente. Los niveles de expresión génica relativos funcionales, ABCB1 (MDR1), AQP1, LRP2, SLC22A2 (OCT2), SLC5A2 (SGLT2) y estructurales, CDH6 (K-cadherina) y EpCAM (frente a los del nivel ACTB), se acompañan de cantidades (normalizadas a los valores del tejido RPTEC). A excepción de ABCB1 y EpCAM, los niveles de expresión de otros genes aumentaron significativamente en el tejido cocultivado. No hubo efecto perjudicial sobre los niveles de expresión de ARNm; N = 2 y 5 experimentos biológicamente independientes para monocultivos RPTEC/LTL+ y el caso de cocultivo, respectivamente; Las barras de error representan la desviación estándar de los datos. Tasas de reabsorción de glucosa (b) y permeabilidades aparentes (Papp) a Rh123 (c) medidas en D14 para capas de tejido solo RPTEC y cocultivadas sujetas a condiciones de cultivo estáticas y perfundidas. El transporte vectorial se verifica en todos los casos. Las tasas de transferencia se estimaron mediante la realización de una regresión lineal en los datos del transcurso del tiempo. a → b, apical a basal; b → a, basal a apical; Medidas tomadas de un mínimo de N = 3 chips independientes; Las barras de error representan la DE de la media; NS, no significativo para p > 0,05; *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01; ***p ≤ 0,001; **** p ≤ 0,0001.

Presumimos que tal aumento en los niveles de proteína transportadora podría conducir a un mejor transporte transepitelial activo. Para probar nuestra hipótesis, cuantificamos la tasa de reabsorción de glucosa y la tasa de excreción de rodamina 123 (Rh123), como medidas de actividad de SGLT2 y Pgp, respectivamente. Mostramos que las tasas de transporte apical a basal (a → b) de glucosa en el cocultivo mejoraron aproximadamente 1,75 y 2,50 veces con respecto a la monocapa de solo RPTEC en condiciones de cultivo estáticas y perfundidas, respectivamente (Fig. 4b). Entre las cuatro condiciones examinadas, mientras que las tasas de transferencia a → b del sustrato fueron significativamente más altas que las de la dirección inversa (b → a), no hubo cambios significativos en las tasas de transferencia inversa. Ambas observaciones confirman la naturaleza vectorial del transporte de glucosa.

Las permeabilidades aparentes (Papp) al sustrato Pgp, Rh123, se muestran en la Fig. 4c. Dado que las tasas de excreción (b → a) son más altas que las tasas de absorción (a → b), el transporte es unidireccional en los cuatro casos examinados. Además, la relación de eflujo del sustrato, definida como la relación entre las tasas de excreción y absorción, se incrementó en un 90 % en el sistema de cocultivo en condiciones de cultivo estático, lo que confirma una mejora sustancial en la capacidad de depósito de xenobióticos.

Para crear canales endoteliales peritubulares y epiteliales del túbulo proximal completamente aislados, adaptamos nuestro protocolo para garantizar que se forme un tejido RPTEC completamente sellado antes de la introducción de HUVEC (Fig. 5a). Esto no solo evitó la mezcla de EGM2 y REGM que de otro modo habría causado el desprendimiento de las HUVEC (Fig. 4c, d complementarias), sino que también nos permitió estudiar los efectos de las células endoteliales en un tejido epitelial del túbulo proximal madurado. Antes de la siembra, cubrimos la membrana en ambos lados únicamente con un agente de adhesión celular y permitimos que las células secretaran su propia MEC. Si bien no se aplicó proteína ECM externa, la bicapa se mantuvo de manera segura durante al menos 10 días, después de lo cual las HUVEC comenzaron a desprenderse (Fig. 4e complementaria y Películas complementarias 10 y 11).

a El cronograma de los procesos de siembra y mantenimiento de células genéricas. Los HUVEC no están incluidos para los dispositivos de una sola capa. b Evolución temporal de las resistencias notificadas de las capas de tejido solo RPTEC (círculos azules), bicapa (cuadrados rojos) y solo HUVEC (triángulos verdes). Para los dispositivos bicapa, una vez que se introducen las HUVEC en D10, la resistencia general salta tras la formación de una capa endotelial confluente y luego comienza a disminuir hasta alcanzar el estado estacionario en D14/d4. Las líneas discontinuas indican las resistencias promedio obtenidas durante los últimos 4 días de cultivo (barras de colores) para cada caso. Todos los valores medidos están normalizados a los del RPTEC TEER en estado estable, es decir, 60 Ω cm2 (línea discontinua azul). Las flechas de dos puntas verde y roja indican, respectivamente, la resistencia notificada de la capa de solo HUVEC y el incremento de resistencia medido tras la adición de HUVEC al tejido solo de RPTEC. Se forma una bicapa estable en D14/d4. Los RPTEC se cultivaron en N = 6 dispositivos, de los cuales N = 3 se convirtieron en bicapa tras la adición de HUVEC en D10. N = 3 dispositivos se dedicaron solo al tejido HUVEC. c Inmunohistoquímica para ZO-1, EpCAM y megalin en tejido RPTEC del sistema bicapa junto con imágenes fluorescentes de HUVEC marcados con RFP correspondientes, que muestran la evolución de las uniones estrechas, el grado de reepitelización y la distribución del transportador de albúmina, respectivamente . La actividad y la integridad del tejido alcanzan su punto máximo entre D14/d4 y D17/d7. Barra de escala, 50 μm. d Efecto de HUVEC sobre la intensidad de la expresión de ZO-1; En presencia de HUVEC, las uniones estrechas aparecieron desde D14/d4 (punta de flecha verde) en adelante y se hicieron claramente visibles en D17/d7, mientras que en ausencia de HUVEC aparecieron débilmente, incluso con una transmisividad láser confocal considerablemente mayor. No se usó Triton X en este experimento. Las barras de escala son de 100 μm. Todas las imágenes fluorescentes se proyectan con intensidad z confocal. Barra de escala, 100 μm.

Similar al sistema de cocultivo de una sola capa, probamos la resistencia eléctrica general del sistema RPTEC/HUVEC durante todo el curso del cultivo en intervalos. Se usaron dispositivos con tejido RPTEC y HUVEC de una sola capa para comparar y todos los valores se escalaron con respecto al TEER promedio de RPTEC medido durante los últimos 4 días de cultivo, es decir, 60 Ω cm2 (Fig. 5b). La resistencia general se sobrepasa durante la formación de una monocapa HUVEC confluente de D10/d0 a D13/d3 y luego se estabiliza más allá de d4. Sin embargo, la amplitud del salto de resistencia tras la creación de la bicapa, como indica la flecha roja en la Fig. 5b, no es significativamente diferente de la resistencia del tejido solo HUVEC (flecha verde). Como resultado, aunque el perfil de resistencia bicapa parece estable durante el cultivo, es poco probable que la introducción de HUVEC haya afectado significativamente la resistencia transepitelial de la capa RPTEC. Por lo general, los cultivos en monocapa de RPTEC exhiben TEER de alrededor de 0,1 a 1 kΩ cm2 36,37, mientras que se sabe que el tejido del túbulo proximal in vivo muestra valores que son un orden de magnitud más pequeños. A menudo se argumenta que la función de barrera más permeable del tejido in vivo se debe a un mayor transporte transcelular o paracelular38. Aparentemente, y posiblemente por la misma razón, los valores de resistencia de unas pocas decenas de Ω cm2 medidos aquí se encuentran entre los valores informados anteriormente para las monocapas de RPTEC y el tejido del túbulo proximal in vivo. Más adelante establecemos que los HUVEC sí juegan un papel en dicha mejora.

Está bien establecido que una red de señalización paracrina se forma una vez que las RPTEC se cocultivan con células endoteliales, lo que conduce a una mejor tasa de proliferación y diferenciación de RPTEC39. En nuestro caso, la evidencia de interacción y tal señalización entre HUVEC y RPTEC fue perceptible desde el día 4 de la formación de la bicapa. Observamos que en presencia de HUVEC, la integridad del tejido epitelial y posiblemente la función alcanzan su punto máximo en algún momento entre los días 4 y 7 de la formación de la bicapa, como lo demuestra la apariencia constante de EpCAM/ZO-1 y la expresión de megalina dispersada al máximo (distribuida uniformemente) en d7 (figura 5c). Dado que megalin es un transportador de albúmina móvil, se concluye que se mejora la entrega citosólica de albúmina, ya presente en el medio de cultivo.

Esto es notable porque, en contraste con algunos informes anteriores en los que ambos tipos de células se juntaron casi al mismo tiempo6, observamos una mejora en la integridad y función del tejido del túbulo proximal incluso después de 10 días de cultivo. Como se observó mediante microscopía electrónica de transmisión transversal (TEM), los poros de 3 μm de ancho de la membrana PET eran los únicos canales posibles a través de los cuales estos dos tipos de células podían comunicarse (Fig. 3b complementaria). De hecho, una porosidad de ~5% fue suficiente para establecer suficiente contacto célula-célula. Además, el nivel de expresión de la proteína de unión estrecha RPTEC se ha incrementado claramente en el sistema bicapa (Fig. 5d) de manera similar a un informe anterior6, al igual que su frecuencia de aparición. Como resultado, todas las caracterizaciones y evaluaciones funcionales se centraron en D14 del cultivo de la capa epitelial, independientemente de la fuente celular. Tenga en cuenta que ZO-1 se expresó vívidamente en el tejido de cocultivo en D14, mientras que apareció débilmente en el sistema de una sola capa de RPTEC en la misma condición de cultivo. El sistema bicapa RPTEC/HUVEC se sometió a un grado de escrutinio similar al del tejido de cocultivo.

Estimamos los patrones de expresión espaciotemporal de ciertas proteínas específicas del túbulo proximal mediante la realización de extensas observaciones de inmunofluorescencia. Brevemente, las intensidades fluorescentes que representan los niveles de expresión de varios anticuerpos se cuantificaron mediante el análisis de pilas de imágenes confocales tomadas a través de las membranas cargadas de células. El procedimiento se ilustra utilizando imágenes fluorescentes transversales representativas de la bicapa RPTEC/HUVEC y los perfiles de intensidad correspondientes (Fig. 6a, b). Δd indica la distancia entre las posiciones del nivel máximo de expresión de cada anticuerpo y el nivel máximo de expresión de DAPI, como una medida del paradero de los núcleos. Al representar gráficamente los valores de Δd frente a los días de cultivo, pudimos rastrear la motilidad de las proteínas en la capa epitelial.

a Imagen confocal fluorescente de sección transversal seleccionada del sistema de bicapa RPTEC/HUVEC, inmunoteñida para megalina, que ilustra la definición de la distancia relativa de la proteína de interés (por ejemplo, megalina) medida desde el centro de los núcleos. Las barras de escala son de 10 μm. b Perfiles de intensidad z representativos de señales fluorescentes obtenidos promediando las intensidades de emisión de varios marcadores en un área de escaneo láser de 0,1 cm2 con un Δz (paso) de 200 nm. Distancia promedio del marcador específico del túbulo proximal al núcleo en RPTEC (bicapa) obtenida en condiciones de cultivo estáticas y perfundidas para (c) megalina, (d) LTL y (e) SGLT2; Se usaron N = 2 chips independientes para hacer n = 3 mediciones aleatorias de cada uno; Las barras de error indican la desviación estándar. Las diferencias estadísticamente significativas entre pares de datos se indican mediante asteriscos, *, **, ***, ****, para p ≤ 0,05, 0,01, 0,001 y 0,0001, respectivamente. Las imágenes TEM transversales seleccionadas resaltan la apariencia de la membrana apical de RPTEC en diversas condiciones de cultivo en D14/d4: (f) capa única bajo estática, (g) bicapa bajo estática y (h) capa única bajo condiciones de cultivo de perfusión. El TEM de primer plano de (i) revela una unión estrecha (punta de flecha amarilla) formada entre dos RPTEC adyacentes bajo cultivo de perfusión. j Un HUVEC en el lado opuesto de la membrana. Las barras de escala son de 2 μm. Todas las micrografías son de las células fijadas en D14/d4. M, mitocondrias; N, núcleo; V, vacuola; mem, membrana de PET, las flechas apuntan a uniones estrechas y las líneas discontinuas muestran los límites célula-célula. k Cuantificación de la longitud/densidad de microvellosidades y la altura de RPTEC. Definimos la densidad de vellosidades como el recuento de protuberancias dividido por la longitud de la periferia de la sección transversal de la membrana celular, medida a partir de instantáneas individuales. Los RPTEC/HUVEC están en D14/d4. Claramente, los RPTEC en la proximidad de los HUVEC desarrollaron microvellosidades apicales más densas, lo que resultó en un área de superficie más alta. Además, la distribución de densidad de microvellosidades es más estrecha en la configuración bicapa. No se observaron diferencias significativas en la longitud de las vellosidades entre los casos de una sola capa y bicapa en condiciones de cultivo estático. El esfuerzo cortante inducido por el flujo se manifestó no solo durante más tiempo sino también con una mayor densidad de microvellosidades. Con fines de cuantificación, de un total de N = 3 observaciones TEM independientes por condición, se seleccionaron aleatoriamente n = 9, 5 y 5 micrografías RPTEC de condiciones de cultivo de una sola capa (estática), bicapa (estática) y de una sola capa (flujo). , respectivamente, para medir la longitud y la densidad de las vellosidades. Para medir las alturas de las celdas, se examinaron n = 8 y n = 9 micrografías para condiciones estáticas y de flujo, respectivamente. Las barras de error representan la desviación estándar de los datos. l Distancias promedio de las proteínas basales y apicales desde el núcleo ilustradas para tejidos de cocultivo y solo RPTEC desarrollados en condiciones de cultivo de flujo. Datos obtenidos por perfiles de intensidad z de imágenes fluorescentes. Las estadísticas se derivan de manera similar a (c–e).

Para el caso de la megalina, cuanto más lejos de los núcleos aparece, mayor probabilidad de que se una a la membrana apical, es decir, que permanezca en un estado inactivo. Notamos que en el sistema bicapa, si las HUVEC se siembran primero, la megalina, que se expresa inicialmente en la membrana apical, se internaliza durante 7 días de cultivo RPTEC (Fig. 5a complementaria). Mientras que, cuando los RPTEC se siembran primero, se incorporarían por completo al medio intracelular en D14, lo que sugiere una actividad máxima de endocitosis (Fig. 6c y Fig. 5b complementaria) 40. Los datos presentados aquí y las imágenes fluorescentes de la Fig. 3e dejan claro que la perfusión no solo aumenta la actividad de megalina sino también su abundancia en el citosol. Tal mejora se refleja en una mayor tasa de reabsorción de albúmina. En línea con informes anteriores de aumento de la altura/compacidad celular bajo estrés de cizallamiento de fluidos 31, mediante el perfil de proteínas aquí encontramos que los marcadores apicales, LTL y SGLT2, parecen más distantes del núcleo (Fig. 6d, e).

La microscopía electrónica transversal de las células en la capa superior en el día 14 reveló los efectos distintivos de la tensión de cizallamiento y la proximidad con HUVEC también en el epitelio no iPSC (Fig. 6f-j). Los componentes de ECM autosecretados se difundieron a través de los poros de la membrana proporcionando una vía de comunicación con las HUVEC. Aunque las células eran escamosas en comparación con las estructuras tubulares 3D5,7, las uniones estrechas eran claramente discernibles. La observación de las uniones estrechas confirma la naturaleza impermeable de los epitelios de cocultivo RPTEC-solo y RPTEC/LTL+ y es esencial para validar nuestras evaluaciones de transporte transcelular. Las uniones estrechas en el tejido solo con RPTEC comenzaron a formarse en una etapa posterior a las del sistema de monocapa de cocultivo. También parece que se vuelven más estrechos bajo el cultivo de perfusión, aunque esto no se ha confirmado estadísticamente (Fig. 6 complementaria).

Independientemente de la fuente de células epiteliales, la densidad y la longitud de las vellosidades, así como la altura de las células, aumentaron bajo la influencia de la tensión de cizallamiento, asemejándose a la condición in vivo. Curiosamente, incluso en ausencia de estímulos mecánicos, aparecieron vellosidades más densas en RPTEC en contacto con HUVEC (Fig. 6k). Una población más grande y densa de vellosidades se manifiesta en una endocitosis y transcitosis más eficientes.

En D14, medimos las distancias relativas promedio de las proteínas basales (laminina y colágeno IV), subapical (ZO-1) y apical (Pgp) desde el núcleo en los sistemas de cocultivo y solo RPTEC de una sola capa (Fig. 6l). Dado que tanto la ECM como las proteínas apicales se expresan más lejos de los núcleos en el tejido cocultivado, se deduce que las células del túbulo proximal del tejido cocultivo crecieron en promedio. Sin duda, el tejido RPTEC tiene un grosor más uniforme a lo largo de la membrana y el grado colectivo de orientación y polarización celular es mayor (barras de error más pequeñas para Pgp y ZO-1). Observe también que ZO-1 se expresa claramente debajo de la Pgp apical en el tejido solo RPTEC. La cuantificación de las alturas de las celdas en función de las observaciones TEM de celdas individuales no condujo a los mismos resultados que los presentados en la Fig. 6l; sin embargo, la tendencia fue similar. Creemos que la discrepancia se origina en el proceso de creación de perfiles de intensidad z, donde las distancias relativas promedio medidas entre los marcadores apicales y basales se acortan porque la membrana de PET no es plana. Además, dado que las proteínas apicales no se expresan necesariamente justo en el pico de las células, medir las alturas de las células desde la membrana hasta el vértice celular daría como resultado valores mayores. Dicho esto, el efecto de la tensión de cizallamiento en la altura de las células fue más pronunciado en el cocultivo, es decir, un aumento del 37 % en el tejido RPTEC solo frente al 99 % en el cocultivo (alturas de las células en la Fig. 3g y la Fig. 6k).

El protocolo para la formación de la bicapa RPTEC/HUVEC se representa una vez más en la Fig. 7a. Para determinar si la presencia de HUVEC afectaría a los marcadores de la estructura y función del túbulo proximal, realizamos un análisis de qPCR. Además de las mejoras morfológicas observadas en la membrana apical de las microvillas, notamos que los niveles de ARNm de ciertos genes RPTEC aumentan bajo el estrés de cizallamiento inducido por el flujo y en presencia de HUVEC. Por un lado, AQP1, EpCAM, MDR1, OCT2 y posiblemente SGLT2 están regulados al alza en el sistema de bicapa maduro sujeto al flujo de perfusión, por otro lado, la proximidad de HUVEC bajo perfusión de medios ha provocado que los niveles de expresión de AQP1, EpCAM, MDR1 y OCT2 para aumentar (Fig. 7b).

a El protocolo genérico para la cuantificación de la reabsorción y excreción renal mediante el PToC. Las mediciones comienzan el día 14, independientemente del ensayo en cuestión y de la configuración de la capa de tejido. Los medios en los microcanales epiteliales y vasculares circulan para mejorar la difusión de sustratos de moléculas grandes (p. ej., BSA-AF488). Las tasas de transferencia (reabsorción de albúmina/glucosa o permeabilidad aparente a Rh123) se estimaron realizando una regresión lineal en los datos del transcurso del tiempo. b Niveles de expresión relativos (frente a ACTB) de genes estructurales, CDH6 (K-cadherina) y EpCAM, y genes funcionales, a saber, ABCB1 (MDR1), AQP1, SLC22A2 (OCT2), SLC5A2 (SGLT2), frente al nivel de Gen ACTB en los sistemas RPTEC-only y RPTEC/HUVEC. Se presentan cuatro grupos, a saber, (i), RPTEC en D14 en las placas de cultivo; (ii), RPTEC de la bicapa en condiciones de cultivo estático; (iii), RPTEC de la bicapa en condiciones de cultivo perfundido; (iv) RPTEC de una sola capa en medios perfundidos. La proximidad con HUVEC bajo perfusión de medios ha aumentado los niveles de expresión de AQP1, EpCAM, MDR1, OCT2 y SGLT2 (comparar los grupos iii y iv). Independientemente, la perfusión ha aumentado los niveles de expresión de los mismos genes (con la posible excepción de SGLT2) en el cocultivo (comparar los grupos ii y iii). Se analizaron n = 5 réplicas de PCR para cada gen/muestra obtenida de un conjunto de experimentos. c Tasas de transferencia de la sonda de glucosa, 2NBDG medidas en condiciones de cultivo estáticas y perfundidas. Se cuantificaron tanto la reabsorción (a → b) como las tasas de transferencia inversa (b → a). También se examinó el efecto inhibitorio de la florizina (P.) sobre el transporte de glucosa; n = 3 fichas independientes. d Permeabilidades aparentes a Rh123 en ambas direcciones de excreción (b → a) e inversa (a → b). Se aplicó verapamilo (V.), un competidor para la extrusión de Rh123, para atenuar la salida de Rh123 y confirmar la función de Pgp; N = 3 fichas independientes. e Imágenes fluorescentes confocales apiladas en z de la capa de tejido RPTEC en configuraciones bicapa y capa única. Se precipitó una cantidad considerablemente mayor de BSA en el medio basolateral de RPTEC en el sistema bicapa, lo que indica una mayor ingesta del sustrato. Algo de BSA se precipita en la RPTEC de una sola capa en D17 (punta de flecha blanca). La barra de escala es de 50 μm. f Tasas de transporte de albúmina sérica bovina conjugada con AF488 (BSA-AF488) en ambas direcciones. En este estudio, examinamos el efecto de reducir la temperatura de incubación (a 4 °C) sobre el transporte selectivo de BSA-AF488; mínimo N = 6 chips independientes. En (b – d, f) se ejecutó la prueba t de dos muestras entre pares de conjuntos de datos como se indica. Las barras de error representan la desviación estándar; ND, no detectado; N/A, no disponible; NS, no significativo; *, **, ***, ****, para p ≤ 0,05, 0,01, 0,001 y 0,0001, respectivamente. a → b, apical a basal; b → a, basal a apical.

Por lo tanto, esperábamos que el epitelio llevado a la proximidad de las HUVEC pudiera exhibir no solo una estructura más densa sino también tasas más altas de eliminación de xenobióticos y absorción de glucosa. Estas suposiciones se confirmaron mediante evaluaciones detalladas de la reabsorción de glucosa y las tasas de excreción de Rh123, lo que indica que el nivel de proteínas correspondientes a SGLT2 y MDR1 (SGLT2 y Pgp) también mejoró (Fig. 7c, d). Las tasas de reabsorción de glucosa a → b mejoraron significativamente en presencia de HUVEC y bajo flujo de perfusión, de forma independiente, mientras que las tasas b → a casi no se modificaron. Además, la florizina, como inhibidor competitivo clásico de SGLT1 y SGLT241,42,43, bloqueó eficazmente la reabsorción de glucosa.

Aunque LRP2 no se detectó de manera estable, la presencia y la función adecuada de megalina se confirmaron en RPTEC mediante el análisis de las tasas de reabsorción de albúmina. Mostramos que la capacidad de absorción de albúmina de los RPTEC aumenta considerablemente en presencia de HUVEC. Esto se evidencia por la acumulación de BSA en el lado basolateral de RPTEC en el sistema bicapa (Fig. 7e). Además, la bicapa mostró una mayor tasa de transcitosis de albúmina a → b (Fig. 7f). La reducción de la temperatura durante las mediciones parece haber reducido considerablemente las tasas de reabsorción, como se investigó anteriormente44,45.

Estos resultados son interesantes, particularmente porque las tasas de reabsorción y excreción aumentan aunque, intuitivamente, la capa endotelial puede dificultar la transferencia de cualquier biomolécula a través de los canales. La señalización paracrina entre los dos tipos de células ha mejorado la función de megalina, SGLT2 y Pgp hasta el punto de que la glucosa, la albúmina y Rh123 se transfieren a velocidades considerablemente más altas a través del tejido bicapa. Además, las microvellosidades apicales se han vuelto más densas en los RPTEC cocultivados con HUVEC incluso en ausencia de estímulos mecánicos (Fig. 5k). Obsérvese que en el sistema bicapa RPTEC/HUVEC no hubo una mejora tangible en la tasa de salida global de Rh123, mientras que las tasas de reabsorción de glucosa y albúmina aumentaron. Por último, evaluamos la capacidad del transportador xenobiótico basolateral, OCT2, en los sistemas monocapa y bicapa. OCT2 es responsable de la captación de fármacos quimioterapéuticos como el oxaliplatino y el cisplatino que se sabe que causan daño renal inducido por fármacos46. Usando cimetidina como inhibidor de OCT2, mostramos una captación selectiva de EtBr fluorescente catiónico y una captación vectorial de 4-Di-1-ASP (ASP+), ambos conocidos como sustratos de OCT2 (Fig. 7 complementaria). Sin embargo, a diferencia de los ensayos de filtración de albúmina, glucosa y Rh123, donde las HUVEC demostraron mejorar las tasas de transporte en la bicapa, la capa única de RPTEC fue más eficiente en la absorción de ASP+ ya que las HUVEC bloquearon el sustrato.

Presentamos la ingeniería de un tejido de túbulo proximal 2D mediante la combinación de células extraídas de organoides renales derivados de hiPSC (LTL+) con células RTPEC/TERT1 humanas diferenciadas. La capa de tejido artificial mostró una mayor capacidad de filtración/reabsorción en comparación con su contraparte no basada en iPSC. Además, los niveles de expresión de ARNm de ciertos genes específicos del túbulo proximal se amplificaron en el cocultivo, lo que significa mayores grados de madurez y función. Nuestro epitelio diseñado, compuesto por células inmortalizadas y derivadas de organoides renales perfectamente fusionadas, podría mantener de manera estable su conformidad al menos hasta el día 14.

Como se describe en el protocolo, durante la diferenciación del mesodermo intermedio, la proporción de mesénquima metanéfrico a los progenitores del epitelio ureteral se puede ajustar eligiendo el día del cambio de CHIR a FGF919. Una fecha de cambio posterior producirá más del primero, lo que dará lugar al mesénquima del casquete y dará lugar a más nefronas. Dado que simplemente estamos interesados ​​en recolectar células similares a túbulos proximales, elegimos la fecha posterior del cambio (día 5). El aumento sustancial en el nivel de expresión de K-cadherina observado después del cultivo 2D, informado anteriormente, se puede atribuir a la mayor tasa de proliferación de células con CDH6 alto y LTL bajo, conocidas por servir como progenitores del túbulo proximal, en comparación con las células más CDH6-baja madura, LTL-alta población diferenciada47.

Paralelamente, revisamos la literatura sobre modelos de túbulos proximales 2D examinando y destacando los efectos de las células endoteliales y la tensión de cizallamiento inducida por el flujo en las características y el rendimiento de las capas epiteliales maduras de túbulos proximales inhibidas por contacto desarrolladas en membranas de PET. Se estableció que las HUVEC mejoran significativamente la intensidad y la frecuencia de aparición de las uniones estrechas, los niveles de ARNm de AQP1, EpCAM, OCT2, MDR1 y SGLT2, y las tasas de transporte vectorial de los respectivos sustratos, glucosa y Rh123. Las tablas complementarias 2 y 3 resumen las mejoras en las tasas de captación de glucosa y las proporciones de salida de Rh123 en los sistemas de bicapa y cocultivo en el caso de solo RPTEC. A diferencia de las células LTL+, LRP2 no se detectó (o simplemente se encontró en cantidades minúsculas) en RPTEC, lo que confirma los estudios anteriores15. Sin embargo, se expresó abundantemente megalina, cuya cantidad podría ser modulada por el flujo de perfusión. También demostramos y medimos las tasas de transporte de albúmina. Aunque las tasas obtenidas aquí son mucho menores que en los casos in vivo, es evidente que la mayor parte de la transferencia de masa se ve obstaculizada por la membrana.

Hasta donde sabemos, ningún estudio previo ha incorporado células del túbulo proximal derivadas de organoides renales basados ​​en hiPSC, de forma independiente. Tampoco nadie ha intentado construir un tejido funcional 2D cocultivando células epiteliales derivadas de organoides renales hiPSC con líneas celulares inmortalizadas. Otros han generado y caracterizado células similares a túbulos proximales mediante la diferenciación dirigida de iPSC, primero generando células del mesodermo intermedio (IM) y luego conduciendo las células IM hacia las células renales15. Su protocolo de diferenciación generó un grupo de células que se asemejan a las primeras etapas del desarrollo renal y se mantuvieron estables hasta por 7 días. Se detectaron marcadores típicos como CDH6 y LRP2 que expresaban niveles de ARNm con un patrón similar explorado aquí, mientras que no había rastros de ABCB1. Por el contrario, detectamos el gen a un nivel bajo en nuestras células LTL+. Si bien no se observaron diferencias importantes en el nivel de expresión de ABCB1 entre RPTEC y tejidos de cocultivo, el nivel de proteína y la actividad mejoraron significativamente en el cocultivo. Por lo tanto, estamos de acuerdo y confirmamos la noción de que la actividad/proteína Pgp no sigue necesariamente sus niveles de expresión génica. En este trabajo anterior, aunque la función de Pgp se demostró cualitativamente al mostrar la acumulación de calceína-AM en presencia de un inhibidor de Pgp competitivo, la ciclosporina A (CsA), los datos de transporte cuantitativo, como las tasas de eflujo, no se probaron.

Creemos que nuestro sistema de cocultivo ofrece algunas ventajas sobre los modelos existentes del epitelio del túbulo proximal. Por ejemplo, permite el modelado de enfermedades específicas del paciente, la detección de fármacos y el estudio de la patogenia mediante la incorporación de iPSC pertinentes derivadas del paciente para formar los organoides. A continuación, estos organoides pueden someterse al mismo procedimiento descrito aquí para obtener las células enfermas que pueden cocultivarse con líneas celulares para formar finalmente un tejido homogéneo con fines de análisis y tratamiento. Además, el concepto de mezclar células obtenidas de organoides derivados de iPSC con células inmortalizadas para facilitar o acelerar la secreción de ECM y formar un tejido funcional 2D puede ofrecer aplicaciones ubicuas en la ingeniería de tejidos.

Durante los experimentos de clasificación de células, nos dimos cuenta de que modificaciones menores en el protocolo pueden optimizar la eficiencia de la recolección de la fracción positiva en particular. La variabilidad en la cantidad de células vivas disociadas de múltiples organoides afectó notablemente la tasa de éxito de MACS, pero esto podría abordarse ajustando la concentración de anticuerpos. El hecho de que el tejido basado en semi-iPSC forme una barrera epitelial más rápidamente que el competidor se demostró a través de nuestra sólida técnica de medición TEER de cuatro sondas. Nuestra elección de protocolo para generar organoides renales no fue fortuita. En el momento en que promovimos el concepto de extraer células derivadas de iPSC de organoides renales, el protocolo presentado por Takasato et al.19 generó los organoides renales derivados de hiPSC más complejos. Avances posteriores en el campo demostraron organoides renales con estructuras de nefrona posiblemente más intrincadas14.

Aunque la membrana de PET impide considerablemente el transporte a través de la bicapa, pudimos cuantificar las tasas de transporte en diversas condiciones y demostrar el transporte vectorial de albúmina, glucosa y Rh123 con la capacidad de modular cada uno de ellos mediante inhibidores clásicos relevantes. Una diafonía suficiente del epitelio-endotelio a través de la membrana condujo a una mejor integridad del tejido (uniones estrechas), microvellosidades apicales más densas y niveles de expresión génica, en particular los de los transportadores, MDR1, OCT2 y SGLT2.

La diferencia clave entre nuestro método y los protocolos anteriores6,7 es nuestra estrategia para formar/investigar una capa de túbulo proximal epitelial ya madura (contacto inhibido) antes de introducir células endoteliales en la ecuación. Además, nos abstuvimos de aplicar cualquier recubrimiento de ECM adicional (artificial) a la membrana que permitiera a las células secretar su propia ECM. La construcción de tejido se diseñó deliberadamente para tener una forma plana para facilitar la caracterización del cocultivo y el análisis cuantitativo de las tasas de reabsorción/filtración relevantes en un chip de microfluidos.

Los chips se componen de dos losas de PDMS idénticas y una membrana de PET porosa intercalada en el medio (Fig. 3a complementaria). Se cortaron membranas de PET que tenían un tamaño de poro y una porosidad de 3,0 µm y 5 %, respectivamente, de soportes permeables Falcon (Corning 353091). Las losas se moldearon por réplica en ¼ de obleas de Si(100) de 4" que llevaban patrones de canales de microfluidos en relieve formados mediante fotolitografía SU-8 estándar. Brevemente, se vertió una mezcla 10:1 de PDMS (Sylgard 184, Toray Dow Corning) y agente de curado en los moldes colocados en placas de Petri. Después de curar y separar las losas de los moldes, examinamos dos métodos para montar y unir la membrana. En el primer enfoque, se hizo girar una capa muy delgada de PDMS sin curar en la losa inferior para que sirviera como un capa de adhesión sobre la que se colocó la membrana. A continuación, se colocó la losa superior sobre la membrana y se alineó cuidadosamente al microscopio para que los canales microfluídicos, separados por la membrana, se superpusieran por completo. El chip finalmente se curó en un horno a 65 °C. durante 1 h. De esta manera, las losas se podían alinear con facilidad y precisión antes del paso de curado; sin embargo, la membrana se deformaba a alta temperatura de curado. Además, parte del PDMS sin curar se difundió en los canales reduciendo el área disponible del Membrana para cultivo celular. Los dispositivos fabricados de esta manera se utilizaron para experimentos de validación preliminares, incluido el cultivo celular y la inmunotinción. En el segundo método, no se aplicó ninguna capa de adhesión. Brevemente, la membrana y la losa inferior con el lado de los microcanales hacia arriba se trataron con plasma de O2 (Covance-1MP, Femto Science Inc.) durante 1 min para volver hidrofílicas las superficies. A continuación, la membrana se colocó en la losa inferior. A continuación, la losa superior junto con la losa inferior que soporta la membrana se expusieron a plasma de O2 durante 1 min. Las losas se juntaron inmediatamente y se unieron bajo el microscopio. De esta manera, hubo una oportunidad única de alinear los microcanales bajo el microscopio, ya que las losas de PDMS oxidadas se unirían fuertemente entre sí después de estar en contacto. Sin embargo, debido a que todo el proceso se realizó a temperatura ambiente, la membrana quedó perfectamente plana. Después de la unión, se perforaron orificios de 2 mm de ancho a través de las losas en ambos extremos de los microcanales. En general, no notamos ninguna desviación importante en los resultados medidos que pudiera atribuirse a la ligera curvatura de la membrana oa la reducción de su área aparente. Sin embargo, en la cuantificación de las tasas de transporte se utilizaron dispositivos fabricados a temperatura ambiente.

Las hiPSC se pasaron tres veces antes de la siembra para la diferenciación. Después de descongelar, los tres pases se realizaron en placas de 6 pocillos. Las placas se recubrieron primero con iMatrix-511 (0,5 mg mL–1, Nippi, 892011/892012) a 3 μg mL–1 preparado en 1 mL de DPBS por pocillo (1/6). Las placas se incubaron a 37 °C durante 1 h, luego se llenaron con 0,75 ml (por pocillo) de StemFit (Ajinomoto, AK02N) que contenía 10 μM de inhibidor de ROCK (Y27632, 10 mM, Wako, 253-00511) y se incubaron nuevamente. Los crioviales que contenían 106 células ml–1 de hiPSC sin marcar (fibroblastos CRL1502-C32 femeninos derivados de fibroblastos fetales ATCC CRL-150248) o hiPSC marcados (H2B-GFP-integrated 1502.3) congelados en 200 µL de Stem Cell Banker se descongelaron rápidamente en un recipiente de 37 ºC al baño maría. Las células se transfirieron cuidadosamente a tubos Eppendorf de 5 ml que contenían 5 ml de StemFit utilizando puntas de pipeta de 1 ml de calibre ancho. El tubo se centrifugó a 200 G durante 5 min. Después de aspirar el sobrenadante, las células se resuspendieron en 100 μL de StemFit y se contaron. Se preparó una suspensión de células de 1,5 ml en StemFit para cada pocillo de forma que contuviera 104 células y se añadió a las placas de pocillos recubiertas con iMatrix. Después de la siembra, las placas se mantuvieron a temperatura ambiente durante 5 min para mantener una cobertura homogénea en todo el pocillo y luego se incubaron a 37 °C. Entre pases y antes de la disociación, las células se lavaron con DPBS (1 ml por pocillo) dos veces, se remojaron en TrypLE (Fisher, 12563-029) 0,3 ml, se incubaron durante 5 min, se agitaron golpeándolas una vez y se incubaron de nuevo durante 3 mín. Las células se recogieron de cada pocillo en tubos de 5 ml mediante la adición de 1 ml de StemFit y se volvieron a sembrar en placas de pocillos recubiertas con iMatrix a razón de 104 células por pocillo como se describe anteriormente. Después de tres pases, las células se disociaron y se cultivaron el día -1. La diferenciación se inició el día 0 como se describe en la ref. 19. En resumen, la línea primitiva posterior se indujo mediante la activación de la proteína morfogenética ósea (BMP) y la señalización canónica de WNT mediante el inhibidor de la glucógeno sintasa quinasa (GSK-3), CHIR99021, en APEL. CHIR se cambió a FGF9 el día 5 para inducir el mesodermo intermedio. El día 7, se inició la autoorganización 3D mediante el cultivo de agregados en filtros Transwell. Los factores de crecimiento se retiraron el día 12.

Células RPTEC/TERT1 inmortalizadas crioconservadas (ATCC® CRL-4031™) sembradas en 106 células/vial con un número de pases inferior a 9 se descongelaron y se subcultivaron en matraces de cultivo de células T25 hasta que alcanzaron una confluencia de ~90 %. Durante el período de subcultivo que duró 5 días, se usó DMEM/F12 (Gibco 11320033) complementado con el kit de crecimiento RPTEC inmortalizado hTERT (ATCC® ACS4007™) como medio de cultivo según las instrucciones del fabricante. Las células se tripsinizaron y se resuspendieron a 4 × 106 células/mL en REGM™ (Lonza CC-3190). Los microcanales del chip y los depósitos se esterilizaron con etanol al 70 %, se secaron en un banco limpio y se expusieron a la luz ultravioleta durante 1 hora. Antes de la siembra, la membrana se recubrió con un agente de adhesión celular, FNC Coating Mix® (Athena 0407), y se incubó a 37 °C durante 1 min para mejorar la tasa de adhesión celular. Después de llenar el canal inferior de cada dispositivo con 200 μL de REGM, se inyectaron suavemente 30 μL de la suspensión celular en el canal superior. Los dispositivos se incubaron a 37 °C, en CO2 al 5 % durante 1 h hasta que los RPTEC se asentaron por completo y se adhirieron a la membrana, después de lo cual se agregaron 170 μL de REGM al canal superior. Los dispositivos se mantuvieron en la incubadora y se monitorearon mientras los medios en ambos canales se actualizaban diariamente.

En chips designados para llevar la bicapa, se cultivaron RFP-HUVEC en el lado opuesto de la membrana el día 10. Brevemente, las HUVEC marcadas con RFP (Angio-Proteomie Co. cAP-0001RFP) se almacenaron en 5 × 105 células/vial con número de pase menos de 4 se subcultivaron en EGM2™ (Lonza CC-3162) de manera similar a los RPTEC. Tras la confluencia (∼90 %), las células se resuspendieron a 4 x 106 células/ml en EGM2. Después de aspirar REGM, se inyectaron suavemente 30 μL de la suspensión HUVEC en el canal inferior de cada dispositivo. Los dispositivos se voltearon inmediatamente y se incubaron durante 2 h hasta que las células endoteliales se adhirieron correctamente. Luego, los dispositivos se voltearon hacia atrás y se agregaron 170 μL de EGM2 al canal inferior. A partir de entonces, REGM y EGM2 fueron reemplazados todos los días.

Diseñamos una configuración de sistema de cultivo de perfusión personalizada para operar a 37 °C, 5 % de CO2 y capaz de manejar seis dispositivos simultáneamente. A partir del día 11/día 1 del cultivo RPTEC/HUVEC, REGM y EGM2 de frascos de vidrio esterilizados que contenían 3 mL de cada uno se perfundieron a 10 μL min–1 o 1 μL min–1 a través de los microcanales correspondientes para imitar las condiciones de cultivo en medios estáticos y fluidos, respectivamente. A una velocidad de flujo de Q = 10 μL min–1, el esfuerzo cortante ejercido sobre la membrana apical de las células epiteliales, τ, se estimó en 0,06 dyn cm−2 utilizando

donde η = 0,7 es la viscosidad media aproximada a 37 °C, y h = 0,35 mm y W = 1,0 mm son la altura y el ancho del canal, respectivamente. Todo el medio de los frascos se reemplazó cada dos días.

Las células a ambos lados de la membrana se fijaron mediante la aplicación de paraformaldehído al 4 % en DPBS (1X) (Gibco®) en ambos canales durante 10 min, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1 % durante 10 min a menos que se indique lo contrario y luego se sumergieron en tampón de bloqueo de suero de burro al 10% durante 1 h, todo a temperatura ambiente. Se aplicaron mezclas de anticuerpos primarios preparados en el tampón de bloqueo en ambos microcanales y las muestras se dejaron a 4 °C durante la noche. Al día siguiente, las membranas se enjuagaron a fondo con DPBS tres veces durante 30 minutos cada una, luego se sumergieron en la mezcla de anticuerpos secundarios, preparada en DPBS, durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego, las membranas se trataron con DAPI durante 10 minutos, seguido de un montaje antidecoloración (Fisher, S36937) y se montaron en portaobjetos de microscopio. La microscopía de fluorescencia confocal se realizó con un microscopio Olympus FV3000. Las imágenes se analizaron con el software de visualización FV31S-SW (v2.5.1.228, Olympus) e Image J (v1.53f51, NIH, EE. UU.). La Tabla complementaria 4 enumera las concentraciones de anticuerpos utilizados.

Las membranas cargadas de células en los chips se enjuagaron primero con DPBS, se fijaron durante la noche a 4 °C con un tampón que consistía en glutaraldehído al 2 % (grado EM, Electron Microscopy Science) y NaPO4 0,1 M en agua y, posteriormente, se fijaron posteriormente en OsO4 al 2 %. (Crystal, Heraeus Chemicals, Sudáfrica) durante 3 h en un baño de hielo. Los chips fueron subcontratados para microscopía. Al llegar a las instalaciones, los especímenes se deshidrataron en etanol graduado (50, 70, 90, 100, 100 y 100 %, cada uno durante 15 min) y se incluyeron en resinas epoxi. Se cortaron secciones ultrafinas de 80 nm mediante la técnica de ultramicrótomo. Secciones ultrafinas teñidas con acetato de uranilo durante 10 min y solución de tinción de plomo durante 5 min se analizaron en un HITACHI H-7600 a 100 KV.

El ARNm total se extrajo y purificó a partir de 3 muestras individuales por condición utilizando el kit de aislamiento de ARN (NucleoSpin® RNA). Utilizamos una cantidad máxima de 3 μg/60 μL de ARNm para la transcripción inversa con el kit PrimeScript™ RT Master Mix según las instrucciones del fabricante. Las muestras de ADNc molde se diluyeron (1:10) en TaqMan® Universal PCR Master Mix y TaqMan® Gene Expression Assay cebadores directos e inversos por gen de interés y se distribuyeron en 5 pocillos de una placa de reacción de 384 pocillos múltiples. La RT-PCR cuantitativa se realizó con el sistema de detección de PCR en tiempo real QuantStudio® 5 (ThermoFisher Scientific). Se usó β-actina como gen endógeno. Los datos del cebador se enumeran en la Tabla complementaria 5.

Se prepararon 30 organoides de riñón (KO) siguiendo el protocolo de Takasato et al. (2016). Los organoides se recolectaron en D22 de inducción y se disociaron usando las enzimas provistas en el Tumor Dissociation Kit (Miltenyi Biotec, #130-095-929) según las instrucciones del fabricante. Las enzimas triples, H, R y A, tal como se prepararon, se disolvieron en un tampón de separación a concentraciones de 4, 2 y 0,5% (v/v), respectivamente. El tampón de separación estaba compuesto por DPBS, EDTA (Fisher, 15575020) a 2 mM y FBS al 0,5 % (v/v). Las células disociadas se suspendieron en el mismo tampón durante los procesos de separación y clasificación hasta la etapa de siembra. La clasificación se realizó con un clasificador de células BD FACSAria™ III y las células clasificadas se resuspendieron en REGM que contenía 10 μM de inhibidor de ROCK (Fuji Film, CultureSure® Y-27632) para siembra o aislamiento de ARNm. Consulte las figuras complementarias 1, 2 para obtener más detalles.

Para cada experimento se prepararon 16 KO. Los organoides se recolectaron entre D22-26 de inducción, se disociaron de manera similar a FACS, se suspendieron en el tampón de separación y se conservaron en hielo durante todo el proceso antes de la clasificación. Las muestras se centrifugaron brevemente, se resuspendieron y se dividieron en dos porciones iguales (8 KO por porción). Cada porción se pasó a través de un tamiz pluriStrainer® de 10 µm (pluriSelect, #43-50010-03) para eliminar cualquier grupo de células restante. Las porciones tamizadas se volvieron a mezclar, se centrifugaron, se resuspendieron en tampón de separación y se contaron. Se aplicó a la suspensión lectina de tetragonolobus de loto biotinilada (LTL), un marcador robusto del borde en cepillo del túbulo proximal, en una proporción de 1:100 como anticuerpo primario. Después de incubar durante 30 min a 4 °C, la muestra se centrifugó y se resuspendió dos veces para eliminar por completo cualquier anticuerpo no adherido. Se aplicaron microesferas antibiotina monoclonales (Miltenyi Biotec, #130-105-637) en una proporción de 1:5 para el marcaje magnético indirecto. Luego, la suspensión se incubó a 4 °C durante 30 min, se centrifugó y se resuspendió en tampón de separación (500 μL). La suspensión se aplicó suavemente a una columna MS (Miltenyi Biotec, #130-042-201) conectada a una de las ocho ranuras de un separador OctoMACS (Miltenyi Biotec, #130-042-108). Antes de aplicar la suspensión, se colocó un filtro de separación previa de 30 µm (Miltenyi Biotec, n.° 130-041-407) en la columna para eliminar los grumos que de otro modo obstruirían los poros y se humedeció toda la columna con 500 µL de DPBS. Después de aplicar la suspensión, la columna se enjuagó con 500 µl de tampón de separación dos veces para agotar completamente la fracción negativa (LTL–) (volumen total 1,5 ml). Para recolectar la fracción positiva (LTL+), la columna se retiró del separador, se colocó en un tubo de recolección y se enjuagó inmediatamente con 1 ml de tampón de separación. La tasa de éxito de MACS se refiere a la suma del producto MACS final (células LTL+ y LTL–) dividida por el número total de células vivas filtradas (< 10 μm) que se sometieron al marcador LTL, microesferas y posteriormente se aplicaron a las columnas de separación. Evidentemente, el 50% de las células se perdieron durante el marcaje con anticuerpos. Durante el curso de los experimentos de optimización, establecimos que al disminuir la concentración de anticuerpos LTL en la suspensión celular de 1:50 a 1:100, la especificidad aumentaría en un 7 %. Los gráficos de la Fig. 1c muestran las poblaciones relativas de productos MACS finales en función de la concentración de anticuerpos LTL. La Tabla complementaria 1 muestra las estadísticas del proceso MACS. Los datos se recopilan de siete experimentos consecutivos. Finalmente, ambas fracciones se resuspendieron en REGM que contenía 10 μM de inhibidor de ROCK para siembra o aislamiento de ARNm.

Se prepararon alícuotas de pequeño volumen de BSA conjugado con AF488 (ThermoFisher, A13100) a 5 mg mL–1 y se almacenaron a -30 °C hasta su uso. Con nuestro sistema de perfusión casero, independientemente de la configuración del tejido (capa única o bicapa), circulamos 3 ml de REGM que contenían 50 μg mL–1 de BSA conjugado con AF488 (ThermoFisher, A13100) y EGM2 prístino a través de los canales superior e inferior, respectivamente. . Los medios se perfundieron y circularon durante 24 h. Se recolectaron muestras de 10 μL del depósito que contiene EGM2 que alimenta el canal inferior a intervalos de 6 h. Las concentraciones de difusión en EGM2 se midieron inmediatamente utilizando un espectrofotómetro (NanoDrop™ 3300). Se asumió que la eliminación de volúmenes de 10 μL 4 veces de una fuente de 3 mL no altera el equilibrio de difusión. Establecimos que la circulación de los medios en los canales de concentrado y diluido es necesaria para mantener un gradiente de concentración de albúmina suficiente. Debido a su alto peso molecular (66 kDa), solo una cantidad minúscula de BSA podría difundirse en el caso estático (Tabla complementaria 6). La transferencia inversa basal a apical se cuantificó de manera similar, pero en su lugar, el BSA conjugado con AF488 se disolvió en EGM2 que alimentaba el canal inferior y se midió en REGM prístino en la parte superior. Para evaluar el efecto inhibidor de la reducción de la temperatura sobre la reabsorción de albúmina, la instalación se colocó en una habitación oscura a 4 °C en lugar de la incubadora.

Las soluciones madre de 2-NBD-Glucosa, sonda de captación de glucosa fluorescente (2-NBDG, Abcam, ab1462002) se prepararon a 30 mM y se almacenaron a –30 °C para su uso posterior. Después de enjuagar los medios, se aplicaron 200 μL de DPBS+ (Gibco, 14040133) a los canales superior e inferior y luego los dispositivos se sumergieron a 37 °C durante 30 min. La medición de la reabsorción de glucosa comenzó reemplazando 100 μL de DPBS+ en el canal superior con el mismo volumen de solución de 2-NBDG 1 mM para lograr una concentración final de 0,5 mM. A intervalos de 1 h, el material difuso en el canal inferior se mezcló suavemente, pero a fondo, mediante la circulación manual (pipeteado) de un volumen de 100 μL dos veces. La misma cantidad fue muestreada y almacenada en tubos Eppendorf oscuros. El tampón agotado se repuso inmediatamente añadiendo 100 μL de DPBS+ fresco. NanoDrop™ 3300 midió las concentraciones de las muestras entre los intervalos de muestreo. Calculamos la concentración de glucosa en el transcurso del tiempo a partir de la concentración de las muestras tomadas en cada intervalo al reflejar la cantidad eliminada, usando la siguiente ecuación:

donde Ct y Ct–1 representan las concentraciones reales de 2-NDBG en el canal en los momentos de muestreo actuales y anteriores, respectivamente, y Rt y Rt–1 son las concentraciones de muestra correspondientes, todas en nmol min–1. Los volúmenes de 200 μL y 100 μL se refieren al volumen total del canal y del muestreo, respectivamente. Las tasas se obtuvieron mediante la realización de una regresión lineal en los datos de concentración del curso del tiempo durante 0 ≤ t ≤ 3 h. La inhibición de SGLT se evaluó mediante la administración de floridzina. Se prepararon alícuotas de floridzina (P3449, Sigma) en etanol al 70 % a 100 mM y se almacenaron a –30 °C para su uso posterior. El fármaco se aplicó a una concentración de 1000 μM (dilución 100x). La exocitosis vectorial de glucosa se examinó cuantificando las velocidades de transferencia de masa en la dirección inversa, es decir, de basal a apical. En este caso, se aplicó 2-NBDG al canal inferior y se midió en la parte superior.

Examinamos el rendimiento de la bomba de salida de Pgp midiendo la tasa de transferencia de Rh123 (Fisher, R302) aplicada a 2,5 μM. Para inhibir la salida de Rh123, agregamos verapamilo como un contendiente de Rh123 a 300 μM. Después de retirar y enjuagar los medios de cultivo, los canales superior e inferior se llenaron con 200 μl de HBSS pH 6 y HBSS pH 7,4, respectivamente. Los dispositivos se preincubaron a 37 °C durante 30 min. El muestreo se llevó a cabo de manera similar al procedimiento de medición de la reabsorción de glucosa. Sin embargo, dado que se deseaba la tasa de eflujo (basal a apical), el sustrato se aplicó principalmente al canal inferior y se midió en la parte superior. Brevemente, para mantener una concentración de origen de 2,5 μM, se reemplazaron 100 μL del tampón del canal inferior con una solución 5 μM de Rh123 preparada en HBSS pH 7,4, con o sin verapamilo. Se recogieron muestras de 100 μl del canal superior a intervalos y se transfirieron a pocillos individuales de una placa de 96 pocillos de fondo negro (Corning, CLS3925). Cada pocillo se rellenó previamente con HBSS para lograr un volumen de trabajo de 200 μL, según lo sugerido por el fabricante del lector de microplacas. El canal superior se completó con 100 μL de HBSS pH 6 inmediatamente después del muestreo. Antes del muestreo, se llenó una sola fila de la placa de 96 pocillos con soluciones de Rh123 de concentraciones conocidas para obtener datos de calibración. La emisión de fluorescencia de las muestras se midió con un lector de microplacas (Molecular Devices, SpectraMax® iD5). Para cuantificar las tasas de transferencia en la dirección inversa, se disolvió Rh123 (con o sin verapamilo) en HPSS pH 6 y se administró desde el canal superior.

Los datos de calibración de todos los sustratos fluorescentes se presentan en la Tabla complementaria 7.

Para los experimentos de absorción de bromuro de etidio (EtBr), las muestras de control consistían únicamente en monocapas HUVEC cultivadas en la capa superior. De manera similar al ensayo Rh123, todas las muestras se preincubaron en tampones HBSS ácidos y neutros. Como sondas fluorescentes catiónicas, introdujimos 2,5 μM de EtBr en el canal inferior (lado basal para RPTEC) o 2,5 μM de 4-Di-1-ASP (ASP+) en el lado apical y basal, por separado. Después de la introducción de las sondas, los dispositivos se incubaron durante 4 h. A continuación, se tomaron imágenes de las monocapas RPTEC y HUVEC utilizando un microscopio fluorescente invertido a intervalos de 60 min y 30 min para los experimentos con EtBr y ASP+, respectivamente. Al mismo tiempo, administramos 1 mM de cimetidina como inhibidor de OCT2 para verificar la captación dependiente del transportador de EtBr y ASP+. Las intensidades de fluorescencia relativas de las muestras se calcularon a partir de instantáneas individuales utilizando el software Image J y se normalizaron a las del RPTEC sin inhibidor.

Las mediciones se llevaron a cabo en chips de microfluidos utilizando una configuración de cuatro sondas personalizada28. Brevemente, la mezcla de células RPTEC o RPTEC/LTL+ se cultivó en la capa superior de la membrana como se describió anteriormente. La impedancia de las membranas cargadas de células se midió usando un medidor LCR (ZM2731, NF Co.) con estímulo sinusoidal en un rango de frecuencia de 100 Hz a 10 kHz bajo un voltaje de pico a pico de 20 mV. La impedancia de referencia se registró antes de la siembra, con ambos canales llenos de REGM. Los valores TEER se obtuvieron restando la resistencia de referencia de las resistencias medidas. Todas las mediciones se realizaron en una incubadora a 37 °C, 5 % de CO2. La técnica de las cuatro sondas nos permite eliminar las resistencias en serie del medio de cultivo y la doble capa eléctrica en la superficie de los electrodos. Aplicamos un filtro de paso bajo de transformada rápida de Fourier (FFT) para suavizar las curvas TEER con una frecuencia de corte de

con puntos de valor de ventana de n = 6, e intervalo de tiempo de Δt = 0,5 días.

En general, se utilizó un total de N = 3 dispositivos independientes (chips) por condición para recopilar datos de medición (tasas de transporte, etc.), a menos que se indique lo contrario. Para examinar la significación entre dos grupos de datos, se realizó la prueba t de dos muestras con un nivel de significación establecido en 0,05. Excluimos el análisis de significación estadística en los datos de qPCR de la Fig. 4a ya que solo hubo N = 2 experimentos independientes para los casos de RPTEC y LTL+. Los datos de qPCR presentados en la información complementaria (es decir, las figuras complementarias 1d, 2b) se recopilan de un experimento por condición con n = 5 repeticiones técnicas. Por lo tanto, no se realizó ningún análisis estadístico entre los grupos. Otros detalles se explican en las leyendas de las figuras.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de origen numéricos para gráficos y tablas se almacenan en https://doi.org/10.6084/m9.figshare.22339615.v2.

Zhuo, JL & Li, XC Nefrona proximal. compr. Fisiol. 3, 1079–1123 (2013).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Curthoys, NP & Moe, OW Función del túbulo proximal y respuesta a la acidosis. clin. Mermelada. Soc. nefrol. 9, 1627-1638 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Jansen, J. et al. Células epiteliales del túbulo proximal humano cultivadas en fibras huecas: membranas vivas que transportan activamente cationes orgánicos. ciencia Rep. 5, 16702 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Homan, KA et al. Bioimpresión de túbulos proximales renales contorneados en 3D en chips perfundibles. ciencia Rep. 6, 34845 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rey, SM et al. Los tejidos del túbulo proximal en 3D recapitulan aspectos clave de la fisiología renal para permitir las pruebas de nefrotoxicidad. Frente. Fisiol. 8, 123 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Vedula, EM, Alonso, JL, Arnaout, MA & Charest, JL Túbulo proximal renal microfluídico con función de reabsorción activa. PLoS ONE 12, e0184330 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Lin, Nueva York y col. Reabsorción renal en modelos de túbulos proximales vascularizados en 3D. proc. Academia Nacional. ciencia 116, 5399–5404 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Luisis, M. et al. Aislamiento de células madre renales embrionarias clonogénicas autorrenovables a largo plazo. Res. de células madre. 5, 23–39 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Académico

McMahon, AP Desarrollo del riñón de mamífero. actual Arriba. desarrollo Biol. 117, 31–64 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Hendry, C., Rumballe, B., Moritz, K. & Little, MH Definición y redefinición de la población progenitora de nefronas. pediatra nefrol. 26, 1395-1406 (2011).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, DM, Church, GM e Ingber, DE Diferenciación dirigida de células madre pluripotentes inducidas por humanos en podocitos maduros de riñón y establecimiento de un Glomerulus Chip. Nat. Protocolo 13, 1662–1685 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Takasato, M. et al. Dirigir la diferenciación de células madre embrionarias humanas hacia un linaje renal genera un riñón autoorganizado. Nat. Biol celular. 16, 118–126 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Taguchi, A. et al. La redefinición del origen in vivo de los progenitores de nefronas metanéfricas permite la generación de estructuras renales complejas a partir de células madre pluripotentes. Cell Stem Cell 14, 53–67 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Tsujimoto, H. et al. Un sistema de diferenciación modular mapea múltiples linajes de riñón humano a partir de células madre pluripotentes. Informe celular 31, 107476 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Chandrasekaran, V. et al. Generación y caracterización de células similares a túbulos proximales renales derivadas de iPSC con estabilidad extendida. ciencia Rep. 11, 11575 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Morizane, R. & Bonventre, JV Organoides renales: un viaje traslacional. Tendencias Mol. Medicina. 23, 246–263 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Xia, Y. et al. Diferenciación dirigida de células pluripotentes humanas a células similares a progenitoras renales de yema ureteral. Nat. Biol celular. 15, 1507–1515 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Taguchi, A. & Nishinakamura, R. Organogénesis renal de orden superior a partir de células madre pluripotentes. Cell Stem Cell 21, 730–746.e736 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Takasato, M., Er, PX, Chiu, HS & Little, MH Generación de organoides renales a partir de células madre pluripotentes humanas. Nat. Protocolo 11, 1681-1692 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Takasato, M. et al. Los organoides renales de células iPS humanas contienen múltiples linajes y modelan la nefrogénesis humana. Naturaleza 526, 564–568 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Narayanan, K. et al. Las células madre embrionarias humanas se diferencian en células tubulares proximales renales funcionales. Riñón Int. 83, 593–603 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Kandasamy, K. et al. Predicción de nefrotoxicidad inducida por fármacos y mecanismos de lesión con células derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos y métodos de aprendizaje automático. ciencia Rep. 5, 12337 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Kim, YK, Nam, SA y Yang, CW Aplicaciones de organoides renales derivados de células madre pluripotentes humanas. Korean J. Pasante. Medicina. 33, 649–659 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Beauchamp, P. et al. El cocultivo 3D de cardiomiocitos derivados de hiPSC con fibroblastos cardíacos mejora las características similares a las de los tejidos de los esferoides cardíacos. Frente. mol. Biosci. 7, 14 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ronaldson-Bouchard, K. et al. Maduración avanzada de tejido cardíaco humano cultivado a partir de células madre pluripotentes. Naturaleza 556, 239–243 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pablo, R. et al. Cadherin-6, una molécula de adhesión celular expresada específicamente en el túbulo renal proximal y el carcinoma de células renales. Cáncer Res. 57, 2741-2748 (1997).

CAS PubMed Google Académico

Cho, EA et al. Expresión diferencial y función de cadherina-6 durante el desarrollo del epitelio renal. Desarrollo 125, 803–812 (1998).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Takata, Y. et al. Evaluación de la resistencia eléctrica transepitelial del tejido del túbulo proximal por inclusión y eliminación de iones de calcio extracelulares. En 2021 IEEE 34th International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS) 415–418 (IEEE, Gainesville, FL, EE. UU., 2021).

Takata, Y. et al. Evaluación de la resistencia eléctrica transepitelial mediante la eliminación y reposición de Ca2+ extracelular. IEEJ Trans. Sens. Micromachines E (J. Sens. Micromachines) 142, 21–28 (2022).

Artículo Google Académico

Duan, Y. et al. Reorganización inducida por cizallamiento del citoesqueleto de actina de células del túbulo proximal renal y complejos de unión apical. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 105, 11418–11423 (2008).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jang, KJ et al. Túbulo proximal en un chip de riñón humano para el transporte de fármacos y la evaluación de la nefrotoxicidad. Integrar Biol.: Cuant. Biosci. Nano Macro 5, 1119–1129 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Ferenbach, DA & Bonventre, JV Túbulos renales: diafonía intertubular, vascular y glomerular. actual Opinión nefrol. Hipertensión 25, 194–202 (2016).

Artículo Google Académico

Largo, KR et al. La endocitosis apical del túbulo proximal está modulada por la tensión de cizallamiento del fluido a través de una vía dependiente de mTOR. mol. Biol. celda 28, 2508–2517 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tanner, GA & Evan, AP Morfología glomerular y tubular proximal después de la obstrucción de una sola nefrona. Riñón Int. 36, 1050–1060 (1989).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Kondo, T. & Hayashi, S. Mecanismos de cambios de altura celular que median la invaginación epitelial. desarrollo (Camb., Engl.) 57, 313–323 (2015).

Google Académico

Prozialeck, WC, Edwards, JR, Lamar, PC & Smith, CS Características de la barrera epitelial y expresión de moléculas de adhesión celular en líneas celulares derivadas de túbulos proximales comúnmente utilizadas para estudios de toxicidad in vitro. Toxicol. In Vitro 20, 942–953 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Secker, PF, Schlichenmaier, N., Beilmann, M., Deschl, U. & Dietrich, DR Mediciones de transporte transepitelial funcional para detectar nefrotoxicidad in vitro utilizando la línea celular RPTEC/TERT1. Arco. Toxicol. 93, 1965-1978 (2019).

Rey, SM et al. Los tejidos del túbulo proximal en 3D recapitulan aspectos clave de la fisiología renal para permitir las pruebas de nefrotoxicidad. Frente. Fisiol. 8, 123 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Tasnim, F. & Zink, D. Intercambio de información entre células tubulares renales humanas primarias y células endoteliales en cocultivos. Soy. J. Physiol.—Ren. Fisiol. 302, F1055–F1062 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Dickson, LE, Wagner, MC, Sandoval, RM & Molitoris, BA El túbulo proximal y la albuminuria: ¡realmente! Mermelada. Soc. Nefrología 25, 443–453 (2014).

Artículo CAS Google Académico

Abbas, G., Al Harrasi, A., Hussain, H., Hamaed, A. & Supuran, CT El control de la diabetes mellitus: el papel imperativo de los productos naturales contra la dipeptidil peptidasa-4, la α-glucosidasa y la glucosa dependiente de sodio co -transportador 2 (SGLT2). Bioorg. química 86, 305–315 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Blaschek, W. Productos naturales como compuestos principales para inhibidores del cotransportador de sodio y glucosa (SGLT). Planta Med. 83, 985–993 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Hummel, CS et al. Selectividad estructural de los inhibidores de SGLT humanos. Soy. J. Physiol. Fisiol Celular. 302, C373–C382 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Ohlson, M., Sörensson, J. & Haraldsson, B. Tamaño glomerular y selectividad de carga en la rata según lo revelado por FITC-ficoll y albúmina. Soy. J. Physiol. Ren. Fisiol. 279, F84–F91 (2000).

Artículo CAS Google Académico

Wilmer, MJ et al. Nueva línea celular del túbulo proximal humano condicionalmente inmortalizada que expresa transportadores funcionales de entrada y salida. Res. de tejido celular. 339, 449–457 (2010).

Artículo PubMed Google Académico

Yonezawa, A., Masuda, S., Yokoo, S., Katsura, T. e Inui, K.-I. El cisplatino y el oxaliplatino, pero no el carboplatino ni el nedaplatino, son sustratos para los transportadores de cationes orgánicos humanos (SLC22A1–3 y familia de extrusión de toxinas y múltiples fármacos). J. Pharmacol. Exp. Terapéutica 319, 879–886 (2006).

Artículo CAS Google Académico

Marable, SS, Chung, E. & Park, JS Se requiere Hnf4a para el desarrollo de progenitores que expresan Cdh6 en túbulos proximales en el riñón de ratón. Mermelada. Soc. nefrol. 31, 2543–2558 (2020).

Briggs, JA et al. Las células madre pluripotentes inducidas libres de integración modelan las características genéticas y de desarrollo neuronal de la etiología del síndrome de down. Células madre 31, 467–478 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Descargar referencias

Los autores agradecen al Instituto de Investigación Hanaichi UltraStructure por su asistencia con la microscopía TEM. También nos gustaría agradecer a Mayumi Moriwake, Yoshikazu Kameda, Shiho Morimoto y Aki Kubo por su asistencia en el mantenimiento de organoides renales, transcripción inversa, qPCR y experimentos de microfabricación. Un agradecimiento especial a Yoshiki Sahara por su ayuda en el desarrollo del protocolo MACS. Este trabajo fue apoyado parcialmente por el Programa del Centro de Innovación (COI) de MEXT y JST (subvención n.º JPMJCE1307), el proyecto AMED-MPS (subvenciones n.º JP22be1004204 y JP17be0304205) y el Centro de Nanotecnología de la Universidad de Kyoto en el "Programa de Plataforma de Nanotecnología" patrocinado por el Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología (MEXT), Japón, (subvención no. JPMXP09F19KT0107).

Departamento de Microingeniería, Universidad de Kyoto, Kyoto, 615-8540, Japón

Ramin Banan Sadeghian, Ryohei Ueno, Yuji Takata, Akihiko Kawakami, Cheng Ma y Ryuji Yokokawa

Centro de Investigación y Aplicación de Células iPS (CiRA), Universidad de Kyoto, Kyoto, 606-8507, Japón

Toshikazu Araoka

Centro RIKEN para la Investigación de Dinámica de Biosistemas (BDR), Kobe, 650-0047, Japón

Minoru Takasato

Escuela de Graduados en Medicina, Universidad de Osaka, Osaka, 565-0871, Japón

Minoru Takasato

Escuela de Graduados en Bioestudios, Universidad de Kyoto, Kyoto, 606-8501, Japón

Minoru Takasato

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

RBS y RY concibieron y supervisaron el proyecto, interpretaron los datos y escribieron el manuscrito. RBS estableció los protocolos para cultivo/mantenimiento celular, inmunotinción, microscopía confocal, análisis de imágenes, perfilado de intensidad z, medición TEER, qPCR, ensayos de transporte de glucosa y albúmina, microfabricación de chips, y realizó los experimentos y analizó los datos. RU diseñó los ensayos de transporte de Pgp y OCT2, realizó cultivos celulares y realizó las mediciones correspondientes en el sistema bicapa RPTEC/HUVEC. YT y RU diseñaron y realizaron experimentos TEER. KA ejecutó el ensayo de transportador de Pgp en el sistema de cocultivo RPTEC/LTL +. CM diseñó el modelo de elementos finitos para el chip empleado para modelar el esfuerzo cortante inducido por el flujo y ejecutó la simulación. MT proporcionó los protocolos para el cultivo y mantenimiento de KO derivados de hiPSC, MACS y ayudó en la interpretación de datos. TA proporcionó el protocolo para FACS y ayudó en los experimentos de clasificación y análisis de datos relevantes. Todos los autores leyeron, editaron y comentaron el manuscrito.

Correspondencia a Ryuji Yokokawa.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Roberto Gramignoli ya los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Simona Chera, Eve Rogers y George Inglis.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Banan Sadeghian, R., Ueno, R., Takata, Y. et al. Las células separadas de organoides renales derivados de hiPSC junto con células inmortalizadas modelan de forma fiable el túbulo proximal. Comun Biol 6, 483 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04862-7

Descargar cita

Recibido: 19 Septiembre 2022

Aceptado: 21 de abril de 2023

Publicado: 04 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04862-7

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y Pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.