Las proteínas de la cola del fago SU10 se reorganizan en la boquilla para la entrega del genoma

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 5622 (2022) Citar este artículo

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El fago SU10 de Escherichia coli pertenece al género Kuravirus de la clase Caudoviricetes de fagos con colas cortas no contráctiles. A diferencia de otros fagos de cola corta, las colas de los Kuravirus se alargan al adherirse a la célula. Aquí mostramos que el virión de SU10 tiene una cabeza alargada, que contiene proteínas del genoma y de eyección, y una cola, que está formada por proteínas de portal, adaptador, boquilla y aguja de la cola y está decorada con fibras largas y cortas. La unión de las fibras de la cola larga a los receptores de la membrana bacteriana externa induce el enderezamiento de las proteínas de la tobera y la rotación de las fibras de la cola corta. Después de la reorganización, las proteínas de la boquilla y las fibras de la cola corta se alternan para formar una boquilla que extiende la cola en 28 nm. Posteriormente, la aguja de la cola se separa de las proteínas de la boquilla y se liberan cinco tipos de proteínas de eyección de la cabeza SU10. La boquilla con la supuesta extensión formada por las proteínas de eyección permite la entrega del genoma SU10 en el citoplasma bacteriano. Es probable que todos los Kuravirus empleen este mecanismo de administración del genoma, que implica la formación de la boquilla de la cola.

Los fagos del género Kuravirus pertenecen a la clase Caudoviricetes de fagos con colas cortas no contráctiles1. Los kuravirus, incluido el fago SU10 de Escherichia coli, se distinguen entre los fagos de cola corta por sus genomas grandes con 75–80 000 pares de bases que codifican más de 50 proteínas 2,3,4. Los Kuravirus son líticos, y algunos de ellos tienen ciclos de replicación cortos y producen una descendencia abundante, lo que los convierte en candidatos para su uso en la terapia con fagos contra cepas patógenas de E. coli5,6,7. Se utilizó un cóctel de fagos que contenía el fago ES17, del género Kuravirus, en un estudio de caso para tratar la infección por E. coli de la próstata y el tracto urinario8.

Los genomas de los kuravirus se alojan en cabezas alargadas, caracterizadas por una simetría quíntuple y una elongación en la dirección del eje de la cola2,3. Los genomas de los fagos con cola se empaquetan en pro-cabezas preformadas mediante motores moleculares a través de un canal formado por el dodecámero de proteínas portales, que reemplaza un pentámero de proteínas de la cápside en uno de los cinco vértices de la cápside. Las colas de los fagos se unen a los complejos portales9. Los componentes comunes de la cola de los fagos con colas cortas que infectan bacterias Gram-negativas son las proteínas adaptadoras, las proteínas principales de la cola, las proteínas de la aguja de la cola y las fibras de la cola10. Las fibras de la cola permiten la unión inicial de los fagos a las bacterias11,12,13, mientras que las agujas de la cola son responsables de la penetración de la membrana externa de la célula huésped14,15. Las cabezas de la mayoría de los fagos de cola corta contienen proteínas de eyección, que permiten la entrega de genomas de fagos en las células huésped. Las proteínas de eyección forman un complejo de translocación que alarga la cola para abarcar la pared celular bacteriana 16,17,18,19. La presión dentro de la cabeza del fago permite la expulsión del 30-50% del genoma en una célula bacteriana20,21,22. Sin embargo, después de igualar las presiones dentro de la cabeza del fago y el citoplasma bacteriano, el resto del ADN tiene que ser entregado a la bacteria por otro mecanismo21,23,24. Se ha demostrado, utilizando microscopía electrónica de tinción negativa, que el fago SU10 tiene una cola más larga que la mayoría de los fagos clasificados anteriormente en la familia Podoviridae, y que la cola sufre un cambio de conformación al unirse a las bacterias2.

Aquí presentamos las estructuras de microscopía electrónica criogénica (crio-EM) del virión y la liberación del genoma intermedio del bacteriófago SU10 y la caracterización por tomografía crioelectrónica (crio-ET) de su unión a las células de E. coli. Después de unirse al huésped, la cola SU10, las proteínas de la boquilla y las fibras cortas se reorganizan para formar una boquilla que extiende la cola. Los Kuravirus comparten más del 70% de similitud de secuencia en las proteínas de su cola. Por lo tanto, es probable que este mecanismo de entrega del genoma, que implica la formación de la boquilla de la cola, sea empleado por la mayoría, si no todos, los Kuravirus.

El virión del bacteriófago SU10 tiene una cabeza alargada con una longitud de 1430 Å y un diámetro de 460 Å, que está formada por la proteína principal de la cápside (gp9) (Fig. 1a, Tabla complementaria 1, 2)2. La cola tiene una longitud de 220 Å y está decorada con seis fibras de cola largas y seis cortas (Fig. 1a-c, 2a, c, Tabla complementaria 1, 2). La cola está unida a uno de los vértices de la cápside alargada, donde el dodecámero de proteínas portales (gp6) reemplaza un pentámero de proteínas de la cápside (Figs. 1a-c). La parte del complejo portal que sobresale de la cápside permite la unión del dodecámero de las proteínas adaptadoras (gp11). El complejo adaptador proporciona seis sitios de unión para las fibras de cola larga, cada uno de los cuales está formado por un trímero de proteínas proximales de fibra de cola larga (gp12) y un trímero de proteínas distales de fibra de cola larga (gp13) (Figs. 1c, 2a, c) . Un hexámero de proteínas de boquilla (gp17) se une al complejo adaptador y permite la unión de seis fibras de cola corta, trímeros de proteína de fibra de cola corta (gp16) (Fig. 2a, c). La aguja de la cola, que está formada por tres cadenas polipeptídicas (gp18), sobresale del canal central formado por las proteínas de la boquilla (Figs. 1a–c y 2a, c).

a Representación superficial del mapa crio-EM compuesto del virión del fago SU10 coloreado según el tipo de proteína. La principal proteína de la cápside (gp9) se muestra en turquesa, proteína portal (gp6) en magenta, proteína adaptadora (gp11) en amarillo, fibras de cola larga (gp12) en violeta, proteína de boquilla (gp17) en rojo, fibras de cola corta (gp16 ) en verde y aguja de cola (gp18) en azul claro. La longitud del virión es de 1590 Å. Para obtener detalles sobre la construcción del mapa compuesto, consulte la sección Materiales y métodos. b Igual que A, pero se eliminó la mitad frontal del mapa compuesto de la cabeza SU10 para mostrar la estructura del genoma en gris. El recuadro muestra un promedio de clase 2D del virión SU10. La barra de escala indica 45 nm. c Mapa crio-EM compuesto de complejos de portal y cola del virión SU10. La longitud del complejo es de 540 Å. D Cryo-EM reconstrucción de complejos de portal y cola a partir de un intermediario de liberación del genoma SU10. e Mapa crio-EM compuesto del intermedio de liberación del genoma de SU10. Se eliminó la mitad frontal de la cabeza para mostrar la estructura del genoma que quedaba en la cápside. El recuadro muestra un promedio de clase 2D del intermediario de liberación del genoma SU10. f Representación esquemática del segmento del genoma SU10 que codifica proteínas estructurales con el mismo código de color que las proteínas en los paneles a a e. Las proteínas que se muestran en blanco no son estructurales o no se identificaron en las reconstrucciones.

Representaciones de dibujos animados de proteínas que forman la cola del virión SU10 a, c y el intermediario de liberación del genoma b, d. La proteína portal (gp6) se muestra en magenta, la proteína adaptadora (gp11) en amarillo, la proteína de fibra de cola larga (gp12) en violeta, la proteína de boquilla (gp17) en rojo, la proteína de fibra de cola corta (gp16) en verde y la cola de aguja proteína (gp18) en azul claro. vistas a, b perpendiculares al eje de la cola y vistas c, d a lo largo del eje de la cola hacia la cabeza del fago. En el virión SU10, las fibras de la cola corta están inclinadas hacia la cápside y la aguja de la cola sobresale del complejo de la cola. El intermediario de liberación del genoma de SU10 b, d carece de la aguja de cola y contiene una boquilla de 277 Å de largo formada por fibras de cola cortas y proteínas de boquilla. La aguja de la cola y el dominio central y de unión al receptor de la fibra de la cola corta se modelaron usando el multímero AlphaFold2 y se ajustaron al mapa crio-EM. Las estructuras restantes se construyeron en reconstrucciones crio-EM. Para obtener detalles sobre la construcción y la predicción de la estructura, consulte la sección Materiales y métodos.

La cápside alargada de SU10 está organizada con simetría quíntuple y está construida a partir de 715 copias de la proteína de la cápside principal organizada con los parámetros de triangulación Tend = 4, Tmid = 20 (Fig. 3a, Fig. 1, 2 complementaria). La principal proteína de la cápside forma capsómeros de dos tipos: pentámeros y hexámeros. La parte tubular central de la cápside está formada por 90 hexámeros dispuestos en nueve capas de una hélice de diez entradas (Fig. 3a). La cápside está cerrada en ambos extremos con tapas formadas por las principales proteínas de la cápside organizadas con simetría cuasi-icosaédrica local T = 4. El cierre de las tapas está habilitado por pentámeros, que están doblados en contraste con los hexámeros más planos (Fig. 3a, Fig. 1 complementaria). Sin embargo, la formación de la cabeza alargada SU10 también requiere una variación en la forma de los hexámeros y en los ángulos en los que interactúan. Los hexámeros de las tapas están más doblados (H4, H5; 149-150°), mientras que los que forman la parte tubular de la cápside son relativamente planos (H1, H2L, H2R, H3; 154-164°) (Fig. 2). Todas las interfaces hexámero-hexámero y hexámero-pentámero en las tapas están arqueadas (145°) (Fig. 2A complementaria), sin embargo, los hexámeros que forman la parte tubular de la cápside están conectados por dos tipos de interfaces, arqueadas (145°) y más plano (160 °) (Fig. 2 complementaria). Las interfaces arqueadas permiten la formación de anillos de hexámeros, mientras que las más planas median en las interacciones entre los anillos (Fig. 2 complementaria).

una representación de dibujos animados de proteínas que forman el virión del fago SU10. La cápside alargada tiene una simetría quíntuple y las proteínas de la cápside están organizadas con los parámetros de Tend = 4, Tmid = 20. Los pentámeros de las proteínas de la cápside se muestran en naranja, los hexámeros en cian oscuro o verde mar claro. Los pentámeros son de dos tipos, según su posición en la cápside. El pentámero P1 se coloca en el eje quíntuple de la partícula, mientras que los pentámeros P2 restantes se colocan en ejes casi quíntuples en los bordes entre la parte tubular de la cápside y las tapas. Hay seis variantes de hexámeros: H1 que forman la parte central de la cabeza alargada; H2L y H2R pertenecen a la parte central de la cápside pero interactúan con las tapas terminales; H3 están entre los pentámeros P2; H4 están entre los pentámeros P1 y P2; y H5 están entre los pentámeros P2 y el complejo portal. b Comparación de las estructuras de las principales proteínas de la cápside que forman el hexámero H1 (coloreado según los dominios) y el pentámero P1 (blanco). La principal proteína de la cápside de SU10 tiene un pliegue HK9725,66. Las principales diferencias en las estructuras de las subunidades P1 y H1 están en el brazo N-terminal, el bucle extendido y el bucle anular. La organización del dominio de la principal proteína de la cápside se muestra como un gráfico 1D. c Representación de dibujos animados de las principales proteínas de la cápside que forman el pentámero P2 y el hexámero H2R. Dos proteínas principales de la cápside que median la mayoría de los contactos entre el pentámero y el hexámero se muestran con dominios resaltados en color. Las subunidades restantes se muestran alternando blanco y gris oscuro. Los bucles G de todas las subunidades están resaltados en magenta.

La principal proteína de la cápside de SU10 tiene un pliegue HK97, que es común entre los bacteriófagos con cola y los herpesvirus (Fig. 3b)25. De acuerdo con la convención, la proteína de la cápside se puede dividir en el brazo N-terminal, el dominio periférico, el bucle extendido, el dominio axial y el bucle rico en glicina (Fig. 3b). La principal diferencia entre las proteínas de la cápside que forman hexámeros y pentámeros está en la estructura del bucle anular colocado en la punta del dominio axial (Fig. 3b). En los hexámeros, el bucle anular sobresale del dominio axial (Fig. 3b, c). Los seis bucles anulares de las subunidades que forman un hexámero forman un anillo alrededor de su eje casi séxtuple (Fig. 3c). Por el contrario, en las subunidades que forman pentámeros, el bucle anular se dobla 90 ° hacia el centro de la cápside (Fig. 3c). Las hebras beta de los bucles de las principales proteínas de la cápside de un pentámero forman un barril beta con un poro central con un diámetro de 8 Å que penetra a través de la cápside. (Fig. 3c, Fig. 3G complementaria). El poro puede servir para el paso de iones y moléculas de agua desde y hacia la cápside durante el empaquetamiento y la eyección del genoma.

El genoma de SU10 codifica una proteína (gp10) con un pliegue similar a la inmunoglobulina previsto similar al de la proteína de la cápside menor del fago Epsilon15 y el dominio N-terminal de la proteína de la fibra de la cabeza del bacteriófago φ2926,27. Sin embargo, la reconstrucción crio-EM de la cabeza SU10 no contiene la densidad correspondiente a las proteínas menores de la cápside. Es posible que gp10 de SU10 tenga una función diferente o se una a la cápside con poca afinidad y se haya perdido durante la purificación del fago (Fig. 4C complementaria).

La densidad crio-EM del genoma en el virión SU10 se resolvió en reconstrucciones simétricas y asimétricas quíntuples de su cabeza (Fig. 1b, Fig. 3 complementaria). A pesar de las diferencias en las simetrías impuestas durante los procesos de reconstrucción, los arreglos de las densidades del genoma son similares (Fig. 3A-D complementaria). Se pueden distinguir nueve capas de densidad dentro de la parte tubular de la cabeza, mientras que solo cuatro capas se resuelven debajo de las tapas de la cápside (Fig. 3 complementaria). En las tres capas más externas, la densidad se separa en hebras, que pueden interpretarse como segmentos de ADN de doble hebra (Fig. 3A-D, F complementaria). La estructura resuelta del genoma en la reconstrucción crio-EM indica que el empaquetado del genoma da como resultado un ordenamiento similar del ADN en la mayoría de los viriones SU10. Sin embargo, no se resuelven los enlaces entre los segmentos de ADN en la parte central de la cabeza SU10, que deben existir porque el genoma está formado por un único ADN2 bicatenario de 77.325 pb de longitud. Tanto en las reconstrucciones simétricas como asimétricas de cinco veces de la cabeza SU10, las hebras de ADN en las dos capas más externas están organizadas como hélices de diez entradas (Fig. 3B, D complementarias). Las hebras de ADN de la capa más externa del genoma se curvan para evitar que los barriles beta sobresalgan de los pentámeros de las proteínas de la cápside (Fig. 3G complementaria). La intrigante organización del ADN puede usarse como restricciones adicionales en futuros estudios del proceso de empaquetamiento del genoma del fago mediante simulaciones por computadora.

Las proteínas gp20-24 están presentes en el virión SU10, pero están ausentes del intermediario de liberación del genoma, lo que indica que son proteínas de eyección (Fig. 4C complementaria, Tabla 1 complementaria). Sin embargo, la reconstrucción del virión SU10 no contiene densidad resuelta que podría atribuirse a las supuestas proteínas de eyección (Fig. 1b), como es el caso de los fagos con cola T7, Epsilon15 y N417,18,28. El genoma de SU10 está empaquetado en la cápside con una densidad de 0,48 Da/Å3, que es comparable a los 0,49–0,52 Da/Å3 determinados previamente para los bacteriófagos P22, lambda, T4, ϕ29 y T729. Por lo tanto, la cápside de SU10 podría contener tanto ADN genómico como proteínas de eyección.

El complejo portal de SU10 está incrustado en la cápside en uno de sus vértices quíntuples, donde reemplaza un pentámero de proteínas de la cápside (Figs. 1a, b, 4a). La proteína portal de SU10 se puede dividir en los dominios de ala, tallo, clip, corona y barril (Fig. 4b)29. El dominio del ala es el más grande y está formado por ocho hélices y un sándwich β que contiene dos hojas β de cinco y tres cadenas β antiparalelas (Fig. 4b). Las cadenas laterales cargadas positivamente de Lys3 y Lys5 del dominio del ala interactúan con el ADN que envuelve el complejo portal (Fig. 4a). Las dos lisinas se repiten doce veces en el complejo portal y, por lo tanto, forman una interfaz de alta avidez que probablemente se una al ADN poco después de que se inicie el empaquetamiento del genoma. Anclar el extremo del ADN al portal influiría en el empaquetamiento del genoma en la cabeza y su estructura final. Además, el dominio del ala media las interacciones del complejo portal con la cápside (Fig. 4a, c). Debido a la falta de coincidencia de la simetría quíntuple de la cápside y la simetría doce veces del portal, caracterizamos sus interacciones mediante una reconstrucción asimétrica de la región del cuello del virión SU10, que alcanzó una resolución de 4,6 Å (Tabla complementaria 2). Los residuos 8–44 del dominio del ala forman una hélice α curva que recubre la cara interna de la cápside (Fig. 4a, b). Las interacciones adicionales entre el portal y la cápside están mediadas por el bucle del tallo del dominio del ala (Fig. 4a, b). El bucle del túnel del dominio del ala estrecha el canal del portal de SU10 a 33 Å (Fig. 4, Fig. 5 complementaria). En los fagos T7 y P23-45, se demostró que los bucles del túnel abren el canal portal y, por lo tanto, regulan la liberación del genoma15,30. Sin embargo, los bucles de túnel en el virión SU10 y el intermediario de liberación del genoma tienen la misma estructura, por lo que es probable que un mecanismo diferente asegure la retención del genoma de SU10 (Fig. 5 complementaria). El dominio del tallo conecta los dominios del ala y el clip y se extiende a lo largo de la cubierta de la cápside (Fig. 4b). El dominio de clip del complejo portal se extiende desde la cápside y permite la unión de las proteínas adaptadoras (Fig. 4a).

una Representación de dibujos animados del complejo portal incrustado en la cápside. Una proteína portal se muestra en magenta y las subunidades restantes en blanco y gris alternados. La densidad crio-EM de la cápside se muestra en turquesa y la del ADN en gris. La densidad de un extremo putativo del genoma dsDNA o de las proteínas de eyección dentro del barril del complejo portal se muestra en naranja. Los mapas de la cápside y el ADN se muestran en 2σ y 4σ, respectivamente. b Representación de dibujos animados de una subunidad de proteína portal coloreada según la composición del dominio. La organización del dominio de la proteína portal se muestra como un gráfico 1D. c Interacciones del complejo portal con la cápside, vistas a lo largo del eje de la cola desde el exterior de la partícula. Las proteínas del portal se muestran alternando rosa y púrpura, las proteínas de la cápside se muestran en turquesa oscuro y claro. Las direcciones de las hélices de la columna de los dominios periféricos de las principales proteínas de la cápside y las hélices N-terminales de los dominios de las alas de las proteínas del portal se resaltan con flechas para enfatizar la falta de coincidencia entre la simetría quíntuple de la cápside y la simetría doce veces del portal.

El dodecámero de las proteínas adaptadoras SU10 forma la interfaz entre el dodecámero de las proteínas portales y el hexámero de las proteínas de boquilla (Figs. 1c, 2a y 5). La proteína adaptadora de SU10 tiene la misma organización de dominio que las de los fagos T7 y KP32: un dominio de haz helicoidal, un dominio de acoplamiento de fibra de cola larga y un bucle envolvente (Fig. 5c)15. Un bucle envolvente de proteína adaptadora se encaja entre los dominios de clip de un par de proteínas portales vecinas y se une a los bucles de tallo de dos proteínas portales adicionales colocadas en el sentido de las agujas del reloj cuando se observa el complejo portal desde fuera de la cápside (Fig. 5f). Los dominios de muelle de fibra de cola larga de dos proteínas adaptadoras vecinas difieren en estructura porque interactúan con diferentes partes de una fibra de cola larga (Fig. 5a, b, d). El dominio de muelle de fibra de cola larga SU10 es similar a los de los fagos T7 y KP32 (Fig. 6 complementaria) 15,31, que tienen fibras de cola larga 13,32. Por el contrario, las proteínas adaptadoras de los fagos P22 y Sf6, que no tienen fibras de cola larga, carecen de los dominios de acoplamiento de fibras de cola larga (Fig. 6 complementaria)12,27.

a, b Representación de dibujos animados del complejo adaptador decorado con seis fibras largas de la cola vistas a lo largo y perpendicular al eje de la cola. Dos proteínas adaptadoras seleccionadas del dodecámero están resaltadas en naranja y amarillo. Las subunidades restantes se muestran alternando blanco y gris. Cada una de las seis fibras de cola larga está formada por un trímero de proteínas gp12 (violeta). c Superposición de estructuras de dos proteínas adaptadoras vecinas que difieren en la conformación de sus bucles de muelle de fibra de cola larga. Una de las proteínas adaptadoras está coloreada según la composición del dominio. La subunidad superpuesta se muestra en blanco. La organización del dominio de la proteína adaptadora se muestra como un gráfico 1D. d Interacciones de proteínas adaptadoras con fibra de cola larga. Los bucles de acoplamiento de fibra (verde) de dos proteínas adaptadoras vecinas interactúan con una fibra de cola larga. Las tres subunidades que forman la fibra de la cola larga se diferencian por tonos de violeta. El extremo N de cada proteína de fibra de cola larga de una fibra de cola larga forma interacciones únicas con el complejo adaptador. e Interacciones del complejo adaptador con la cápside vistas a lo largo del eje de la cola desde el exterior de la partícula. Las proteínas adaptadoras se muestran alternando amarillo y naranja, las proteínas de la cápside se muestran en tonos turquesa. Las direcciones de las hélices de la columna vertebral de los dominios periféricos de las principales proteínas de la cápside y los bucles de acoplamiento de fibra de las proteínas adaptadoras se indican con flechas para enfatizar el desajuste de simetría entre la cápside y el complejo adaptador. f Interfaz entre las proteínas portales y los bucles C-terminales que abarcan las proteínas adaptadoras. El lazo envolvente (naranja) va entre los dominios del clip del portal de la subunidad del portal A (gris) y B (blanco), luego cruza el tallo de la subunidad del portal C (magenta oscuro) y se extiende entre el lazo del ala (cian) de la subunidad C y tallo de la subunidad D (rosa). Las proteínas adaptadoras vecinas difieren en las estructuras de sus bucles envolventes. El bucle que abraza (amarillo) de la proteína adaptadora con la otra conformación pasa entre los dominios del clip portal de las subunidades portal B (blanco) y C (magenta oscuro), luego cruza el tallo de la subunidad portal D (rosa) y alcanza entre el lazo del ala (azul claro) de la subunidad D (gris) y tallo de la subunidad E (rosa).

Seis fibras de cola larga están unidas a los lados del complejo adaptador (Figs. 1a–c, 2a y 5a, b). La fibra de cola larga de SU10 está formada por trímeros de proteínas proximales (gp12) y distales (gp13) de fibra de cola larga. Una fibra de cola larga se ramifica desde el dominio del haz helicoidal de cada segunda subunidad del complejo adaptador (Figs. 2a, c y 5a, b). Los terminales N de dos proteínas proximales de fibra de cola larga de una fibra se extienden para cubrir la superficie del dominio del haz de hélice de la proteína adaptadora vecina ubicada en sentido contrario a las agujas del reloj cuando se observa el complejo adaptador desde fuera de la cápside (Fig. 5b, d). El extremo N de la tercera proteína proximal de fibra de cola larga se une al dominio de acoplamiento de fibra de cola larga de la proteína adaptadora de la que se ramifica la fibra (Fig. 5d). Las fibras de cola larga forman contactos adicionales con los bucles de acoplamiento de fibra que sobresalen radialmente de los dominios de acoplamiento de fibra de las proteínas adaptadoras (Fig. 5a, c, d). La parte enrollada-enrollada de cada fibra de cola larga está sujeta por bucles de muelle de fibra de dos proteínas adaptadoras vecinas (Fig. 5a, d). La reconstrucción crio-EM de la cola permitió la construcción de 90 residuos del extremo N de la proteína proximal de fibra de cola larga de 786 residuos (Figs. 2a, c y 5a, b). El resto de la fibra de cola larga no se resolvió, probablemente debido a su flexibilidad. Las micrografías electrónicas de los fagos purificados muestran que la fibra de la cola larga tiene una longitud de 700 Å y contiene una articulación del codo, que divide la fibra en segmentos de 300 y 400 Å de longitud (Fig. 4a, b complementarias).

El hexámero de las proteínas de la boquilla, unido al adaptador, está decorado con seis fibras de cola corta y su canal central está tapado con una aguja de cola (Figs. 1a–c, 2a, c y 6). De acuerdo con la convención establecida para el fago T715, la proteína de boquilla de SU10 se puede dividir en los dominios de plataforma, hélice beta y boquilla (Fig. 6a-c). Sin embargo, las proteínas de boquilla de SU10 y T7 no muestran similitud de secuencia detectable.

Representación de dibujos animados del hexámero de proteínas de boquilla con fibras de cola cortas unidas del virión SU10 visto desde fuera de la partícula a lo largo (a) y perpendicular (b) al eje de la cola. Las proteínas de la boquilla se muestran alternando blanco y gris, y las fibras de la cola corta en verde. Una de las proteínas de la boquilla está resaltada en color, con el dominio de la plataforma en naranja, el dominio de la hélice beta en azul, el muelle de fibra de cola corta en magenta y cuatro dominios de la boquilla en rojo. La punta de flecha negra en el panel (b) muestra la interacción del dominio de boquilla 4 y la fibra de cola corta. c Comparación de las estructuras de las proteínas de boquilla y las fibras de cola corta en el virión SU10 y el intermediario de liberación del genoma. La proteína de la boquilla del virión está coloreada como en los paneles ayb, y las tres subunidades gp16 que forman una fibra de cola corta se distinguen por tonos de verde. Las estructuras superpuestas de la proteína de boquilla y la fibra de cola corta del intermediario de liberación del genoma se muestran en blanco y verde claro, respectivamente. La organización del dominio de la proteína de boquilla se muestra como un gráfico 1D. d Comparación de las estructuras de los dominios de la hélice beta de las proteínas de boquilla del virión SU10 y el intermediario de liberación del genoma, que se muestran en los colores del arco iris y en blanco, respectivamente. El dominio de la hélice beta de siete palas tiene el color del arco iris desde el extremo N en azul hasta el extremo C en rojo. El bucle de muelle de fibra de cola corta es una extensión de la hoja 1 (β1), mientras que los dominios de la boquilla se insertan entre la hoja 2 (β2) y la hoja 3 (β3). e Interacciones del bucle de muelle de fibra corta (magenta) con tres proteínas de fibra de cola corta (tonos de verde). Las cadenas laterales de Trp839, Trp847 y Trp857 del bucle de muelle de fibra corta forman una estrella con simetría casi triple, lo que permite la unión de la fibra de cola corta, que es un trímero. Los residuos Tyr23, Ile24 y Tyr25 de cada proteína de fibra de cola corta sujetan un segmento del bucle de fibra antes de cada uno de los triptófanos.

El dominio de la plataforma tiene un pliegue de sándwich beta con las dos hojas beta formadas por cinco y tres cadenas beta, respectivamente (Fig. 6c). El dominio de la plataforma de cada proteína boquilla interactúa con los dominios del haz de hélice de dos proteínas adaptadoras adyacentes. Las distintas interacciones de las proteínas de boquilla solo inducen diferencias mínimas en la estructura de las proteínas adaptadoras vecinas.

El dominio de la hélice beta de siete palas tiene un diámetro de 50 Å y forma el núcleo de la proteína de la boquilla (Fig. 6d). Las palas 4, 5 y 6 del dominio de la hélice beta bordean el canal de la cola, mientras que las palas 1, 2 y 3 están distantes del eje de la cola. El dominio beta-hélice está interrumpido por dos puntos de entrada y salida de la cadena principal del polipéptido, los llamados orificios. La primera abertura en la hoja 1 incluye la entrada de la cadena principal desde la parte N-terminal del dominio de la plataforma y la salida de la cadena principal a la parte C-terminal del dominio de la plataforma (Fig. 6d). La estructura de la pala 1 de la hélice beta está estabilizada por la interacción antiparalela de la hebra beta más externa, que está formada por residuos C-terminales del dominio, con las hebras restantes formadas por residuos del extremo N-terminal del dominio. , un llamado cierre de velcro (Fig. 6d)33. La segunda apertura es causada por la inserción de dominios de toberas entre las palas de hélice beta 2 y 3 (Fig. 6d). Los bucles que sobresalen de los bordes de las cuchillas 4 y 5 permiten el atado de la aguja de cola. Los bucles tienen diferentes conformaciones en el intermedio de liberación del genoma, lo que da como resultado la ampliación del diámetro del canal de la cola de 25 a 31 Å (Fig. 5 complementaria). El bucle de acoplamiento de fibra de cola corta está ubicado en el borde de la hoja 1 del dominio de la hélice beta y permite la unión de una fibra de cola corta (Fig. 6c-e).

En el virión SU10, los dominios de boquilla similares a Ig están organizados en forma de L (Figs. 2a, 6a–c). Los primeros dos dominios de boquilla forman una punta roma de la cola, luego hay un giro de 82 ° y los dos dominios restantes apuntan hacia la cápside (Fig. 6c). Los contactos entre las proteínas de la boquilla están mediados por la plataforma y los dominios beta-hélice. Además, los dominios de la boquilla envuelven la cola, y el dominio de la boquilla 1 interactúa con los dominios de la boquilla 2 y 3 de la proteína de la boquilla ubicada en el sentido de las agujas del reloj cuando se mira la cola a lo largo de su eje hacia la cápside (Fig. 6a, b). El dominio 4 de la boquilla interactúa con el bucle de acoplamiento de fibra de cola corta de la proteína de la boquilla ubicada en el sentido contrario a las agujas del reloj (Fig. 6a, b). Las múltiples interacciones de los dominios de boquilla estabilizan la estructura nativa de la cola SU10.

La fibra de cola corta de SU10 tiene una longitud de 210 Å, es recta y se puede dividir en dominios proximal, central y de unión al receptor (Figs. 2, 6a-c, Fig. 7 complementaria). El dominio proximal se reconstruyó a una resolución de 3.8 Å, lo que permitió la construcción de los primeros 98 residuos de gp16 (Fig. 6a-c, Fig. 7 complementaria). Las hélices alfa que forman el dominio proximal están interrumpidas por bucles cortos que median el intercambio de posiciones de las hélices de subunidades individuales dentro del dominio (Fig. 7 complementaria). Los dominios central y de unión al receptor modelados con el programa AlphaFold2 multimer podrían ajustarse a las reconstrucciones crio-EM de resolución de 7 y 15 Å, respectivamente, con un coeficiente de correlación en el espacio real de 0,81 (Fig. 7A complementaria)34. El dominio central es similar a la punta de la fibra de la cola corta del fago T4 (PDB: 1PDI) (Fig. 7 complementaria) 35,36, mientras que el dominio de unión al receptor se parece a la punta de la fibra de la cola larga del fago T4 (PDB : 2XGF), que reconoce los lipopolisacáridos o la proteína C de la porina de la membrana externa (Fig. 7 complementaria)36. Además, tanto el dominio central como el de unión al receptor son similares a las partes correspondientes de la proteína de unión al receptor del bacteriófago templado JUB59 (PDB: 6OV6) (Fig. 7 complementaria)37. La proteína de fibra de cola corta SU10 contiene dos pares de histidinas (His194 e His196, His230 e His232), que pueden unirse a los iones Fe2+ y así estabilizar la fibra, como ocurre en T4 y JUB5936,37,38,39.

La fibra de cola corta se une a un lazo de muelle de fibra desde una proteína de boquilla (Fig. 6c, e). El bucle de muelle de fibra contiene triptófanos 839, 847 y 857, cuyas cadenas laterales están dispuestas en una simetría pseudo-triple (Fig. 6e). Cada cadena lateral de triptófano forma interacciones hidrofóbicas con Ile24 de una de las tres proteínas de fibra de cola corta (Fig. 6e). Además, las cadenas laterales de Tyr23, Ile24 y Tyr25 de cada fibra de cola corta sujetan un segmento del polipéptido antes que los triptófanos del bucle de acoplamiento de fibra (Fig. 6e). Los residuos 3–6 de la fibra de cola corta interactúan con los residuos 303–308 del dominio 4 de la boquilla de la proteína de la boquilla ubicada en el sentido de las agujas del reloj cuando se mira a lo largo del eje de la cola hacia la cápside (Fig. 6b). La posición de la fibra de cola corta se estabiliza adicionalmente por la interacción del dominio central de la fibra de cola corta con los residuos 71–78 de la fibra de cola larga (Figs. 1c, 2a, c). Es probable que la interrupción de estas interacciones permita la coordinación de los cambios conformacionales de las fibras de la cola larga y corta, así como los de las proteínas de la tobera, tras la unión de SU10 a la célula huésped.

La estructura de la aguja de cola SU10 con simetría triple impuesta se reconstruyó a una resolución de 15 Å (Figs. 1a-c, 2a, c, Fig. 8 complementaria). La estructura de la aguja de la cola, predicha por el multímero Alphafold2, puede dividirse en dominios de bobina enrollada y C-terminal, y podría ajustarse a la densidad crio-EM con un coeficiente de correlación de espacio real de 0,80 (Fig. 8A complementaria, B). El dominio de bobina enrollada de la aguja de la cola SU10 es homólogo a la aguja de la cola del fago P2214, que se demostró que se dobla hasta 18°40. Por lo tanto, esperamos que la aguja de la cola del SU10 sea igualmente flexible, lo que puede ser la razón por la que no pudimos resolverlo en alta resolución. El dominio C-terminal tiene una estructura de prisma beta similar a la de los picos centrales de la cola de los fagos Myoviridae (Fig. 2a, c, Fig. 8A, B complementaria) 38,41,42. La unión de la aguja de la cola SU10 al canal de la cola está habilitada por dos bucles en la hoja 4 y un bucle en la hoja 5 del dominio beta-hélice de las proteínas de la boquilla (Fig. 8C, D complementarias). La aguja de la cola de 260 Å de largo sobresale 200 Å del complejo de la boquilla (Figs. 1c, 2a, c).

La cápside del intermediario de liberación del genoma de SU10 es idéntica a la del virión (Fig. 1, Tabla complementaria 3). La inducción de la liberación del genoma SU10 in vitro por choque osmótico da como resultado la eyección incompleta del ADN del fago (Fig. 4 complementaria). La reconstrucción de la cabeza del intermedio de liberación del genoma SU10 contiene anillos de supuesta densidad de ADN unidos a la cara interna de la cápside (Fig. 1e, Fig. 9 complementaria). Aunque la densidad del ADN en la reconstrucción del intermediario de liberación del genoma está organizada en anillos, lo más probable es que el ADN que queda dentro de la cabeza sea una única hebra continua. Los anillos son artefactos causados ​​por la combinación de la variabilidad estructural de los segmentos de ADN en partículas individuales y su desalineación durante el proceso de reconstrucción. Es probable que la propensión de la cápside SU10 a organizar cadenas de ADN, como se observa en el intermediario de liberación del genoma, influya en la estructura del genoma durante el empaquetamiento.

La reconstrucción asimétrica de la tapa de la cápside sin cola contiene una capa esférica de densidad con un diámetro exterior de 80 Å y un grosor de pared de 15 Å (Fig. 9C, E complementaria). Esta esfera de densidad también es visible en los promedios de clase bidimensionales de los intermediarios de liberación del genoma (Fig. 9F complementaria). La esfera no está centrada en el eje de simetría quíntuple de la cápside, sino que está conectada por una densidad al barril beta formado por bucles anulares de las principales proteínas de la cápside de un pentámero (Fig. 9E complementaria). La posición de la capa esférica de densidad deja un borde del pentámero accesible para unir el ADN (Fig. 9C complementaria). La reconstrucción asimétrica del virión SU10 no contenía esta capa esférica de densidad, sin embargo, es posible que la fuerte señal del genoma impidiera la alineación asimétrica requerida para resolver la estructura de la esfera. No está claro qué forma la capa esférica de densidad observada. El radio de la esfera es demasiado pequeño para que esté formado por dsDNA43 doblado. Por lo tanto, es probable que la cubierta esférica esté formada por proteínas.

La cola del intermedio de liberación del genoma SU10 se reorganiza en la boquilla construida a partir de proteínas de boquilla y fibras de cola corta (Figs. 2c, d, 6c, Fig. 5 complementaria, Película complementaria 1). Para formar la boquilla, los cuatro dominios de la boquilla experimentan un cambio estructural extenso desde la forma de L en el virión SU10 hasta la disposición recta en el intermediario de liberación del genoma (Fig. 6c). En la nueva conformación, los cuatro dominios forman una línea que se aleja del complejo del portal. Si bien se conserva la interacción del bucle de fibra de cola corta con una fibra de cola corta, las conexiones del bucle de fibra de cola corta con el dominio beta-hélice giran entre sí y se doblan 135° para alejarse de la cabeza del fago (Fig. 6c, d). La misma rotación es realizada por la fibra de cola corta. En la nueva disposición, las proteínas de la boquilla y las fibras de la cola corta se alternan para formar una boquilla que prolonga la cola en 277 Å (Figs. 1d, 2b, d). Además, la parte distal del dominio beta-hélice de la proteína de la boquilla se aleja 3 Å del eje de la cola, lo que da como resultado una ampliación del canal de la cola (Fig. 6c, Fig. 8C, D complementaria). Se requiere la formación de la boquilla para llevar los dominios de unión al receptor de las fibras de cola corta a una posición en la que puedan interactuar con la membrana externa de E. coli.

Los tomogramas de E. coli infectada con SU10 demuestran que múltiples fagos pueden unirse y entregar sus genomas en una célula (Fig. 7a, Fig. 10 complementaria, Película complementaria 2). Algunos de los fagos solo estaban unidos por fibras de cola larga, mientras que las colas de los fagos restantes formaban boquillas (Fig. 7a, Fig. 10 complementaria). Además, los fagos con boquillas se encontraban en varias etapas de liberación del genoma, desde cabezas llenas hasta cabezas vacías. Las partículas vacías permanecieron adheridas a la superficie celular (Fig. 7a, Fig. complementaria 10D-F). En las últimas etapas de la infección SU10, la muestra contenía vesículas de membrana externa con partículas de fago unidas (Fig. 7a, Fig. 10J-L complementaria). Las vesículas de membrana pueden ser eliminadas por bacterias que crecen en cultivos planctónicos44,45,46. Bajo las condiciones de cultivo de E. coli utilizadas en nuestros experimentos, numerosos viriones de progenie se ensamblaron en las células infectadas de 45 a 65 minutos después de la infección (Fig. 10J-L complementaria). Las pocas partículas formadas inicialmente se distribuyeron al azar, sin embargo, con el tiempo después de la infección, los viriones de la progenie se ensamblaron en conjuntos regulares, como se describió anteriormente2.

un segmento de célula de E. coli infectada 45 minutos después de la infección contiene fagos SU10 en varias etapas del ciclo de infección. Los viriones fuera de la célula se muestran en turquesa, los intermediarios de liberación del genoma con boquillas formadas en azul oscuro, las partículas vacías en cian y los viriones de la progenie dentro de la célula en rojo. Las membranas celulares internas y externas se destacan en naranja oscuro y naranja respectivamente, las vesículas en naranja claro, los ribosomas en azul claro, la matriz de quimiorreceptores en verde y el flagelo en violeta. Las posiciones de las partículas de fago, los ribosomas (EMD-13270) y la matriz de quimiorreceptores (EMD-10160) se identificaron utilizando la coincidencia de plantillas como se implementó en EMclarity64,65, y las estructuras de alta resolución correspondientes se colocaron en el tomograma. b Esquema del virión SU10. c Mecanismo de unión de SU10 y entrega del genoma. (1) El virión SU10 se adhiere a la superficie celular a través de fibras de cola larga. (2) La unión de las seis fibras de la cola larga coloca al fago con su eje longitudinal perpendicular a la membrana bacteriana. La aguja de la cola puede interactuar con la membrana exterior. (3) Las fibras de la cola corta giran hacia la membrana celular y las proteínas de la tobera se enderezan para formar una tobera. (4) La aguja de la cola se disocia de la cola. Las proteínas de eyección se liberan de la cabeza del fago, degradan el peptidoglucano de la pared celular y extienden la boquilla del fago para formar un canal a través del periplasma. Se inicia la eyección de ADN SU10 en el citoplasma bacteriano. (5) La partícula vacía permanece asociada a la célula.

Las imágenes confocales de Airyscan de células de E. coli con membranas y genomas marcados, que fueron infectadas por SU10 con ADN marcado, verificaron que numerosas partículas de fago se unen y entregan sus genomas en una célula (Fig. 10C-F complementaria). La señal de fluorescencia del ADN del fago marcado fue detectable en el citoplasma celular hasta la lisis celular, e incluso se incorporó a los viriones de la progenie (Figura complementaria 10I, L). Las células infectadas conservaron su unidad de forma nativa 45 minutos después de la infección, sin embargo, a los 65 minutos perdieron la turgencia (Fig. 10J-L complementaria).

La unión inicial del virión SU10 a los receptores en la membrana externa de E. coli está mediada por fibras de cola larga, que tienen dominios de unión al receptor en sus extremos distales (Fig. 7b, c). Las estructuras del virión SU10 y el intermediario de liberación del genoma difieren en la dirección en la que las fibras de cola larga apuntan lejos de los complejos adaptadores (Fig. 2c, d). Las fibras de cola larga en el intermediario de liberación del genoma se giran 6,6° con respecto a su orientación en el virión. Especulamos que, en condiciones nativas, este cambio conformacional es inducido por la unión del fago a la membrana bacteriana. Además, el movimiento de las fibras de cola larga probablemente interrumpe sus interacciones con las fibras de cola corta y, por lo tanto, las prepara para la formación de la boquilla de cola. La unión de las seis fibras de cola larga SU10 a los receptores posiciona el fago con su eje largo perpendicular a la membrana bacteriana (Fig. 7a, c). La supuesta interacción de la aguja de la cola con la membrana bacteriana desencadena cambios conformacionales en las proteínas de la boquilla, lo que conduce a la interrupción de la interacción del dominio cuatro de la boquilla con la fibra corta de la cola. Disponiéndose en una línea recta paralela al eje de la cola, los dominios de la boquilla dejan espacio para la rotación de 135° de las fibras cortas de la cola para alejarse de la cabeza del fago. Las fibras de cola corta y las proteínas de la boquilla se alternan para formar una boquilla de 277 Å de largo (Fig. 7c). La formación de la boquilla permite que los dominios de unión al receptor predichos de las fibras de cola corta interactúen con los receptores en la superficie celular. La unión de las fibras de la cola corta a los receptores puede obligar a la aguja de la cola, que sobresale de la boquilla, a atravesar la membrana externa de E. coli. Posteriormente, la aguja de la cola se disocia de la cola para permitir la apertura del canal de la cola (Fig. 7c). Las proteínas de eyección probablemente se expulsan de la cabeza SU10 antes o junto con el comienzo del genoma. Las proteínas de eyección forman un canal de translocación a través del espacio periplásmico y la proteína de eyección gp20, con actividad transglucosilasa, degrada el peptidoglucano de la pared celular. El genoma del fago se entrega al citoplasma de E. coli a través de un canal formado por la boquilla y el canal de translocación (Fig. 7c).

El fago SU10 se propagó en la cepa ECOR10 de E.coli, cultivada a 37 °C en caldo nutritivo (Oxoid). El lisado de fago de 300 ml de cultivo bacteriano se trató con turbonucleasa (Abnova) (concentración final de 5 unidades/ml), se centrifugó a 6000 x g durante 20 min a 4 °C y se filtró a través de un filtro de jeringa de polietersulfona de 0,45 μm. Los fagos del filtrado se sedimentaron mediante centrifugación a 54 000 x g durante 2,5 ha 4 °C en un rotor de 50,2 Ti (Beckman Coulter). Los sedimentos de fago se disolvieron mediante incubación durante la noche en 6 ml de un tampón de fago (Tris-Cl 50 mM, NaCl 10 mM, CaCl2 10 mM, pH 8,0) a 4 °C. Los sedimentos disueltos se superpusieron en un gradiente de densidad de CsCl escalonado (3 ml de cada solución de CsCl en tampón de fago con densidades de 1,45 g/ml, 1,50 g/ml y 1,70 g/ml) y se centrifugaron a 210 000 x g durante 4 h a 12 °C. utilizando un rotor SW40Ti (Beckman Coulter). Las bandas que contenían partículas de fago se recogieron utilizando una aguja y una jeringa de calibre 0,8 mm. El cloruro de cesio se eliminó mediante diálisis contra el tampón de fago a 4 °C durante la noche usando un tubo de diálisis Visking tipo 8/32″, 0,05 mm de espesor (n.° de pieza 1780.1, Carl Roth, Alemania).

La muestra de fago purificada (1012 UFP/ml) se diluyó 10 veces usando una solución de urea 3 M en el tampón de fago y se incubó a 42° durante 30 min. Después de la incubación, la muestra se diluyó 3 veces en el tampón de fago y se trató con Turbonucleasa (Abnova) a una concentración final de 3,5 Unidades/ml durante 15 min a temperatura ambiente. Las partículas de fago se sedimentaron mediante centrifugación a 75.000 xga 4° durante 1 h en un rotor de 50,2 Ti (Beckman Coulter) y se resuspendieron en el tampón de fago. La composición proteica de los viriones SU10 y los intermediarios de liberación del genoma se compararon mediante electroforesis en gel SDS y análisis de espectrometría de masas.

El fago SU10 purificado se resuspendió en tampón Laemmli y se hirvió durante 3 min, luego la muestra se trató con Turbonucleasa a una concentración final de 2 Unidades/ml (Abnova) durante 15 min a temperatura ambiente. Las proteínas se separaron mediante electroforesis en gel con gradiente de tricina. Todas las bandas de proteínas principales se cortaron del gel y se usaron para el análisis de espectrometría de masas. El procesamiento y análisis de datos de espectrometría de masas se realizaron utilizando el software FlexAnalysis 3.4 y MS BioTools (Bruker Daltonics). Se usó el software Mascot (Matrix Science, Londres, Reino Unido) para búsquedas de secuencias en espectros MS/MS exportados contra la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica y una base de datos local suministrada con las secuencias de proteínas esperadas. La tolerancia de masa de péptidos y fragmentos de MS/MS para búsquedas de iones de MS/MS fue de 50 partes por millón y 0,5 Da, respectivamente. La oxidación de la metionina y la propionilamidación de la cisteína como modificaciones opcionales y la división errónea de una enzima se establecieron para todas las búsquedas. Se consideraron los péptidos con una puntuación peptídica estadísticamente significativa (P < 0,05).

La solución de fago purificada (4 μl) con una concentración de 1012 UFP/ml se pipeteó en una rejilla de cobre recubierta de carbono perforada (R2/1, malla 200; Quantifoil), se secó y se vitrificó sumergiéndola en etano líquido usando un FEI Vitrobot Mark IV . La muestra vitrificada se transfirió a un microscopio electrónico Thermo Fisher Scientific Titan Krios operado en condiciones criogénicas y con un voltaje de aceleración de 300 kV. El haz se alineó para iluminación paralela en modo NanoProbe y se realizaron alineaciones sin coma para eliminar la inclinación residual del haz. Se recogieron micrografías de viriones SU10 con un aumento de 59 000x en un detector de electrones directo Falcon III que funciona en modo lineal, lo que da como resultado un tamaño de píxel calibrado de 1,38 Å/píxel. La obtención de imágenes se realizó en condiciones de dosis baja (dosis total 49 e-/Å2) y valores de desenfoque que oscilaron entre -1,2 y -2,7 μm. La exposición de un segundo se fraccionó en 40 cuadros y se guardó como una película. El conjunto de datos de los intermediarios de liberación del genoma se recopiló con un aumento de 105 000 x en un detector de electrones directos K2 Summit que funciona en modo de conteo, lo que da como resultado un tamaño de píxel calibrado de 1,34 Å/píxel. Las imágenes se realizaron en condiciones de dosis baja (dosis total 52 e-/Å2) y valores de desenfoque que oscilaron entre -1,2 y -2,7 μm. La exposición de ocho segundos se fraccionó en 40 cuadros y se guardó como una película. Las adquisiciones de datos automatizadas se realizaron utilizando el software EPU (detector Falcon III) o Serial EM (detector K2 Summit). Las películas se corrigieron por movimiento global y localmente (parches de 5 × 5) utilizando el software MotionCor247 y se guardaron como micrografías ponderadas por dosis. Los valores de desenfoque se estimaron a partir de micrografías alineadas sin ponderación de dosis utilizando el programa Gctf48.

Se usaron rejillas de viriones SU10 preparadas para la adquisición de partículas individuales para registrar series de inclinación de tomografía que cubrían un rango angular de −60° a +60° con incrementos de 2°, con el esquema de inclinación bidireccional en condiciones de dosis baja utilizando SerialEM. Cada serie de inclinación se recolectó con un valor de desenfoque nominal de −6 µm. Cada imagen se adquirió como una película de 7 fotogramas en un detector Falcon II operado en modo de conteo usando una dosis de 1 e−/Å2 por inclinación. La dosis total acumulada para cada serie de inclinación fue de 57 e−/Å2. El tamaño de píxel calibrado fue de 1,8 Å. Los tomogramas se reconstruyeron utilizando eTomo del paquete IMOD49. Los subtomogramas de cabezas de viriones SU10 se promediaron utilizando el programa PEET50,51 del paquete IMOD con simetría D5 aplicada.

CrYOLO del paquete de software SPHIRE neural network se entrenó en un subconjunto de imágenes de cabezas de viriones SU10 seleccionadas manualmente52. La selección automática final se realizó en micrografías agrupadas en 4x utilizando crYOLO. Las coordenadas de las partículas resultantes se corrigieron para el factor de binning y las imágenes de las partículas (tamaño de caja de 1296 × 1296 píxeles) se extrajeron de las 9000 micrografías originales sin agrupar utilizando Relion53. Las partículas se agruparon en 256 px (6,99 Å/píxel) utilizando el agrupamiento de espacio recíproco implementado en el paquete de software Xmipp54. Se realizaron varias rondas de clasificación 2D en Relion para seleccionar viriones intactos del conjunto de partículas seleccionadas automáticamente. El modelo inicial de la cabeza SU10 a partir del promedio de subtomogramas se filtró en paso bajo a una resolución de 30 Å. Se realizaron varias rondas de clasificación y refinamiento 3D con simetría C5 impuesta utilizando Relion 3.1. El paquete de software Spider55 se utilizó para preparar una máscara cilíndrica que excluye el genoma del fago para evitar que la señal del genoma interfiera con la reconstrucción de la cápside. Después del refinamiento automático inicial con simetría C5 impuesta, la clasificación 3D se realizó sin el paso de alineación. Las partículas pertenecientes a la mejor clase se seleccionaron para un mayor refinamiento automático de Relion con simetría C5 impuesta y desviaciones máximas permitidas de las orientaciones anteriores de 10°. A medida que aumentó la resolución de la reconstrucción, las partículas se separaron gradualmente a 512 px (3,49 Å/píxel) y 1296 px (1,38 Å/píxel). La reconstrucción simetrizada C5 final se enmascaró con un umbral, se dividió por la función de transferencia de modulación y se agudizó el factor B durante el posprocesamiento en Relion 3.1. Para mejorar aún más la resolución de la cápside, dividimos la cápside en la tapa simétrica C5 sin cola, la parte central simétrica D10 y la tapa simétrica C5 con cola. Todas estas partes se volvieron a extraer en cajas más pequeñas y sus reconstrucciones se refinaron mediante búsquedas angulares locales. Para obtener una reconstrucción asimétrica de la cola del fago y la cápside circundante, se realizó la relajación de simetría de C5 a C1 utilizando el programa relion_relax_symm (Fig. 11 complementaria).

Las orientaciones de partículas de la reconstrucción C5 de la cabeza del fago se utilizaron para extraer imágenes de subpartículas centradas en portales y colas de viriones SU10. Las imágenes de subpartículas se sometieron a varias rondas de clasificaciones 2D, lo que permitió la selección de conjuntos de datos homogéneos. Después del refinamiento automático inicial con simetría C12 impuesta para el portal y simetrías C6 y C3 para la cola, se realizaron clasificaciones 3D sin el paso de alineación. Se seleccionaron partículas pertenecientes a las mejores clases para un mayor refinamiento automático Relion con simetrías impuestas y desviaciones máximas permitidas de las orientaciones anteriores de 10°. Los mapas resultantes se enmascararon en el umbral, se dividieron por la función de transferencia de modulación y el factor B se agudizó durante el posprocesamiento en Relion (Fig. 11 complementaria).

Las orientaciones de partículas de la reconstrucción C6 de la cola del fago se usaron para extraer imágenes de subpartículas centradas en la aguja de la cola del virión SU10. Las imágenes de subpartículas se sometieron a varias rondas de clasificaciones 2D, lo que permitió la selección de un conjunto de datos homogéneo. Después del refinamiento automático inicial con simetría relajada establecida en C3, la clasificación 3D se realizó sin el paso de alineación. Las partículas pertenecientes a la mejor clase se seleccionaron para un mayor refinamiento automático de Relion con simetría C3 impuesta y desviaciones máximas permitidas de las orientaciones anteriores de 10 ° (Fig. 11 complementaria).

Para obtener una reconstrucción asimétrica de todo el virión SU10, las orientaciones de la reconstrucción de la cabeza simetrizada C5 se relajaron utilizando relion_relax_symm. Se utilizó el paquete de software Spider55 para preparar una máscara esférica que cubría la cola del fago y 40 nm de la cápside.

La reconstrucción inicial se realizó en imágenes de partículas agrupadas en 256 px (6,99 Å/píxel), utilizando un factor de regularización alto y permitiendo solo búsquedas rotacionales. La relajación exitosa de la simetría se verificó por la presencia de características biológicamente relevantes en las partes de la reconstrucción pertenecientes tanto a la cabeza como a la cola del fago. Posteriormente, las reconstrucciones continuaron con datos agrupados en 512 px (3,49 Å/píxel) y 1296 px (1,38 Å/píxel) (Fig. 11 complementaria).

Los intermedios de liberación del genoma SU10 se empaquetaron manualmente utilizando e2boxer del paquete de software EMAN256. Las coordenadas de partículas resultantes se usaron para extraer partículas de las 5688 micrografías usando Relion53,54. Las partículas se agruparon en 256 px (6,99 Å/píxel) utilizando el agrupamiento de espacio recíproco implementado en el paquete de software Xmipp54. Se realizaron varias rondas de clasificación 2D en Relion para seleccionar intermediarios de liberación del genoma intacto del conjunto de partículas. La reconstrucción de la cápside del virión SU10, filtrada en paso bajo a una resolución de 30 Å, se utilizó como modelo inicial para la reconstrucción 3D en Relion. Se realizaron varias rondas de clasificación y refinamiento 3D con simetría C5 impuesta utilizando Relion 3.1. El mapa resultante se enmascaró con un umbral, se dividió por la función de transferencia de modulación y se agudizó el factor B durante el posprocesamiento en Relion (Fig. 12 complementaria).

Las orientaciones de partículas de la reconstrucción C5 de la cápside del intermediario de liberación del genoma SU10 se utilizaron para extraer imágenes de subpartículas centradas en las colas. Las imágenes de subpartículas se sometieron a varias rondas de clasificaciones 2D, lo que permitió la selección de un conjunto de datos homogéneo. Después del autorrefinamiento inicial con simetría C6 impuesta, la clasificación 3D se realizó sin el paso de alineación. Las partículas pertenecientes a la mejor clase se seleccionaron para un mayor autorefinamiento Relion con simetría C6 impuesta y desviaciones máximas permitidas de las orientaciones anteriores de 10°. El mapa resultante se enmascaró con un umbral, se dividió por la función de transferencia de modulación y se agudizó el factor B durante el posprocesamiento en Relion (Fig. 12 complementaria).

Las orientaciones de partículas de la reconstrucción C5 de la cápside del intermediario de liberación del genoma SU10 se utilizaron para extraer imágenes de subpartículas centradas en la parte superior de la cápside. Las imágenes de subpartículas se sometieron a varias rondas de clasificaciones 2D, lo que permitió la selección de un conjunto de datos homogéneo. Se amplió la simetría C5 de las partículas y se realizó la clasificación 3D en diez clases sin el paso de alineación. Se seleccionaron las partículas pertenecientes a las mejores clases y se eliminaron los duplicados de partículas de la expansión de simetría. Las partículas resultantes se usaron para un mayor autorefinamiento de Relion sin simetría y con desviaciones máximas permitidas de las orientaciones anteriores de 10 ° (Fig. 12 complementaria).

Las estructuras PDB se construyeron usando el programa COOT47 (proteína portal, proteína adaptadora, residuos 1-90 de fibra de cola larga y dominio proximal de fibra de cola corta), se construyeron automáticamente usando Deep Tracer57 (proteína de boquilla) o se modelaron usando Alphafold234 (proteína central y de receptor). -dominios de unión de fibra de cola corta y aguja de cola). Las estructuras fueron refinadas iterativamente en espacio real utilizando el programa PHENIX real_space_refine.py58 y corregidas manualmente en COOT47 e ISOLDE59. La calidad de las estructuras y su ajuste a los mapas de densidad crio-EM se evaluó mediante una validación exhaustiva en el programa PHENIX. Las curvas FSC de las reconstrucciones crio-EM se presentan en la figura complementaria 13. El modelo para mapear las curvas FSC de estructuras individuales, y los ejemplos del ajuste de los modelos PDB a las densidades crio-EM se muestran en la figura complementaria 14.

Las estructuras de las proteínas SU10 que no se resolvieron en las reconstrucciones crio-EM a una resolución suficiente para permitir la determinación estructural se predijeron mediante una instalación local de AlphaFold multimer 2.1.2. El software se instaló desde https://github.com/deepmind/alphafold, usando un entorno Dockerizado. Para la predicción, se utilizaron las bases de datos recomendadas por los autores de AlphaFold en el momento de la instalación (invierno de 2021) (BFD, MGnify, PDB70, PDB, PDB seqres, Uniclust30, UniProt, UniRef90)34.

El mapa compuesto del virión SU10 se preparó combinando segmentos de reconstrucciones de subpartículas de las regiones del virión SU10. Las reconstrucciones de subpartículas de regiones del virión SU10 se ajustaron en la reconstrucción asimétrica del virión SU10 completo utilizando Chimera60,61,62 (el comando Ajustar en mapa). El mapa compuesto se construyó a partir de las siguientes reconstrucciones: reconstrucción de la cápside simetrizada C5; portal de reconstrucción de cuello simetrizado C12; adaptador, fibras de cola larga, boquilla y fibras de cola corta de reconstrucción de cola simetrizada C6; y reconstrucción de aguja de cola simetrizada C3. Se combinaron segmentos de reconstrucciones de subpartículas en el mapa compuesto usando el siguiente procedimiento: (1) Se generaron máscaras que cubrían las estructuras PDB de las proteínas componentes usando pdb2mrc. (2) Las máscaras se ampliaron en seis vóxeles y cuatro vóxeles adicionales de borde suave (Relion3 - relion_mask_create). (3) Las reconstrucciones de subpartículas se multiplicaron por las máscaras correspondientes (Relion3 - relion_image_handler). (4) Para cada umbral de segmento, se seleccionó para visualización la estructura de todo el componente con el máximo de detalles resueltos. Para un mapa de fibra de cola corta con resolución decreciente a lo largo de la fibra, se seleccionaron tres segmentos con diferentes umbrales. (5) Los mapas de segmentos se normalizaron utilizando la máscara de mapa CCP4. (6) Los segmentos normalizados se combinaron en el mapa compuesto final usando el comando Chimera vop add onGrid. El mapa compuesto del intermedio de liberación del genoma SU10 se preparó utilizando el mismo procedimiento a partir de la cápside reconstruida con simetría C5 y la cola reconstruida con simetría C6.

Un cultivo de crecimiento exponencial de E. coli ECOR10 (OD = 0,3) se infectó con el bacteriófago SU10 (MOI = 10) preteñido con DmaO (BIOTIUM) en presencia de 0,002 M CaCl2. La infección se realizó en un portaobjetos de cultivo celular PS 75/25 mm cellview con fondo de vidrio (Greiner bio-one) a 37 °C, con agitación de 100 RPM y se dejó proceder durante 5, 25, 45 y 65 min. Las membranas bacterianas y el ADN se tiñeron con SynaptoRed (BIOTIUM) (concentración final 4 μM) y DAPI (Roche) (concentración final 300 nM). Para obtener imágenes, las muestras se fijaron con una mezcla de glutaraldehído y formaldehído (0,125 % y 4 %, respectivamente) en un tampón de fosfato 50 mM (pH = 7,5). Para evitar el movimiento durante la obtención de imágenes, las muestras se cubrieron con agarosa de bajo punto de fusión al 1 % en el tampón de fagos.

Se tomaron imágenes de las muestras utilizando un microscopio confocal Zeiss LSM 880 con Airyscan en modo RS, con excitación de fluoróforo en las siguientes longitudes de onda: DAPI a 405 nm, DmaO a 488 nm y SynaptoRed a 514 nm. Los datos se procesaron con ZEN Black y se visualizaron con Fiji63.

Un cultivo de crecimiento exponencial de E. coli ECOR10 (OD = 0,3) se infectó con el bacteriófago SU10 (MOI = 10). Se permitió que la infección progresara durante 5, 25, 45 y 65 min. Se sedimentaron 1,5 ml de cultivo bacteriano infectado mediante centrifugación a 10.000 x g durante 1 min a 4°. Los sedimentos se resuspendieron en 15 µl del tampón de fagos y se mantuvieron en hielo. Se aplicaron marcadores fiduciales de oro (perlas de 10 nm) a la rejilla de cobre recubierta de carbono perforada (R3.5/1, malla 200; Quantifoil) para microscopía electrónica, se filtraron con papel de filtro y se cubrieron inmediatamente con 4 μl de suspensión celular. Posteriormente, las rejillas se secaron y vitrificaron sumergiéndolas en etano líquido utilizando un Vitrobot Mark IV. Las series de inclinación tomográfica que cubren un rango angular de −60° a +60° con incrementos de 3° se registraron automáticamente utilizando un esquema de inclinación simétrica de dosis en condiciones de dosis baja en un detector de electrones directos K2 Summit, ubicado detrás del filtro de energía en el Titán. Microscopio Krios. Cada serie de inclinación se recopiló con un valor de desenfoque nominal de −6 µm y se adquirió como una película que contenía 5 cuadros en el modo de conteo del detector, usando una dosis de 2 e−/Å2 por inclinación. La dosis total acumulada para cada serie de inclinación fue de 57 e−/Å2. El tamaño de píxel calibrado fue de 4,33 Å. Los tomogramas fueron reconstruidos y visualizados usando IMOD del paquete de software eTomo58. Las membranas y flagelos se segmentaron utilizando el programa Amira64. Las posiciones de las partículas de fago, los ribosomas (EMD-13270) y la matriz de quimiorreceptores (EMD-10160) se identificaron mediante la comparación de plantillas tal como se implementó en EMclarity64,65, y las estructuras de alta resolución correspondientes se colocaron en el tomograma mediante secuencias de comandos internas. https://github.com/fuzikt/tomostarpy.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Las reconstrucciones crio-EM y las estructuras PDB correspondientes se depositaron bajo los siguientes códigos EMDB y PDB: Estructuras del virión SU10: cápside con simetría quíntuple EMD-14488 y PDB-7Z49, reconstrucción de cápside asimétrica EMD-14492 y PDB-7Z4B, cápside superior EMD -14485 y PDB-7Z46, centro de la cápside EMD-14484 y PDB-7Z45, parte inferior de la cápside EMD-14487 y PDB-7Z48, reconstrucción asimétrica de la parte inferior y la cola de la cápside EMD-14489 y PDB-7Z4A, cuello con simetría de doce pliegues EMD-14483 y PDB-7Z44, cola con simetría séxtuple EMD-14486 y PDB-7Z47, aguja de cola con simetría triple EMD-14909 y mapa compuesto de todo el virión EMD-14977. Estructuras del intermediario de liberación del genoma: cápside con simetría quíntuple EMD-14490, cola con simetría séxtuple EMD-14495 y PDB-7Z4F, parte superior de la cápside EMD-14491 y mapa compuesto del intermediario de liberación del genoma completo EMD-14920.

Los scripts para posicionar estructuras de alta resolución en los tomogramas están disponibles en https://github.com/fuzikt/tomostarpy.

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Descargar referencias

Agradecemos a CEITEC MU la instalación central de microscopía crioelectrónica y tomografía y la instalación central de proteómica de CIISB, Centro Instruct-CZ respaldado por MEYS CR (LM2018127) por su ayuda para obtener los datos científicos presentados aquí. Agradecemos a la instalación central CELLIM respaldada por el gran proyecto de RI de Czech-BioImaging (LM2018129 financiado por MEYS CR) por su apoyo en la obtención de los datos científicos presentados en este documento. Agradecemos enormemente el acceso a las instalaciones informáticas y de almacenamiento propiedad de las partes y los proyectos que contribuyen al MetaCentrum de la Infraestructura de la red nacional, proporcionados en el marco del programa Proyectos de gran infraestructura para la investigación, el desarrollo y las innovaciones (LM2010005). Este estudio fue apoyado por el Centro de Excelencia IT4Innovations (proyecto CZ.1.05/1.1.00/02.0070). Este trabajo, incluidos los esfuerzos de Pavel Plevka, fue financiado por la subvención LL1906 del consolidador ERC-CZ del Ministerio de Educación, Juventud y Deportes de la República Checa, la subvención de la Fundación Checa de Ciencias GA18-17810S y el proyecto Instituto Nacional de Virología y Bacteriología (Programa EXCELES, ID Proyecto No. LX22NPO5103) - Financiado por la Unión Europea - Next Generation EU. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación e interpretación de datos, o la decisión de enviar el trabajo para su publicación.

Instituto de Tecnología de Europa Central, Kamenice 753/5, 625 00, Brno, República Checa

Marta Šiborová, Tibor Füzik, Michaela Procházková, Jiří Nováček & Pavel Plevka

Facultad de Ciencias, Universidad de Masaryk, Kamenice 753/5, 625 00, Brno, República Checa

Martín Benešík

Departamento de Biociencias Moleculares, Instituto Wenner-Gren, Universidad de Estocolmo, 106 91, Estocolmo, Suecia

Anders S. Nilsson

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Conceptualización PP; metodología M.Š., TF, MP, JN y MB; validación M.Š. y FT; análisis formal M.Š., MP, JN y MB; investigación M.Š., MP, JN y MB; recursos AN; curación de datos M.Š. y FT; redacción—preparación del borrador original M.Š., TF y PP; redacción—revisión y edición M.Š., TF y PP; visualización M.Š. y TF; supervisión PP; financiación adquisición PP

Correspondencia a Pavel Plevka.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Šiborová, M., Füzik, T., Procházková, M. et al. Las proteínas de la cola del fago SU10 se reorganizan en la boquilla para la entrega del genoma. Nat Comun 13, 5622 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-33305-w

Descargar cita

Recibido: 31 enero 2022

Aceptado: 12 de septiembre de 2022

Publicado: 24 septiembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-33305-w

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