Dirigirse a TBK1 para superar la resistencia a la inmunoterapia contra el cáncer

Nature, volumen 615, páginas 158–167 (2023)Citar este artículo

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A pesar del éxito del bloqueo de PD-1 en el melanoma y otros cánceres, faltan estrategias de tratamiento eficaces para superar la resistencia a la inmunoterapia del cáncer1,2. Aquí identificamos la quinasa 1 de unión a TANK de la quinasa inmune innata (TBK1)3 como un gen de evasión inmune candidato en una pantalla genética combinada4. Usando un conjunto de herramientas genéticas y farmacológicas en múltiples sistemas de modelos experimentales, confirmamos un papel para TBK1 como un gen de evasión inmune. Dirigirse a TBK1 mejora las respuestas al bloqueo de PD-1 al disminuir el umbral de citotoxicidad para las citocinas efectoras (TNF e IFNγ). La inhibición de TBK1 en combinación con el bloqueo de PD-1 también demostró eficacia utilizando modelos de tumores derivados de pacientes, con hallazgos concordantes en esferoides tumorales organotípicos derivados de pacientes y organoides derivados de pacientes. Las células tumorales que carecen de TBK1 están preparadas para sufrir una muerte celular dependiente de RIPK y caspasa en respuesta a TNF e IFNγ de una manera dependiente de JAK-STAT. En conjunto, nuestros resultados demuestran que dirigirse a TBK1 es una estrategia eficaz para superar la resistencia a la inmunoterapia contra el cáncer.

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Los conjuntos de datos generados y analizados en este estudio se incluyen en el Artículo y su Información Complementaria. Los datos de scRNA-seq in vivo se han depositado en GEO con los códigos de acceso GSE217160 (estudio TBK1i in vivo) y GSE217274 (estudio CRISPR-Cas9 TBK1 in vivo) y están disponibles previa solicitud. Las descripciones de los análisis se proporcionan en el resumen de métodos e informes.

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Este trabajo fue apoyado por NIH K08CA226391 (a RWJ), P01CA24023 (a SIP), K99CA259511 (a KP), T32CA207021 (a JHC), 5R01AR072304 (a DEF), 5P01CA163222 (a DEF), 5R01AR043369 (a DEF) y 5R 01CA222871 ( a DEF). El Melanoma Research Alliance Young Investigator Award (https://doi.org/10.48050/pc.gr.86371, para RWJ), una beca de investigación para profesores de la Karin Grunebaum Cancer Research Foundation (para RWJ), Termeer Early Career proporcionó apoyo adicional. Beca en Farmacología de Sistemas (para RWJ) y una donación de SB y JW Belkin. KP reconoce el apoyo de la Fundación Alemana de Investigación (DFG), el premio Peggy Prescott de Stand Up to Cancer para científicos de carrera temprana PA-6146, el premio Stand Up to Cancer Phillip A. Sharp SU2C-AACR-PS-32; DJ reconoce la Iniciativa de Heterogeneidad Tumoral de Susan Eid; y DEF reconoce el apoyo financiero de la Fundación de Investigación Médica Dr. Miriam y Sheldon G. Adelson. Los organismos de financiación no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, ni en la recopilación, el análisis y la interpretación de los datos, ni en la redacción del manuscrito. Damos las gracias a todos los miembros de los laboratorios Manguso y Jenkins en MGH, HMS y el Instituto Broad. Los gráficos en las Figs. 2a y 5i se crearon con BioRender.

Estos autores supervisaron conjuntamente este trabajo: Robert T. Manguso, Russell W. Jenkins

Centro de Cáncer del Hospital General de Massachusetts, Departamento de Medicina, Hospital General de Massachusetts, Facultad de Medicina de Harvard, Boston, MA, EE. UU.

Yi Sun, Or-yam Revach, Amina Fu, Xiang Ma, Jia Gwee, Princy Sindurakar, Jun Tian, Arnav Mehta, Moshe Sade-Feldman, Thomas LaSalle, Hongyan Xie, Rodrigo Saad-Beretta, Kathleen B. Yates, Angelina M. Cicerchia, Martin Q. Rasmussen, Samuel J. Klempner, Dejan Juric, David M. Miller, Jonathan H. Chen, Karin Pelka, Dennie T. Frederick, Debattama R. Sen, Ryan B. Corcoran, Nir Hacohen, Keith T Flaherty, Robert T. Manguso y Russell W. Jenkins

Instituto Broad del MIT y Harvard, Cambridge, MA, EE. UU.

Seth Anderson, Emily A. Kessler, Clara H. Wolfe, Emily J. Robitschek, Thomas GR Davis, Sarah Kim, Payal Tiwari, Peter P. Du, Arnav Mehta, Alexis M. Schneider, Moshe Sade-Feldman, Kathleen B. Yates , Arvin Iracheta-Vellve, Jonathan H. Chen, Karin Pelka, Nir Hacohen, Genevieve M. Boland, Robert T. Manguso y Russell W. Jenkins

Laboratorio de Farmacología de Sistemas, Programa de Harvard en Ciencias Terapéuticas, Facultad de Medicina de Harvard, Boston, MA, EE. UU.

Anne Jenney, Caitlin E. Mills, Shuming Liu, Johan KE Spetz, Xingping Qin, Kristopher A. Sarosiek, Peter K. Sorger y Russell W. Jenkins

Departamento de Oncología Médica, Instituto del Cáncer Dana-Farber, Boston, MA, EE. UU.

Arnav Mehta, Elena Ivanova, Amir R. Aref, Cloud P. Paweletz y David A. Barbie

Departamento de Ingeniería Biológica, Instituto Tecnológico de Massachusetts, Cambridge, MA, EE. UU.

Alexis M Schneider

Departamento de Biología Celular y Ciencias del Cáncer, Facultad de Medicina Rappaport, Instituto de Tecnología, Technion, Haifa, Israel

Keren Yizhak

División de Oncología Quirúrgica, Departamento de Cirugía, Centro de Cáncer del Hospital General de Massachusetts, Facultad de Medicina de Harvard, Boston, MA, EE. UU.

Tatyana Sharova, William A. Michaud, Sarah I. Pai y Genevieve M. Boland

Programa de Ciencias Fisiológicas Moleculares e Integrativas, Escuela de Salud Pública de Harvard, Boston, MA, EE. UU.

John KE Spetz, Xingping Qin y Christopher A. Sarosiek

Centro John B. Little de Ciencias de la Radiación, Escuela de Salud Pública de Harvard, Boston, MA, EE. UU.

John KE Spetz, Xingping Qin y Christopher A. Sarosiek

Programa de Oncogénesis Molecular y Celular, Instituto Wistar, Filadelfia, Pensilvania, EE. UU.

gao zhang

Centro de Tumores Cerebrales Preston Robert Tisch, Departamento de Neurocirugía, Facultad de Medicina de la Universidad de Duke, Durham, NC, EE. UU.

gao zhang

Centro de Tumores Cerebrales Preston Robert Tisch, Departamento de Patología, Facultad de Medicina de la Universidad de Duke, Durham, NC, EE. UU.

gao zhang

Moores Cancer Center, UC San Diego, La Jolla, CA, USA

joven wook kim

Center for Novel Therapeutics, UC San Diego, La Jolla, CA, USA

joven wook kim

Department of Medicine, UC San Diego, La Jolla, CA, USA

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Centro de Investigación de Biología Cutánea, Departamento de Dermatología, Hospital General de Massachusetts y Facultad de Medicina de Harvard, Boston, MA, EE. UU.

Mack Y. Su y David E. Fisher

Centro de Biología de Sistemas, Hospital General de Massachusetts, Boston, MA, EE. UU.

Sara I Pai

Departamento de Dermatología, Hospital General de Massachusetts y Facultad de Medicina de Harvard, Boston, MA, EE. UU.

David M Miller

División de Bioestadística, Departamento de Ciencias de la Información, Instituto del Cáncer Dana-Farber, Boston, MA, EE. UU.

Anita Giobbie-Hurder

Departamento de Patología, Hospital General de Massachusetts, Boston, MA, EE. UU.

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Gilead Sciences, Foster City, CA, EE. UU.

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Belfer Center for Applied Cancer Science, Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA, EE. UU.

Elena Ivanova, Amir R. Aref, Cloud P. Paweletz & David A. Barbie

Xsphera Biosciences, Boston, MA, EE. UU.

Amir R. Aref

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Concepción y diseño experimental: YS, O.-yR, SA, CEM, PT, KBY, AI-V., RTM y RWJ Metodología y adquisición de datos: YS, O.-yR, SA, EAK, CHW, AJ, CEM, EJR, AF, XM, JG, PT, AMC, MQR, PS, JT, AM, HX, TS, SL, WAM, RS-B., JKES, XQ, GZ, MYS, JWK, SJK, DTF, DJ, SORBO , DMM, SS, EI, ARA, CPP, DRS y GMB Análisis e interpretación de datos: YS, O.-yR, SA, CEM, PT, TGRD, SK, PPD, JT, AM, AMS, KY, MS-F ., TL, JWK, KAS, AG-H., JHC, KP, DAB, DEF, RBC, NH, PKS, KTF, GMB, RTM y RWJ Redacción y revisión de manuscritos: YS, O.-yR, SA, CEM, HX, DJ, DAB, RTM y RWJ

Correspondencia a Russell W. Jenkins.

RWJ es miembro del consejo asesor y tiene un interés financiero en Xsphera Biosciences, una empresa centrada en el uso de tecnología de perfilado ex vivo para ofrecer soluciones de inmunooncología funcionales y de precisión para pacientes, proveedores y empresas de desarrollo de fármacos. AM es consultor de Third Rock Ventures, Asher Biotherapeutics y Abata Therapeutics; y posee acciones en Asher Biotherapeutics y Abata Therapeutics. SIP ha recibido pagos por consultoría de Abbvie, Astrazeneca/MedImmune, Cue Biopharma, Fusion Pharmaceuticals, MSD/Merck, Newlink Genetics, Oncolys Biopharma, Replimmune, Scopus Biopharma y Sensei Biopharma; ha recibido becas/apoyo de investigación de Abbvie, Astrazeneca/MedImmune, Cue Biopharma, Merck y Tesaro. SJK ha desempeñado un papel de consultor/asesor para Eli Lilly, Merck, BMS, Astellas, Daiichi-Sankyo, Pieris y Natera; y posee acciones en Turning Point Therapeutics. DJ recibió honorarios por consultoría de Novartis, Genentech, Syros, Eisai, Vibliome, Mapkure y Relay Therapeutics; realizó investigaciones contratadas con Novartis, Genentech, Syros, Pfizer, Eisai, Takeda, Pfizer, Ribon Therapeutics, Infinity, InventisBio y Arvinas; y tiene participación accionaria en Relay Therapeutics y PIC Therapeutics. DMM ha recibido honorarios por participar en juntas asesoras de Checkpoint Therapeutics, EMD Serono, Castle Biosciences, Pfizer, Merck, Regeneron y Sanofi Genzyme; y posee acciones en Checkpoint Therapeutics. DEF tiene un interés financiero en Soltego, una empresa que desarrolla inhibidores de la cinasa inducibles por sal para tratamientos tópicos de oscurecimiento de la piel que podrían usarse para un amplio conjunto de aplicaciones humanas. RTM consulta para Bristol Myers Squibb. MS-F. recibe fondos de investigación de Bristol-Meyers Squib.

Nature agradece a Robert Bradley, Toshiro Sato y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a, Agotamiento/enriquecimiento relativo de los sgRNA de Ikbke de un grupo de sgRNA dirigidos a 2368 genes expresados por células de melanoma B16 que expresan Cas9 (n = 4 guías independientes dirigidas a cada gen; la tasa de descubrimiento falso (FDR) se calculó utilizando el algoritmo STARS v1.3 , como se describió previamente6,7). b, niveles de proteína TBK1 y β-actina en células B16 control y Tbk1-null. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes. c, Proliferación de células tumorales Tbk1-null y control B16 después de 1-4 días de cultivo in vitro (n = 9 por condición de tres experimentos independientes). d, Volumen tumoral de control (gris), tumores B16 Tbk1-null (rojo claro) en ratones NSG (n = 5 ratones por grupo). Los volúmenes tumorales medios (círculos sólidos) se muestran +/− sem (región sombreada). ANOVA de 2 vías con la prueba de comparaciones múltiples de Sidak. e, Gráficos de araña para el análisis del volumen del tumor para controlar sgRNA-1 (negro), sgRNA-2 (gris), Tbk1 sgRNA-1 (rosa) y Tbk1 sgRNA-2 (rojo) B16 tumores en tratados con anti-PD-1 ratones C57BL/6 de tipo salvaje (ver Fig. 1c). fg, diagramas de araña para análisis de volumen tumoral (f) y supervivencia (g) para tumores de control (negro), anti-PD-1 (gris), TBK1i (rosa) y anti-PD-1+TBK1i (rojo) B16 en Ratones C57BL/6 (ver Fig. 1d). Para el análisis de supervivencia (g), se realizaron pruebas por pares usando la prueba de rango logarítmico (Mantel-Cox) para supervivencia (g); n = 10 ratones por grupo de tratamiento, ***P < 0,001; ns, no significativo, en comparación con el grupo control. h, peso corporal de ratones portadores de tumores B16-ova el día 14 del tratamiento indicado. Se muestran las medias (barras) y los valores individuales (círculos abiertos) (n = 10 ratones por grupo, ANOVA de 1 vía con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey; ns, no significativo). i, Evaluación de viabilidad de CT26 MDOTS con tratamientos indicados. Se muestran las medias (barras) y los valores individuales (círculos blancos) (n = 3, réplicas biológicas, ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey; *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; * *** P < 0,0001). j–k, análisis del volumen tumoral de ratones con tumores MC38 (j) y MB49 (k) tratados con TBK1i, anti-PD-L1 o una combinación en comparación con el control (IgG + vehículo); n = 10 ratones por grupo de tratamiento. Los volúmenes tumorales medios (círculos sólidos) se muestran +/− sem (región sombreada). ANOVA de 2 vías con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey ***P < 0,001; en comparación con el grupo de control.

a, Tipo de tumor, origen del tejido (ubicación), datos de respuesta clínica, datos de respuesta de PDOTS y perfil de mutación tumoral asociado para muestras utilizadas para el perfil de PDOTS (muestras ordenadas por respuesta de PDOTS ex vivo a anti-PD-1+TBK1i combinado). Parámetros de respuesta de PDOTS definidos de la siguiente manera: respondedor (reducción >30 % en comparación con el control), respondedor parcial (reducción <30 % y crecimiento <20 % en comparación con el control) y no respondedor (crecimiento >20 % en comparación con el control). El borde rojo alrededor del rectángulo gris indica la presencia de alteración en el gen indicado. b, efecto del Ab monoclonal de control IgG4 sobre la viabilidad de PDOTS de un paciente con melanoma. Se muestran las medias (barras) y los valores individuales (círculos abiertos) (n = 3, réplicas biológicas, prueba t no apareada de 2 caras).

a–b, gráfico tSNE de 11 grupos de células CD45+ (a) de pacientes con melanoma metastásico que responden (R) o no responden (NR) al bloqueo del punto de control inmunitario (ref. Sade-Feldman et al. 2018), y t- Gráficas de SNE de células individuales secuenciadas con ARN con coloración de CD3E (células T), CD14 (células mieloides) y CD19 (células B) Expresión de TBK1 e IKBKE (b). c–d, proporciones de grupos amplios (c) y porcentaje de células por grupo en los grupos de tratamiento indicados (d). e – f, UMAP ( c ) y gráficos de densidad ( d ) de células linfoides reagrupadas (T / NK). g, proporciones de grupos de células linfoides (T/NK). Las medias (barras) y los valores individuales (círculos) se muestran +/− sem (barras de error). Prueba t múltiple no pareada, *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; **** P < 0,0001; ns, no significativo. h, porcentaje de esplenocitos CD8+ de ratón activados (CD69+CD25+) pretratados con TBK1i (1 μM) o DMSO (0,1%) con/sin reestimulación; n = 3 muestras biológicamente independientes, ANOVA de 2 vías, prueba de comparaciones múltiples de Sidak; *P < 0,05; *** P < 0,001. i–k, tinción de citoquinas intracelulares para TNF (i), IL-2 (j) e IFNγ (k) de esplenocitos CD3+CD8+ de ratón pretratados con TBK1i (1 μM) o DMSO (0,1 %) con/sin reestimulación con los datos mostrados como % de células CD69+CD25+ y MFI); n = 3 muestras biológicamente independientes, ANOVA de 2 vías, prueba de comparaciones múltiples de Sidak; **P < 0,01; **** P < 0,0001; ns, no significativo.

a, Citometría de flujo de poblaciones inmunes de tumores B16 control y Tbk1-null tratados con anti-PD-1 (n = 4 por grupo). Se muestran las medias (barras) y los valores individuales (círculos blancos) (n = 4 muestras biológicamente independientes, prueba t no pareada de 2 caras). bc, gráficos de UMAP (b) y densidad (c) de 31 810 células individuales secuenciadas con ARN de tumores B16 control y Tbk1-null después del tratamiento anti-PD-1 (DC, células dendríticas; Tregs, células T reguladoras; MDSC, mieloides- célula supresora derivada; NK, células asesinas naturales; macrófagos M1, M1; macrófagos M2, M2). d, porcentaje de células en cada grupo definido por linaje. Se muestran las medias (barras) y los valores individuales (círculos vacíos) (n = 4 muestras biológicamente independientes, ANOVA de 2 vías, prueba de comparaciones múltiples de Sidak; valores de P mostrados para macrófagos M1 y células T CD8 que no alcanzaron significación estadística). e, gráfico UMAP de células individuales secuenciadas con ARN con coloración de la expresión de Tbk1 e Ikbke con los tipos de células a los que se hace referencia (b). f, gráfico de burbujas que indica la expresión de Tbk1 e Ikbke en grupos de células definidos por UMAP.

a, gráfico UMAP de células individuales secuenciadas con ARN con coloración de la expresión de Ifng y Tnf con tipos de células referenciados (derecha). b, cambio logarítmico de la expresión de Ifng (rojo claro) y Tnf (azul claro) en grupos de células definidas por linaje (Tbk1-null/control).

a, diagrama de volcán que representa el agotamiento/enriquecimiento relativo del gen sgRNA. Se indican los 5 principales sgRNA agotados. b, diagrama de dispersión de la esencialidad del gen de la pantalla CRISPR in vitro (control y células B16 nulas Tbk1). c, expresión de TBK1 y viabilidad celular (control frente a TNF/IFNγ;) para clones de células individuales derivados del control policlonal y células B16 sin Tbk1. Western blot es representativo de tres experimentos independientes. Se muestran las medias (barras) y los valores individuales (círculos blancos) (n = 6 en dos experimentos independientes, ANOVA de 2 vías, prueba de comparaciones múltiples de Sidak; **** P < 0,0001; ns, no significativo). d, espectro de indel de TBK1 de clones de células individuales de control sgRNA y Tbk1 sgRNA B16. e, Evaluación de viabilidad (Cell Titer Glo) de células B16-ova en cultivo 2D estándar después de 24 h de tratamiento con TNF (160 ng ml−1) + IFNγ (40 ng ml−1) en comparación con células no estimuladas (n = 6, 2 experimentos independientes, ANOVA de 1 vía, prueba de comparaciones múltiples de Holm-Sidak). f, Evaluación de viabilidad (Hoechst/yoduro de propidio) de esferoides tumorales B16 (que carecen de células inmunitarias) en cultivo de microfluidos 3D después de 96 h de tratamiento con TNF (10 ng ml−1) + IFNγ (10 ng ml−1) en comparación con células no estimuladas ( n = 6, 2 experimentos independientes, ANOVA de 1 vía, prueba de comparaciones múltiples de Holm-Sidak). g, evaluación de la viabilidad celular de las células B16 después de 24 h de tratamiento con TNF (200 ng ml−1) + IFNγ (40 ng ml−1) en comparación con células no estimuladas tratadas con concentraciones crecientes de MRT67307 (n = 9, 3 experimentos independientes 2- manera ANOVA, prueba de comparaciones múltiples de Sidak). h, Evaluación de la viabilidad celular de células B16 en cultivo 2D estándar después de 24 h de tratamiento con TNF (200 ng ml−1) + IFNγ (40 ng ml−1) en comparación con células no estimuladas tratadas con concentraciones crecientes de GSK8612 (n = 3, 1 experimento independiente, ANOVA de 2 vías, prueba de comparaciones múltiples de Sidak). i, Evaluación de la viabilidad celular de células B16 en cultivo 2D estándar después de 24 h de tratamiento con TNF (200 ng ml−1) + IFNγ (40 ng ml−1) con concentraciones crecientes de TBK1 PROTAC 3i (n = 6, 2 experimentos independientes 2 -way ANOVA, prueba de comparaciones múltiples de Sidak). **** P < 0,0001; ns, no significativo.

a, valores de GR para la titulación del inhibidor de 9 puntos de TBK1i en células B16 parentales, control sgRNA (policlonal y monoclonal) y Tbk1 sgRNA (policlonal y monoclonal) (2 experimentos independientes; datos representativos de un solo experimento con 6 réplicas técnicas por condición) . Las medias (círculos sólidos) se muestran +/− sem (barras de error). b–c, evaluación de la potencia de TBK1i (b; efecto semimáximo, GEC50) y eficacia general (c; área sobre la curva GR, GRAOC) d–e, Mapa de calor de los valores GR para el inhibidor parental (d) y BRAF/MEK células de melanoma humano A375 resistentes (e) tratadas con concentraciones crecientes de TNF e IFNγ durante 24, 24 y 72 h con 0, 0, 25 y 1, 0 μM de TBK1i (n = 3).

a–b, Evaluación de la viabilidad celular (Cell Titer Glo) en células B16 control y Tbk1-null pretratadas con inhibidor de RIPK1 (Nec-1s, 10 μM) y el inhibidor de pan-caspasa Q-VD-OPh (10 μM) + /− TNF/IFNγ (n=3, 1 experimento independiente: ANOVA de 2 vías, prueba de comparaciones múltiples de Dunnett). b, evaluación de la viabilidad celular (Cell Titer Glo) en células de control y Tbk1-null B16 pretratadas con inhibidor de RIPK1 (Nec-1s, 10 μM) y el inhibidor de pan-caspasa z-VAD-fmk (20 μM) +/− TNF/IFNγ (n = 3-6, 1-2 experimentos independientes: ANOVA de 2 vías, prueba de comparaciones múltiples de Dunnett). c, evaluación de la viabilidad celular en células Tbk1-null B16 pretratadas con inhibidor de RIPK1 (Nec-1s, 10 μM) y el inhibidor de caspasa 8 z-IETD-fmk (2,5 μM) +/− TNF/IFNγ (n = 6, 2 experimentos independientes; ANOVA de 2 vías, prueba de comparaciones múltiples de Dunnett). d, evaluación de la viabilidad celular en células Tbk1-null B16 pretratadas con inhibidor de RIPK3 (HS-1371, 2 μM) y el inhibidor de pan-caspasa Q-VD-OPh (20 μM) +/− TNF/IFNγ (n = 6 , 2 experimentos independientes: ANOVA de 2 vías, prueba de comparaciones múltiples de Dunnett). e, evaluación de la viabilidad celular en células Tbk1-null B16 pretratadas con inhibidor de MLKL (GW806742X, 5 μM) y el inhibidor de pan-caspasa Q-VD-OPh (20 μM) +/− TNF/IFNγ (n = 6, 2 experimentos independientes: ANOVA de 2 vías, prueba de comparaciones múltiples de Dunnett). fh, ensayo clonogénico de células B16 tratadas con TNF (10 ng ml−1), IFNγ (10 ng ml−1) o TNF + IFNγ con control (DMSO al 0,1 %), Q-VD-OPh (20 μM) con/ sin el inhibidor de RIPK1 Nec-1s (10 μM, f), el inhibidor de RIPK3 HS-1371 (2 μM, g) y el inhibidor de MLKL GW806742X (2 μM, h) (se muestran imágenes representativas; n = 3). i, expresión normalizada de genes seleccionados en células B16 tratadas con TNF (10 ng ml−1), IFNγ (100 ng ml−1), o ambos, en comparación con las células de control (datos de origen para RNA-seq a granel – Manguso et al. 2017). j, expresión normalizada de Mlkl y Ripk3 en control y células Tbk1-null B16 con/sin tratamiento con TNF/IFNγ (18 h) determinada por qRT-PCR (n = 3; ANOVA de 2 vías, prueba de comparación múltiple de Sidak). *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; **** P < 0,0001; ns, no significativo. k, Western blot de las proteínas indicadas en lisados de células Tbk1-null B16 después de un pretratamiento de 2 horas con control de vehículo (DMSO al 0,1 %), Q-VD-OPh (20 μM), Nec-1s (10 μM) o Q -VD-OPh más Nec-1s, o Q-VD-OPh más birinapant (1 μM) seguido de 10 h de tratamiento con TNF (160 ng ml−1) e IFNγ (40 ng ml−1) o control sin estimular (PBS) . Los datos son representativos de tres experimentos independientes.

a, mapa de calor del % de liberación de citocromo C (cyt C) para el perfil de BH3 in vitro de células B16 de control no estimuladas (sg1 y sg2) y Tbk1-null (sg1 y sg2). Se muestran los valores medios; n=3 muestras biológicamente independientes; ANOVA de 2 vías, prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. b, mapa de calor del % de liberación de citocromo C (cyt C) para el perfilado in vitro de BH3 de células de control sgRNA y Tbk1 sgRNA B16. Se muestran los valores medios; n = 3 muestras biológicamente independientes; ANOVA de 2 vías, prueba de comparaciones múltiples de Tukey. No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre el control sgRNA y las células Tbk1 sgRNA B16 en ningún momento. c, Evaluación de viabilidad (Cell Titer Glo) de células B16 en cultivo 2D estándar después de 24 h de tratamiento con concentraciones indicadas de estaurosporina (STS) en control y células B16 nulas Tbk1. Se muestran las medias (barras) y los valores individuales (círculos abiertos) (n = 6, 2 experimentos independientes, ANOVA de 2 vías, prueba de comparaciones múltiples de Sidak). d, La evaluación de viabilidad (Hoechst/yoduro de propidio) de esferoides tumorales B16 (que carecen de células inmunitarias) en cultivo de microfluidos 3D después de 48 h de tratamiento indicó concentraciones de estaurosporina (STS) en comparación con células no estimuladas Las medias (barras) y los valores individuales (círculos abiertos) son mostrado (n = 6, 2 experimentos independientes, ANOVA de 1 vía, prueba de comparaciones múltiples de Holm-Sidak). e, Western blot para STING, IRF3, TBK1 y β-actina en células B16 con líneas celulares CRISPR individuales con ARN de guía única dirigidos a Tmem173, Irf3 y Tbk1 en comparación con sgRNA de control. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. f, Western blot para STING, IRF3, TBK1 y β-actina en células dobles CRISPR B16 con los pares de sgRNA indicados. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. g, Evaluación de viabilidad (Cell Titer Glo) de las células sgRNA B16 indicadas después de 48 h de tratamiento con TNF (160 ng ml−1) + IFNγ (40 ng ml−1) en comparación con las células no estimuladas. Se muestran las medias (barras) y los valores individuales (círculos abiertos) (n = 4 réplicas biológicas, ANOVA de 2 vías, prueba de comparaciones múltiples de Sidak, **P < 0,01; **** P < 0,0001; ns, no significativo). h, evaluación de viabilidad de PDOTS de pacientes (n = 2) con melanoma cutáneo con tratamientos indicados. Se muestran las medias (barras) y los valores individuales (círculos blancos) (n = 6 réplicas biológicas, 2 especímenes independientes; ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Dunn, **P < 0,01; **** P < 0,0001; ns, insignificante). i, mapa de calor de los perfiles de citoquinas secretadas (L2FC) de medios acondicionados de PDOTS en respuesta a los tratamientos indicados (n = 2). Valores medios mostrados. **P < 0,01; **** P < 0,0001; ns, no significativo.

a, histogramas de frecuencia de enriquecimiento (puntuación z) para todos los sgRNA por objetivo en células B16 nulas Tbk1 +/- estimulación in vitro con TNF (10 ng ml-1) e IFNγ (10 ng ml-1). b, diagrama de dispersión que representa el agotamiento relativo de sgRNA dirigidos a 19 674 genes en un control Cas9+ B16 y una línea celular Tbk1 sgRNA +/- estimulación in vitro con TNF (10 ng ml-1) e IFNγ (10 ng ml-1). c, Western blot de sgRNA de control y células B16 nulas Tbk1 tratadas con TNF (160 ng ml-1) e IFNγ (40 ng ml-1) durante los tiempos indicados. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. d, evaluación de la viabilidad celular en células B16 parentales pretratadas con TBK1i (1 μM) +/− inhibidor de JAK 1/2 (ruxolitinib, 0,5 μM) +/− TNF/IFNγ durante 48 h en comparación con controles no estimulados. Se muestran las medias (barras) y los valores individuales (círculos abiertos) (n=3, 1 experimento independiente; ANOVA de 2 vías, prueba de comparaciones múltiples de Dunnett; *P < 0,05; ***P < 0,001; **** P < 0,0001; ns, no significativo). e, Western blot de las proteínas indicadas en lisados de células B16 sin Tbk1 después de un pretratamiento de 2 horas con control de vehículo (DMSO al 0,1 %), ruxolitinib (1 μM), Q-VD-OPh (20 μM), Nec-1s ( 10 μM), o Q-VD-OPh más Nec-1s seguido de un tratamiento de 10 horas con TNF (160 ng ml−1) e IFNγ (40 ng ml−1) o control sin estimular (PBS). Los datos son representativos de tres experimentos independientes. f, valores de GR para la titulación del inhibidor de 9 puntos de ruxolitinib (JAK1/2i) en células B16 parentales, control sgRNA (monoclonal) y Tbk1 sgRNA (monoclonal) (2 experimentos independientes; datos representativos de un solo experimento con 6 repeticiones técnicas por condición ). Las medias (círculos sólidos) se muestran +/− sem (barras de error).

Figs suplementarias. 1–13. Matrices de expresión génica para scRNA-seq, estrategia de activación para citometría de flujo e imágenes sin recortar para análisis de transferencia Western.

Datos clinicopatológicos del PDOTS.

Datos de agotamiento y enriquecimiento de sgRNA para pantallas CRISPR in vitro en células B16.

Datos de apoyo a las principales cifras.

Datos de apoyo para las cifras de datos ampliados.

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Sun, Y., Revach, Oy., Anderson, S. et al. Dirigirse a TBK1 para superar la resistencia a la inmunoterapia contra el cáncer. Naturaleza 615, 158–167 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-05704-6

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Recibido: 16 julio 2021

Aceptado: 04 enero 2023

Publicado: 12 enero 2023

Fecha de emisión: 02 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-05704-6

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