Producción de IgG1 Fc humana recombinante con N beneficioso

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 589 (2023) Citar este artículo

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La inmunoglobulina intravenosa (IGIV) es una IgG policlonal derivada del plasma que se utiliza para el tratamiento de enfermedades autoinmunes. Los estudios muestran que la sialilación α-2,6 de la Fc mejora la actividad antiinflamatoria. Además, la afucosilación de la Fc bloquea de forma eficaz el FcγRIIIA al aumentar la afinidad monovalente por este receptor, lo que puede ser beneficioso para el tratamiento de la trombocitopenia inmune refractaria (ITP). Aquí, generamos pollos con genoma editado que sintetizan IgG1 Fc humana en el hígado y secretan IgG1 Fc humana α-2,6 sialilada y baja en fucosilación (rhIgG1 Fc) en suero y yema de huevo. Además, rhIgG1 Fc tiene mayor afinidad por FcγRIIIA que la IVIG comercial. Por lo tanto, rhIgG1 Fc inhibe eficazmente el entrecruzamiento de FcγRIIIA mediado por complejos inmunes y la respuesta ADCC subsiguiente. Además, rhIgG1 Fc ejerce actividad antiinflamatoria en un modelo de ITP pasiva, lo que demuestra que rhIgG1 Fc derivado de hígado de pollo recapituló con éxito la eficacia de IVIG. Estos resultados muestran que los pollos con genoma editado se pueden utilizar como plataforma de producción para rhIgG1 Fc con un patrón de N-glicosilación beneficioso para actividades antiinflamatorias.

Las enfermedades autoinmunes (EA) son causadas por una respuesta inmune aberrante contra los autoantígenos1. Generalmente, los autoanticuerpos que reconocen autoantígenos desencadenan respuestas inflamatorias al activar células efectoras como macrófagos, neutrófilos y células asesinas naturales, lo que resulta en la destrucción de tejidos o células2. Por lo tanto, para tratar las EA, es importante inhibir la activación de las células efectoras y amortiguar las respuestas inflamatorias. El agente antiinflamatorio inmunoglobulina intravenosa (IGIV) se usa ampliamente para tratar las EA inflamatorias3. Cuando la IVIG se infunde en dosis altas (es decir, 1 a 2 g/kg), puede mejorar la inflamación y recuperar el recuento de plaquetas en pacientes con trombocitopenia inmunitaria (PTI)4. Debido a que IVIG muestra actividad antiinflamatoria contra numerosas DA, la demanda mundial aumenta continuamente5. Sin embargo, debido a que la IVIG se prepara a partir de plasma humano donado, la escasez de suministros y los altos costos son las principales limitaciones6. Por lo tanto, es deseable desarrollar un sistema eficiente para la producción y el suministro de alternativas de IVIG que recapitulen la actividad antiinflamatoria de la IVIG derivada de plasma.

Aunque la IVIG actúa a través de diversos mecanismos, su fragmento Fc es fundamental para la actividad antiinflamatoria7,8,9. Se sabe que el Fc sialilado α-2,6 promueve la expresión de FcγRIIB en los macrófagos efectores al promover la secreción de citocinas TH2 como IL-33 e IL-4, y la proporción abundante de Fc sialilado α-2,6 aumenta la actividad anti- actividad inflamatoria de IVIG significativamente10,11,12,13,14,15. Por lo tanto, Fc altamente α-2,6 sialilado es una alternativa potencial de IVIG que muestra una actividad antiinflamatoria mejorada.

El otro mecanismo principal subyacente a la actividad de IVIG es el bloqueo competitivo de la activación de los receptores Fcγ (FcγRs)7,16. Cuando la IVIG se administra en dosis altas, ocupa la activación de los FcγR y evita que los complejos inmunes se unan y entrecrucen estos receptores17,18. En particular, la actividad antiinflamatoria de IVIG depende de FcγRIIIA, lo que sugiere que el bloqueo de FcγRIIIA es un mecanismo potencial de la actividad de IVIG19,20,21. Esta noción está respaldada por un estudio que muestra que el bloqueo de FcγRIIIA por parte de anticuerpos monoclonales recapitula la actividad de IVIG y mejora de manera eficiente las respuestas inflamatorias en pacientes con PTI refractaria, aunque el entrecruzamiento de FcγRIIIA produce efectos secundarios adversos22. Debido a que la ausencia de fucosilación central (afucosilación) aumenta significativamente la afinidad monovalente de IgG por FcγRIIIA23, se puede suponer que la Fc afucosilada ocupará eficientemente FcγRIIIA y será beneficiosa para inducir la actividad antiinflamatoria y el tratamiento de la PTI refractaria. Recientemente, se demostró que el FcγRIIIA de las células NK estaba abundantemente ocupado por IgG24 afucosilada. Además, se demostró que los anticuerpos específicos de antígeno afucosilados bloquean eficazmente el FcγRIIIA y pueden ser antiinflamatorios al inhibir las funciones efectoras de Fc del anticuerpo específico de antígeno25.

Por lo tanto, si podemos generar una región Fc de hIgG1 que tenga altos niveles de N-glicanos sialilados α-2,6 y, al mismo tiempo, tenga una alta afinidad por FcγRIIIA a través de la afucosilación, podemos obtener los múltiples modos de acción de IVIG, mejorando así la anti- actividad inflamatoria. Sin embargo, la IVIG derivada de plasma contiene cantidades bajas de Fc sialilado (alrededor del 10 % del total de N-glucanos) y tiene una gran proporción de N-glucanos fucosilados26. La hIgG1 Fc recombinante derivada del cultivo de células de mamíferos también tiene niveles bajos de glucanos sialilados y niveles altos de glucanos fucosilados, a menos que se realicen modificaciones específicas en las líneas celulares de expresión27. Por lo tanto, se requiere un sistema alternativo para la producción de hIgG1 Fc que contenga una alta proporción de N-glucanos sialilados y afucosilados α-2,6 para el desarrollo de una alternativa de IVIG con actividad antiinflamatoria mejorada.

Los pollos son una plataforma eficiente para la producción de biofarmacéuticos; esto se debe a que los huevos de gallina contienen abundantes proteínas y las gallinas ponen más de 300 huevos al año28. Además, el patrón de glicosilación de las proteínas de huevo de gallina es similar al de las proteínas humanas y, lo que es más importante, las gallinas solo producen glucanos similares a los humanos y no producen α-galactosa inmunogénica ni Neu5Gc28,29. Por estas razones, se han estudiado varios enfoques para aumentar la acumulación de productos biofarmacéuticos en los huevos, particularmente en la clara de huevo30,31,32,33,34,35,36,37. Mientras tanto, la mayoría de las proteínas de la yema de huevo se sintetizan en el hígado y se transfieren del torrente sanguíneo cuando la yema comienza a madurar en el ovario. El hígado de pollo expresa altos niveles de α-2,6 sialiltransferasa (ST6GAL1), y se supone que el hígado de pollo tiene niveles muy bajos de fucosiltransferasa (FUT8); esto se debe a que la mayoría de los N-glucanos de la proteína de la yema de huevo están afucosilados38,39. Por lo tanto, se espera que las proteínas sintetizadas en el hígado de pollo tengan una estructura de N-glicanos altamente α-2,6 sialilada y afucosilada, y que estas proteínas circulen en el torrente sanguíneo y, finalmente, se acumulen en la yema de huevo40. Por lo tanto, si hIgG1 Fc puede sintetizarse de manera específica en hígado de pollo, hIgG1 Fc puede obtenerse a partir de suero y yema de huevo con altos niveles de sialilación α-2,6 y afucosilación, y esto será beneficioso para la actividad antiinflamatoria.

Aquí, informamos el desarrollo de pollos con genoma editado que secretan IgG1 Fc humana de manera específica para el hígado. Para hacer esto, etiquetamos la secuencia de codificación de IgG1 Fc humana en el gen de la albúmina (ALB), que es una proteína sérica importante y se expresa en el hígado, y generamos pollos con genoma editado (en lo sucesivo denominados pollos ALB::hIgG1 Fc) . Para el etiquetado, utilizamos el péptido 2A de autoescisión del virus de la asigna (T2A) entre las secuencias codificantes de ALB e IgG1 Fc, por lo que IgG1 Fc se puede separar de ALB después de la traducción. Usando esta estrategia, producimos de manera eficiente IgG1 Fc humana altamente α-2,6 sialilada y afucosilada en suero de pollo y, en última instancia, en yema de huevo. La IgG1 Fc humana recombinante (rhIgG1 Fc) derivada de pollos ALB::hIgG1 Fc ha mejorado la actividad de bloqueo de FcγRIIIA y ha recapitulado con éxito las actividades antiinflamatorias de IVIG in vivo. Por lo tanto, mostramos aquí que los pollos con genoma editado que expresan hIgG1 Fc de manera específica para el hígado pueden ser una posible fuente alternativa de IVIG al plasma humano.

Para acumular rhIgG1 Fc en suero y yema de huevo, generamos albúmina (ALB)::hIgG1 Fc de pollos con genoma editado utilizando tecnología de edición de genoma mediada por CRISPR/Cas9-NHEJ en células germinales primordiales (PGC) White Leghorn (WL), como se informó anteriormente41 , 42. Para introducir la secuencia codificante de hIgG1 Fc (CDS) en el gen ALB, construimos un plásmido CRISPR/Cas9 que reconoce el intrón 13 del gen ALB y un plásmido donante que contiene el intrón 13 y el exón 14 (sin el codón de parada) del ALB seguido de la secuencia T2A y el CDS hIgG1 Fc, que contiene la bisagra hIgG1 y los dominios CH2 y CH3 (Fig. 1a). T2A es uno de los péptidos de autoescisión viral 2A que inducen la falta de formación de enlaces peptídicos durante la traducción, lo que permite la expresión simultánea de dos proteínas diferentes43. Aunque la eficiencia de escisión de los péptidos 2A no fue del 100%44, intentamos separar rhIgG1 Fc de ALB usando T2A sin afectar la formación y secreción de ALB, evitando así el efecto dañino desconocido causado por el agotamiento de ALB.

a Ilustración esquemática del plásmido donante que contiene la secuencia codificante de IgG1 Fc humana (hIgG1 Fc) para marcar el gen de la albúmina (ALB). El vector donante incluye el intrón 13 de ALB, el exón 14 de ALB sin el codón de terminación, la secuencia T2A, la secuencia codificante del péptido señal (sig pep) de ALB, la secuencia codificante de hIgG1 Fc, la UTR 3' de ALB y una resistencia a la puromicina (PuroR) gene. Cuando el vector donante y el ARN guía único (sgRNA), que se dirige al intrón 13 de ALB, se cotransfectaron en células germinales primordiales (PGC), el vector donante se insertó en el sitio objetivo del sgRNA. El alelo modificado resultante contiene el exón 14 de ALB sin el codón de terminación, la secuencia de codificación de T2A, la secuencia de codificación del péptido señal de ALB y la secuencia de codificación de hIgG1 Fc. b Validación Knock-in (KI) de PGC después de la selección de puromicina utilizando cebadores específicos para la unión 5' y la unión 3'. c Análisis de secuencia de tres productos de PCR clonados con TA de la unión 5' y la unión 3' de PGC editadas con genoma. d Producción de progenie derivada de PGC de donante mediante cruzamiento de prueba. e Análisis de secuencia de tres productos de PCR clonados con TA de la unión 5' y la unión 3' de tres progenie G1 editada con genoma ALB::hIgG1 Fc.

Después de la transfección de CRISPR/Cas9 y los plásmidos donantes, las PGC editadas con genoma se seleccionaron mediante selección con puromicina. La integración del plásmido donante en las PGC seleccionadas se validó mediante PCR y análisis de secuencias de la unión 5' y 3' entre las secuencias del plásmido endógeno y del donante; esto confirmó que el plásmido donante se integró con éxito en el sitio de destino, con varios indeles (Fig. 1b, c). Estos WL PGC editados por el genoma establecidos se trasplantaron en embriones receptores Korean Ogye (KO). Después de la maduración sexual, dos machos KO receptores se cruzaron de prueba con gallinas WL de tipo salvaje y se eclosionaron las crías G1 derivadas de PGC del donante (Fig. 1d y Tabla complementaria 1). A partir de la descendencia G1 derivada de PGC donante, obtuvimos una progenie ALB::hIgG1 Fc en la que la integración del plásmido donante se validó mediante PCR específica de unión 5' y 3' y análisis de secuencia de ADN genómico. En la progenie editada por el genoma, el plásmido donante se integró con éxito, con una mutación de inserción de un par de bases en los sitios de unión 5' y 3' (Fig. 1e).

A continuación, se apareó un gallo G1 heterocigoto sexualmente maduro (ALB+/hIgG1 Fc) con gallinas de tipo salvaje (ALB+/+), y se eclosionaron crías G2 ALB::hIgG1 Fc (ALB+/hIgG1 Fc). Después de la maduración sexual, esta progenie G2 heterocigota se apareó y la progenie G3 eclosionó con éxito. El genotipado de la progenie G3 confirmó que la progenie ALB::hIgG1 Fc homocigota (ALB hIgG1 Fc/hIgG1 Fc) se generó con éxito de acuerdo con la herencia mendeliana (Figuras complementarias 1a, b). Aunque la concentración de ALB en el suero mostró una tendencia a disminuir en los pollos homocigotos, observamos que los pollos homocigotos también secretan ALB en la sangre, están sanos, alcanzan la madurez sexual y ponen huevos (Figuras complementarias 2a-c, e). Estos resultados demuestran que se pueden producir con éxito pollos ALB::hIgG1 Fc, que alcanzan la madurez sexual y ponen huevos.

Para identificar el patrón de expresión de los transcritos de hIgG1 Fc en pollos ALB::hIgG1 Fc, extrajimos ARN de varios órganos y confirmamos la expresión de los transcritos de hIgG1 Fc mediante RT-PCR. Como resultado, identificamos una fuerte expresión de las transcripciones de rhIgG1 Fc en el hígado (Fig. 2a), lo que sugiere que rhIgG1 Fc se transcribió con éxito de manera específica para el hígado.

a Validación de la expresión del transcrito de hIgG1 Fc mediante RT-PCR de tejido de varios órganos obtenidos de pollos de tipo salvaje y ALB::hIgG1 Fc editados con el genoma. b Validación de la secreción de rhIgG1 Fc en suero y yema de huevo de pollos con genoma editado ALB::hIgG1 Fc mediante transferencia Western. Se añadió β-mercaptoetanol a las muestras para romper los enlaces disulfuro (condiciones reductoras). Se usó suero de pollo de tipo salvaje como control negativo. c Concentración de rhIgG1 Fc en suero de pollos heterocigóticos ALB+/hIgG1 Fc a las 4, 18 y 40 semanas después de la eclosión. Cada punto representa pollos individuales. (n = 5–12 de muestras independientes) d Concentración de rhIgG1 Fc en yemas de huevo heterocigóticas ALB+/hIgG1 Fc a las 24, 30 y 36 semanas después de la eclosión. Cada punto representa yemas de huevo individuales. (n = 6–8 de muestras independientes) Las diferencias entre los grupos se determinaron mediante ANOVA unidireccional. ns, no significativo. Las barras de error representan la desviación estándar.

A continuación, tomamos muestras de suero y yema de huevo y validamos la secreción de rhIgG1 Fc mediante transferencia Western (Fig. 2b). Los datos confirmaron la secreción de hIgG1 Fc en el torrente sanguíneo y la yema de huevo (Fig. 2b). En condiciones no reductoras, se detectó una banda consistente con rhIgG1 Fc ((CH2 + CH3)2) tanto en suero como en yema. En condiciones reductoras, se detectó una banda de alrededor de 35 kDa, que es mayor que la masa molecular esperada de CH2 + CH3 desglicosilado (25 kDa) (Fig. 2b). Este resultado muestra que rhIgG1 Fc se secreta en el suero y la yema de huevo en su forma glicosilada. Curiosamente, en suero, también se detectó una gran banda de alrededor de 110 kDa (coherente con la masa molecular de ALB + T2A + CH2 + CH3) en condiciones reductoras, así como la fusión ALB-Fc (una gran banda de > 100 kDa ) en condiciones no reductoras, lo que sugiere que la escisión de T2A no se realizó por completo (Fig. 2b). A diferencia del suero, solo se detectó rhIgG1 Fc en la yema de huevo tanto en condiciones reductoras como no reductoras (Fig. 2b).

A continuación, comprobamos la concentración de rhIgG1 Fc en suero y yema de huevo de gallinas G2 heterocigotas ALB+/hIgG1 Fc. La concentración promedio de rhIgG1 Fc en el suero de la progenie heterocigota ALB+/hIgG1 Fc a las 4, 18 y 40 semanas después de la eclosión fue de 170,70 ± 71,65 (n = 8) μg/ml, 162,98 ± 27,34 (n = 12) μg/ml, y 149,39 ± 42,34 μg/ml (n = 5), respectivamente (fig. 2c). La concentración de rhIgG1 Fc en yema de huevo de gallinas G2 heterocigotas ALB+/hIgG1 Fc mostró un promedio de 152,85 ± 85,87 (n = 7) μg/ml, 149 ± 45,52 (n = 8) μg/ml y 143,89 ± 55,57 (n = 6) μg/ml a las 24, 30 y 36 semanas, respectivamente (Fig. 2d). Además, confirmamos que rhIgG1 Fc se secreta en el torrente sanguíneo de forma continua, independientemente de la progenie en varias generaciones (Tabla complementaria 2). Además, observamos que rhIgG1 Fc también se secreta y acumula en el suero y la yema de gallinas homocigotas ALBhIgG1 Fc / hIgG1 Fc (Figuras complementarias 2d y e). Estos resultados muestran que los pollos ALB::hIgG1 Fc secretan eficientemente rhIgG1 Fc en suero y yema de huevo.

Para examinar el patrón de N-glicosilación en rhIgG1 Fc derivado de pollos ALB::hIgG1 Fc, purificamos rhIgG1 Fc de suero y yema de huevo usando cromatografía de exclusión por tamaño y afinidad con proteína A. rhIgG1 Fc se purificó con éxito tanto a partir de suero como de yema de huevo. (Figura 3a). A continuación, los N-glucanos se eliminaron mediante digestión con PNGasa F y se analizaron mediante UPLC-MS/MS. En el caso de rhIgG1 Fc purificada a partir de suero, identificamos seis tipos de N-glucano, y todos eran formas complejas biantenarias y afucosiladas (Fig. 3b-d). A partir de este perfil de N-glicanos, determinamos el porcentaje de N-glicanos individuales (Tablas 1 y 2). El suero de pollos machos y hembras juveniles comprendía aproximadamente un 2,5 % de glicoformas G0 desgalactosiladas, mientras que la mayoría de los N-glicanos estaban terminalmente galactosilados y sialilados (Fig. 3b y Tabla 1). Entre estos, la composición total de N-glucanos en el suero de machos y hembras juveniles que contenían residuos de ácido siálico terminal fue del 36,01 % y del 39,00 %, respectivamente (Tabla 1). De manera similar, tanto en el suero masculino como en el femenino adulto, la glicoforma G0 desgalactosilada estaba presente en alrededor del 3,3 %, y el ácido siálico terminal estaba presente en alrededor del 28,66 % y el 34,44 %, respectivamente (Fig. 3c y Tabla 1). Estos resultados muestran que los pollos ALB::hIgG1 Fc secretan niveles más altos de rhIgG1 Fc sialilada y afucosilada en el suero.

Se purificó un Fc de rhIgG1 a partir de suero y yema usando una columna de proteína A y cromatografía de exclusión por tamaño. El rhIgG1 Fc purificado se corrió en un gel SDS-PAGE al 10 %, que luego se tiñó con una solución de azul brillante de Coomassie. b El perfil de N-glicosilación de rhIgG1 Fc purificada a partir de suero juvenil, c suero adulto y d yema de huevo a las 24 y 40 semanas, según lo analizado por UPLC-MS/MS. e Transferencia de lectina de Sambucus nigra (SNA) y lectina II de Maackia amurensis (MAL II) de rhIgG1 Fc purificada a partir de suero y yema de huevo. Se usó eritropoyetina recombinante (EPO) derivada de células CHO que sólo tiene ácido siálico α-2,3 como control negativo para la transferencia SNA y control positivo para la transferencia MAL II.

A continuación, analizamos rhIgG1 Fc purificada a partir de yema de huevo a las 24 y 40 semanas. Inicialmente, esperábamos que el perfil de N-glucano de rhIgG1 Fc en la yema de huevo fuera el mismo que en el suero porque las proteínas de la yema de huevo se transportan desde el suero. Aunque los tipos principales de N-glucanos eran los mismos que en el suero, identificamos cinco tipos menores de N-glucanos adicionales: A3G1F, M3G1S1, M5A1S1F, A3G2S1F y M9. Estos comprendían el 6,04 % y el 10,99 % del total de N-glicanos en la yema de huevo a las 24 y 40 semanas, respectivamente (Fig. 3d y Tabla 2). Entre estos, los N-glicanos fucosilados del núcleo estaban presentes como 3,53 % y 5,71 % de los N-glicanos totales a las 24 y 40 semanas, respectivamente (Tabla 2). El porcentaje de N-glucanos rhIgG1 Fc que contenían residuos de ácido siálico terminal fue del 32,07 % y del 30,77 % a las 24 y 40 semanas, respectivamente (Tabla 2). Estos resultados muestran que el perfil de N-glicanos de rhIgG1 Fc en la yema de huevo es en gran medida el mismo que en el suero, pero con algunas diferencias menores.

A continuación, para identificar el tipo de enlace principal entre el ácido siálico terminal y los residuos de galactosa, que es uno de los principales factores que subyacen a la actividad antiinflamatoria de hIgG1 Fc11, realizamos transferencias de lectina utilizando lectina de Sambucus nigra (SNA) marcada con HRP y Maackia amurensis. lectina II (MAL II), que se unen específicamente a residuos de ácido siálico unidos a α-2,6 y α-2,3, respectivamente. Las transferencias de SNA revelaron una fuerte señal tanto para el suero como para la yema rhIgG1 Fc. Sin embargo, la transferencia MAL II mostró una señal insignificante tanto para el suero como para la yema rhIgG1 Fc, lo que sugiere que el tipo de enlace principal es α-2,6 (Fig. 3e). Estos resultados muestran que los pollos ALB::hIgG1 Fc pueden sintetizar eficientemente altos niveles de rhIgG1 Fc sialilada y afucosilada en α-2,6 y purificarse a partir de suero y yema de huevo.

Además, se analizó la vida media en suero de ALB::hIgG1 Fc rhIgG1 Fc derivado de pollo, Fc recombinante derivado de células HEK293T e IVIG en ratones C57BL/6. Como resultado, la vida media de ALB::hIgG1 Fc rhIgG1 Fc derivado de pollo y HEK293T recombinante derivado de células se determinó en 39,14 y 36,37 h, respectivamente (Figura complementaria 3).

Debido a que varias actividades biológicas de IgG1 se deben a la interacción entre su región Fc y los receptores Fcγ (FcγR), medimos la constante de disociación (KD) para la unión de rhIgG1 Fc a los receptores Fcγ de tipo I humanos (FcγRIA, FcγRIIA y FcγRIIIA), No integrina de captura de ICAM específica de células dendríticas (DC-SIGN) (un receptor para Fc sialilado en α-2,6) y FcRn, mediante resonancia de plasmón superficial (SPR). Los valores de KD para la unión de rhIgG1 Fc a FcRn, FcγRIA y FcγRIIIA fueron 9.088 × 10-9, 1.275 × 10-9 y 9.980 × 10-9 M, respectivamente (Fig. 4a). Sin embargo, no se pudieron determinar los valores de KD para la unión de rhIgG1 Fc a FcγRIIA y DC-SIGN, principalmente debido a la unión no específica y la baja afinidad (Figura 4 y Tabla 3 complementarias). Además, medimos los valores de KD para la unión de IVIG comercial a FcRn, FcγRIA y FcγRIIIA: estos fueron 2.142 × 10−8, 2.480 × 10−9 y 2.870 × 10−7 M, respectivamente (Fig. 4a) . A partir de los valores de KD evaluados, confirmamos que la afinidad de rhIgG1 Fc por FcγRIA y FcRn fue 1,94 y 2,35 veces mayor, respectivamente, que la de IVIG comercial (Tabla 3). En particular, la afinidad de rhIgG1 Fc por FcγRIIIA fue 28,75 veces mayor que la de IVIG comercial (Tabla 3). Estos resultados sugieren que rhIgG1 Fc tiene una afinidad monovalente significativamente mayor por FcγRIIIA que IVIG, muy probablemente debido a sus altos niveles de afucosilación.

a Sensorgramas que muestran la unión de IVIG y rhIgG1 Fc a FcRn, FcγRIA y FcγRIIIA (análisis Biacore). La unión se evaluó utilizando un modelo de equilibrio de estado estacionario para FcRn y cinética de ciclo único para FcγRIA y FcγRIIIA. Los valores de KD se anotan en cada sensograma. b Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) de un anticuerpo anti-CD20 contra linfoblastos B humanos WIL2-S en presencia de IVIG y rhIgG1 Fc. Se añadieron células Jurkat que expresan FcγRIIIA como células efectoras y se evaluó la actividad de ADCC midiendo la actividad de luciferasa. c Fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) de un anticuerpo anti-CD20 contra células de linfoma humano Raji en presencia de IVIG y rhIgG1 Fc. Se usaron células Jurkat que expresan FcγRIIA como células efectoras, y se evaluó la actividad de ADCP midiendo la actividad de luciferasa. (n = 3 de muestras independientes) Las diferencias entre los grupos se determinaron mediante ANOVA de una vía. ns, no significativo; * P < 0,05; y *** P < 0,001. Las barras de error representan la desviación estándar.

Debido a que el entrecruzamiento de FcγRIIIA por complejos inmunitarios estimula a las células inmunitarias para que secreten citocinas inflamatorias e induzcan daño tisular, el bloqueo de FcγRIIIA es una potente estrategia antiinflamatoria; de hecho, la actividad antiinflamatoria de IVIG está mediada por el bloqueo de FcγRIIIA a través de la región Fc19,21,45,46,47. Por lo tanto, preguntamos si rhIgG1 Fc inhibe el entrecruzamiento de FcγRIIIA mediado por complejos inmunes y la posterior activación de células inmunes. Para hacer esto, examinamos la actividad ADCC mediada por FcγRIIIA humana de un anticuerpo anti-CD20 en presencia de IVIG o rhIgG1 Fc. Las células de linfoblastos WIL2-S, que expresan CD20 humano, y las células Jurkat transgénicas, que expresan FcγRIIIA y el gen informador de luciferasa impulsado por el elemento de respuesta del factor nuclear de células T activadas (NFAT), se coincubaron con una solución anti-CD20 diluida en serie. anticuerpo en presencia de IVIG o rhIgG1 Fc. La unión del anticuerpo anti-CD20 inmunocomplejado a FcγRIIIA expresado por las células Jurkat inducirá el entrecruzamiento de FcγRIIIA y activará la vía NFAT, lo que dará como resultado la expresión de luciferasa.

Cuando se añadió IVIG a 1,8 mg/ml, el valor EC50 del anticuerpo anti-CD20 fue de 83,36 ng/ml, que fue 3,46 veces mayor que el medido en el grupo de tratamiento con PBS (Fig. 4b). Esto indicó que IVIG tiene actividad bloqueadora de FcγRIIIA y dificulta el entrecruzamiento de FcγRIIIA mediado por complejos inmunes. Curiosamente, cuando se añadió rhIgG1 Fc a 600 μg/ml, la misma proporción molar que 1,8 mg/ml de IVIG, el valor EC50 del anticuerpo anti-CD20 fue de 2218,19 ng/ml, que fue 26,60 veces mayor que el de IVIG. -grupo tratado (Fig. 4b). Esta diferencia en el cambio de veces es consistente con la diferencia en la afinidad de IVIG y rhIgG1 Fc por FcγRIIIA (Fig. 4a y Tabla 3). Cuando la concentración de rhIgG1 Fc disminuyó, el valor de EC50 aumentó proporcionalmente (Fig. 4b). Estos resultados indican que rhIgG1 Fc es superior a la IVIG comercial con respecto a la ocupación de FcγRIIIA, y que bloquea eficazmente la unión de complejos inmunes a este receptor.

Además, intentamos confirmar que rhIgG1 Fc bloquea FcγRIIA, un inductor principal de ADCP, utilizando células Jurkat transgénicas que expresan FcγRIIA y el gen indicador de luciferasa impulsado por el elemento de respuesta NFAT. Las células Raji que expresan CD20 y las células Jurkat transgénicas se coincubaron con un anticuerpo anti-CD20 diluido en serie en presencia de 1,8 mg/ml de IVIG o 0,6 mg/ml de rhIgG1 Fc. Los niveles de inducción de ADCP se examinaron midiendo la actividad de luciferasa en cada grupo. Sin embargo, no detectamos efectos inhibitorios sobre el entrecruzamiento de FcγRIIA mediado por el anticuerpo anti-CD20 inmunocomplejado en el grupo de tratamiento con 1,8 mg/ml de IVIG y 0,6 mg/ml de rhIgG1 Fc (Fig. 4c). Este resultado es consistente con la afinidad relativamente baja de IVIG y rhIgG1 Fc por FcγRIIA que FcγRIIIA (Tabla 3 y Fig. 4 complementaria).

Para verificar si rhIgG1 Fc bloquea el agotamiento de plaquetas mediado por autoanticuerpos, utilizamos un modelo de ratón con PTI pasiva en el que las plaquetas se agotan mediante inyección de anticuerpo monoclonal de rata (MWReg30) que reconoce la integrina específica de plaquetas murinas αIIbβ348. Administramos IVIG o rhIgG1 Fc al ratón 2 h antes de la inyección del anticuerpo antiplaquetario MWReg30 y luego analizamos el recuento de plaquetas después de 4 h de la inyección de MWReg30 (Fig. 5a). Cuando se administró IVIG a 1 g/kg y 0,33 g/kg, evitó la depleción de plaquetas mediada por MWReg30 (Fig. 5b). De manera similar, cuando se administró rhIgG1 Fc a 0,33 g/kg y 0,12 g/kg, que es la misma proporción molar que 1 g/kg y 0,33 g/kg de IVIG, también evitó el agotamiento de las plaquetas (Fig. 5c). Sin embargo, cuando se administró IVIG a 0,1 g/kg, no evitó el agotamiento de plaquetas por MWReg30 (Fig. 5b). A diferencia de IVIG, cuando se administró rhIgG1 Fc a 0,033 g/kg, que es la misma relación molar que 0,1 g/kg de IVIG, evitó el agotamiento de plaquetas por MWReg30 (Fig. 5c). Estos resultados indican que rhIgG1 Fc bloquea de manera eficiente el agotamiento de plaquetas mediado por el complejo inmune MWReg30.

a Ilustración esquemática del experimento in vivo usando un modelo de ratón con PTI pasiva. Dos horas antes de la inyección de un anticuerpo antiplaquetario MWReg30 (0,1 μg/g), los ratones recibieron una inyección intraperitoneal de IVIG o rhIgG1 Fc. A las 4 h después de la inyección de MWReg30, se extrajo sangre de la vena de la cola y las plaquetas se tiñeron con líquido de dilución de Rees y Ecker y se contaron bajo un microscopio de contraste de fase. b El recuento de plaquetas residuales se cuantificó 4 h después de la inyección de MWReg30, que a su vez se inyectó 2 h después de la IVIG (1 g/kg, 0,33 g/kg o 0,12 g/kg). Cada punto representa ratones individuales. (n = 4–7 de muestras independientes). c El recuento de plaquetas residuales se cuantificó 4 h después de la inyección de MWReg30, que se administró 2 h después de hIgG1 Fc (0,33 g/kg, 0,12 g/kg o 0,033 g/kg). (n = 5-7 de muestras independientes). d Gráficos representativos de citometría de flujo que demuestran la expansión de la población endógena de Treg CD4+/Foxp3+ en el bazo. Se analizaron los bazos de los grupos de tratamiento con PBS, IVIG (1 g/kg), rhIgG1 Fc (0,33 g/kg). e Porcentajes de población de Treg de bazos de los grupos de tratamiento PBS, IVIG (1 g/kg), rhIgG1 Fc (0,33 g/kg) después de 6 h de tratamiento analizados por citometría de flujo. Cada punto representa ratones individuales. f El ARN total se aisló del bazo y se usó para PCR cuantitativa en tiempo real para medir los niveles de ARNm de IL-4, IL-33 y FcγRIIB. Se analizaron los bazos de los grupos de tratamiento con PBS, IVIG (1 g/kg), rhIgG1 Fc (0,33 g/kg). (n = 3 de muestras independientes) Las diferencias entre los grupos se determinaron mediante ANOVA unidireccional y una prueba t pareada. * P < 0,05, ** P < 0,01 y *** P < 0,001. Las barras de error representan la desviación estándar.

Debido a que la IgG1 Fc α-2,6 sialilada en IVIG ejerce actividad antiinflamatoria al expandir la población de células T reguladoras (Treg) y promover la expresión de FcγRIIB a través de las citoquinas TH2 IL-33 e IL-412,13, examinamos si rhIgG1 Fc también recapitule la actividad antiinflamatoria de α-2,6 IgG1 Fc sialilada examinando la población de Treg y la expresión de IL-33, IL-4 y FcγRIIB en el bazo. Los resultados confirmaron que la población de células T reguladoras CD4+/Foxp3+ tiene una tendencia a aumentar después de 6 h de tratamiento en los grupos IVIG y rhIgG1 Fc, aunque no alcanza significación estadística (Fig. 5d, e). Además, confirmamos que la expresión de IL-33, IL-4 y FcγRIIB aumentó significativamente en los grupos de tratamiento IVIG y rhIgG1 Fc (Fig. 5f). Estos resultados muestran que la rhIgG1 Fc derivada de pollo promueve la expresión de citocinas TH2 y FcγRIIB y, por lo tanto, recapitula con éxito los mecanismos de la actividad antiinflamatoria mediada por la IgG1 Fc sialilada α-2,6 en IVIG.

Aquí, desarrollamos pollos con genoma editado que producen rhIgG1 Fc en suero y yema de huevo. Mostramos que los pollos ALB::hIgG1 Fc secretan rhIgG1 Fc en suero y yema de huevo, y que rhIgG1 Fc derivado de pollos ALB::hIgG1 Fc es un agente antiinflamatorio funcional. Además, sugerimos que los pollos con genoma editado se pueden usar como una plataforma eficiente para la producción de una alternativa de IVIG con actividad antiinflamatoria mejorada. Además, sugerimos que apuntar a los principales genes codificadores de proteínas séricas expresados predominantemente en el hígado de pollo es un enfoque eficiente para acumular biofarmacéuticos altamente galactosilados, α-2,6 sialilados y afucosilados en suero y yema de huevo.

Encontramos que los pollos ALB::hIgG1 Fc mostraron una expresión dominante de los transcritos de hIgG1 Fc en el hígado, y que el patrón de N-glicosilación albergado por hIgG1 Fc derivado de pollos ALB::hIgG1 Fc mostró altos niveles de sialilación α-2,6 y bajos niveles de fucosilación. En particular, los N-glicanos sialilados comprendían alrededor del 30 % de los N-glicanos totales. Esta es una relación de sialilación bastante eficiente considerando que la hIgG1 Fc es una proteína apenas sialilada debido a su estructura49. En general, la IgG1 humana producida a partir del sistema de expresión de los mamíferos tiene Fc apenas sialilada, y la IgG1 humana natural del plasma humano tiene una tasa de sialilación baja (alrededor del 10 % del total de N-glucanos)26,27. Además, la IgG humana producida a partir de sistemas de expresión de mamíferos, así como la IgG1 humana natural a partir de plasma, contienen altos niveles de Fc26,27 fucosilado central. Por lo tanto, los pollos ALB::hIgG1 Fc son un sistema único para producir hIgG1 Fc con abundantes sialilaciones terminales y bajos niveles de fucosilación. Además, confirmamos que los residuos terminales de ácido siálico de rhIgG1 Fc derivados de pollos ALB::hIgG1 Fc están principalmente unidos a α-2,6, lo cual es fundamental para la inducción de la actividad antiinflamatoria11. Por lo tanto, un biorreactor de pollo es una plataforma eficiente para producir hIgG1 Fc que alberga N-glicanos beneficiosos para inducir actividad antiinflamatoria.

Nuestro análisis del patrón de N-glicosilación detectó N-glicanos menores, que originalmente no se identificaron en el suero, en rhIgG1 Fc derivada de la yema de huevo. Este resultado es consistente con el de un informe anterior que muestra que varios N-glicanos, que no estaban identificados en el suero IgY, se detectaron en la yema de huevo IgY; por lo tanto, parece que se realizan modificaciones menores en los N-glucanos cuando las proteínas se transportan del suero a la yema de huevo50. Además, no detectamos la proteína de fusión ALB-Fc en la yema de huevo (aunque originalmente se detectó en el suero), lo que sugiere que la proteína de fusión ALB-Fc no procesada no se transfirió a la yema de huevo, o que la escisión de Fc del compañero de fusión ocurrió durante el proceso de transporte, como se informó anteriormente33.

Cuando analizamos la afinidad de rhIgG1 Fc por FcγR humanos, encontramos que rhIgG1 Fc tiene una afinidad significativamente mayor por FcγRIIIA debido a los bajos niveles de fucosilación. Por lo tanto, rhIgG1 Fc inhibió el entrecruzamiento de FcγRIIIA mediado por complejos inmunes más potentemente que la IVIG comercial. Estos resultados indican que rhIgG1 Fc bloquea eficazmente FcγRIIIA de forma monovalente. Esto es importante porque el bloqueo multivalente de FcγRIIIA por anticuerpos monoclonales induce efectos secundarios adversos mediados por el entrecruzamiento de FcγRIIIA, aunque recapitule potentemente la actividad antiinflamatoria de IVIG y mostró eficacia en la PTI refractaria22,51. Un estudio reciente informó que el bloqueo monovalente de FcγRIIIA por un fragmento Fab evita la toxicidad mediada por el entrecruzamiento de FcγRIIIA47. De acuerdo con esto, la hIgG1 Fc baja en fucosilación derivada de pollos ALB::hIgG1 Fc bloqueó monovalentemente FcγRIIIA con mayor afinidad que la IVIG humana e indujo una respuesta antiinflamatoria sin toxicidad asociada. Por lo tanto, el sistema de biorreactor de pollo puede ser una plataforma de producción óptima para hIgG1 Fc con bloqueo mejorado de FcγRIIIA y actividad antiinflamatoria posterior debido a la baja fucosilación.

También esperamos que rhIgG1 Fc tenga una mayor afinidad por DC-SIGN porque este último se sugirió como receptor para reconocer Fc52 sialilado α-2,6. Desafortunadamente, en nuestro entorno de análisis de SPR, no se pudo medir la afinidad de IVIG y rhIgG1 Fc con DC-SIGN humano. Estos resultados están de acuerdo con un informe reciente que muestra que DC-SIGN humano mostró una afinidad de unión insignificante a Fc sialilado α-2,6 en citometría de flujo y análisis SPR53. Es posible que se requieran otros métodos, como ELISA basados en células, para medir la afinidad entre Fc sialilado y DC-SIGN.

Para confirmar que rhIgG1 Fc derivado de pollos con genoma editado también tiene actividad antiinflamatoria in vivo, administramos rhIgG1 Fc a un modelo de ratón con PTI pasiva. Encontramos que rhIgG1 Fc derivado de pollos con genoma editado ejerce actividad antiinflamatoria en estos ratones, incluso en dosis más bajas. Debido a que los informes anteriores mostraron que la mejora de la sialilación de α-2,6 en la región Fc mejora significativamente la actividad antiinflamatoria de IVIG, la actividad antiinflamatoria mejorada de rhIgG1 Fc derivada de pollos editados con genoma podría deberse a una mayor sialilación de α-2,6 de Fc que la IVIG derivada de plasma10,11,12,54. Además, rhIgG1 Fc con bajo contenido de fucosilación también puede afectar a la actividad antiinflamatoria mejorada de rhIgG1 Fc y este resultado está de acuerdo con un estudio reciente que muestra que la IgG no fucosilada y la galactosilada tienen una actividad antiinflamatoria mejorada in vivo55.

En nuestro estudio, tanto IVIG como rhIgG1 Fc tienen una tendencia a expandir la población Treg y promovieron la expresión de IL-33, IL-4 y FcγRIIB, lo que sugiere que hIgG1 Fc derivado de pollos ALB::hIgG1 Fc recapitula con éxito el efecto antiinflamatorio. actividad de IgG1 Fc α-2,6 sialilada en IVIG. Con base en estos resultados, sugerimos aquí que los pollos ALB::hIgG1 Fc tienen el potencial de ser una de las fuentes de suministro de la alternativa IVIG y resolverán las limitaciones de la terapia IVIG relacionadas con la escasez de suministro. Además, propusimos que las características de N-glicosilación de las proteínas recombinantes derivadas de pollos ALB::hIgG1 Fc son óptimas para la producción de productos sanguíneos derivados del hígado humano, como factores de coagulación sanguínea, porque los factores sanguíneos humanos también tienen un perfil de N-glicosilación que comprende altamente Formas α-2,6 sialiladas y bajas en fucosiladas, que es idéntica a la de las proteínas derivadas del hígado de pollo56. Finalmente, los pollos no producen glicanos no humanos; por lo tanto, los pollos con genoma editado pueden ser una plataforma óptima para la producción de productos sanguíneos humanos recombinantes humanizados. De lo contrario, las glicoformas altamente galactosiladas, sialiladas y poco fucosiladas producidas en la yema de huevo pueden dar lugar a anticuerpos monoclonales no solo con funciones efectoras Fc mejoradas (como la actividad CDC y ADCC), sino también con una vida media sérica aumentada57.

De manera concluyente, demostramos aquí que el sistema de biorreactor de pollo que se enfoca en el gen principal de la proteína sérica acumula eficientemente hIgG1 Fc en suero y yema de huevo y este enfoque tiene el potencial de aplicarse ampliamente para producir varios productos biofarmacéuticos con mayor eficacia a través de un patrón óptimo de N-glicosilación.

El manejo y uso experimental de pollos y ratones fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC), Universidad Nacional de Seúl (SNU-190401-1-2 y SNU-210726-1-1). Los animales de experimentación se cuidaron de acuerdo con un programa de manejo estándar en la Granja de Animales de la Universidad y el Instituto de Recursos de Animales de Laboratorio de la Universidad Nacional de Seúl.

El vector CRISPR/Cas9 dirigido al intrón 13 del gen ALB de pollo se construyó utilizando el vector PX459 (plásmido Addgene n.º 62988). Para insertar secuencias de ARN guía (ARNg) en el plásmido CRISPR/Cas9, se diseñaron y sintetizaron oligonucleótidos sentido y antisentido (Bioneer, Daejeon, Corea). Estos oligonucleótidos se hibridaron en las siguientes condiciones de termociclado: 30 s a 95 °C, 2 min a 72 °C, 2 min a 37 °C y 2 min a 25 °C. Para el etiquetado dirigido de hIgG1 Fc al extremo 3' del gen ALB, el plásmido donante que contiene el intrón 13 y el exón 14 del gen ALB y T2A, seguido de la secuencia codificante de hIgG1 Fc y el sitio de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina se sintetizó en el pBHA columna vertebral vectorial (Bioneer, Daejeon, Corea). Los oligonucleótidos utilizados para la construcción del vector CRISPR/Cas9 se enumeran en la Tabla complementaria 3.

Para el establecimiento de la línea de PGC, las PGC macho White Leghorn (WL) se mantuvieron y subpasaron en DMEM knockout (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con 20 % de FBS (Invitrogen), 2 % de suero de pollo (Sigma-Aldrich, St. Louis , MO), 1x nucleósidos (Millipore, Temecula, CA), l-glutamina 2 mM, 1x aminoácidos no esenciales, β-mercaptoetanol, piruvato de sodio 10 mM, 1x antibiótico-antimicótico (Invitrogen) y crecimiento de fibroblastos básicos humanos factor (10 ng/ml; Sigma-Aldrich). Las CGP de pollo se cultivaron en una incubadora a 37 °C en una atmósfera con un 5 % de CO2 y una humedad relativa del 60 al 70 %. Las PGC se subcultivaron en fibroblastos embrionarios de ratón inactivados con mitomicina a intervalos de 5 a 6 días mediante pipeteo suave. Para la edición del genoma en CGP de pollo, se introdujeron conjuntamente plásmidos CRISPR/Cas9 (3 µg) y plásmidos donantes (3 µg) en 1 × 105 CGP cultivadas con 6 µl de reactivo Lipofectamine 2000 suspendido en 1 ml de OptiMEM. Luego, 4 h después de la transfección, la mezcla de transfección se reemplazó con medio de cultivo PGC. Se añadió puromicina (1 µg/ml) al medio de cultivo 1 día después de la transfección. Después de 2 días de tratamiento con puromicina, las PGC seleccionadas se lavaron y reemplazaron con medio de cultivo de PGC nuevo y se expandieron durante 4 a 6 semanas. La inserción dirigida del plásmido donante se confirmó mediante análisis de PCR de ADN genómico. Los cebadores utilizados en este estudio se enumeraron en la Tabla complementaria 3.

Para producir pollos con genoma modificado, se cortó una ventana en el extremo afilado del óvulo receptor Korean Ogye (KO) y se trasplantaron más de 3000 WL PGC con genoma modificado en la aorta dorsal de embriones receptores de las etapas 14 a 17 de Hamburger y Hamilton. . La ventana del huevo se selló con una película de parafina y los huevos se incubaron con el extremo puntiagudo hacia abajo hasta que eclosionaron. Los pollitos nacidos se criaron en la granja de animales institucional. Después de la maduración sexual, los gallos receptores fueron apareados con gallinas WT. La progenie modificada con genoma se identificó en función del color de las plumas de la descendencia y el posterior análisis y secuenciación del ADN genómico.

Para cuantificar rhIgG1 Fc en suero, se recogió sangre entera de pollo ALB+/hIgG1 Fc y ALBhIgG1 Fc/hIgG1 Fc y se añadió solución de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 0,5 M a la sangre recogida para evitar la coagulación de la sangre. Las muestras de sangre recolectadas se centrifugaron a 2000 rpm, 10 min, 4 °C y los sobrenadantes se recolectaron y usaron para el análisis ELISA. Para cuantificar rhIgG1 Fc en yema de huevo, se recogieron huevos puestos de cuatro pollos G2 ALB+/hIgG1 Fc y se separaron las yemas de huevo de las claras. Las muestras de suero y yema recogidas se diluyeron en DW y se cuantificaron mediante ELISA utilizando un kit ELISA de IgG humana (ab100547, Abcam, Cambridge, Reino Unido), según las instrucciones del fabricante. Las concentraciones medidas se dividieron en tres para ajustar el peso molecular de IgG estándar a rhIgG1 Fc.

Para la purificación de Fc de IgG1 humana a partir de suero de pollo transgénico, se añadió lentamente sulfato de amonio 4 M al suero de pollo. La mezcla se agitó durante la noche a 4 °C y luego se centrifugó durante 30 min a 4 °C a 10 000 g. El sedimento se resuspendió en un volumen igual de PBS 1x al volumen de suero original. Luego, la mezcla se dializó frente a tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,2). La muestra se cargó en una columna de proteína A (GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, Suecia) y la proteína se eluyó con 100 ml de gradiente de ácido cítrico 100 mM (pH 2,8). La proteína se purificó y fraccionó adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) utilizando una columna HiLoad Superdex 75 (GE Healthcare Bio-Sciences) preequilibrada con Tris-HCl 20 mM, NaCl 175 mM (pH 7,4). Para la purificación de IgG1 Fc humana a partir de yema de huevo, se separó la yema de huevo y se diluyó con 9 volúmenes de agua destilada. La muestra se congeló a -20 °C durante la noche y se descongeló a temperatura ambiente. Después de descongelar, el líquido sobrenadante se recogió y filtró. Luego, la muestra se cargó en una columna de Proteína A (GE Healthcare Bio-Sciences) y la proteína se eluyó con 100 ml de gradiente de ácido cítrico 100 mM (pH 2,8).

Para la transferencia Western de rhIgG1 Fc en suero y yema, el suero de pollo ALB+/hIgG1 Fc se diluyó en agua destilada (DW) y la yema de huevo de pollo ALB+/hIgG1 Fc se pretrató mediante el método de congelación y descongelación como se describe en Purificación de humanos. IgG1 Fc de la sección de suero y yema de huevo. El suero de pollo de tipo salvaje se usó como control. La muestra preparada se sometió a electroforesis en gel de poliacrilamida al 10%, se transfirió a una membrana de fluoruro de polivinilideno (Millipore, Billerica, MA). Después de la transferencia, la membrana de fluoruro de polivinilideno se bloqueó con leche descremada al 3 % durante 1 hora a temperatura ambiente (BD Biosciences, San José, CA). La membrana bloqueada se incubó con anticuerpo primario IgG antihumano de cabra (10319, Alpha diagnostic, San Antonio, TX) a 4 °C durante la noche. El anticuerpo primario se lavó tres veces con tampón PBST al 0,1 % y la membrana se incubó con anticuerpo secundario IgG anti-cabra de burro conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (sc-2020, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EE. UU.) durante 1 h a temperatura ambiente. Después de lavar el anticuerpo secundario, se detectó la actividad de la enzima HRP agregando sustrato de transferencia Western ECL (GE Healthcare Bio-Sciences).

El análisis de N-glucano de rhIgG1 Fc derivado de pollo ALB::hIgG1 Fc se realizó mediante UPLC/MS-MS. Brevemente, se incubó rhIgG1 Fc purificada con PNGasa F durante 16 ha 37 °C. Se precipitó rhIgG1 Fc desglicosada usando etanol y se centrifugó a 10.000 g durante 10 min. El sobrenadante que contenía el N-glicano liberado se transfirió a un tubo nuevo y se secó por completo usando un concentrador Speed-Vac. La muestra seca se marcó con procainamida para el análisis de fluorescencia. La muestra de N-glucanos marcados se analizó y cuantificó mediante UPLC/MS-MS. Se utilizó una columna ACQUITY UPLC BEH Glycan (1,2 × 150 mm, 1,7 μm; Waters, New Castle, DE) con un detector de fluorescencia (Waters iClass UPLC) para la separación y detección de N-glicanos. Las condiciones de CL fueron las siguientes: caudal (0,5 ml/min), temperatura de la columna (60 °C), tampón A de la fase móvil (formato de amonio 100 mM, pH 4,5), tampón B (acetonitrilo al 100 %), volumen de inyección (8 ml), gradiente lineal (75–60 % B durante 46,5 min, 60–0 % B durante 1,5 min, 0 % B durante 1 min, 0–75 % B durante 1 min y 75 % B durante 13 min). Se utilizó una espectrometría de masas de alta resolución, triple-TOF MS (AB SCIEX, Concord, Ontario, Canadá), para la identificación de N-glicanos. La distribución de N-glicanos se analizó con Empower (Waters).

La EPO recombinante derivada de células CHO y rhIgG1 Fc purificada (Cat No. 100-64, Peprotech) se incubaron en tampón desnaturalizante de glicoproteínas (New England Biolabs, Ipswich, MA, EE. UU.) a 100 °C durante 10 min. Luego, la muestra se escindió agregando PNGase F (New England Biolabs) de acuerdo con los protocolos del fabricante. La rhIgG1 Fc purificada y desglicosilada se sometió a electroforesis en gel de poliacrilamida al 10% y se transfirió a una membrana de fluoruro de polivinilideno (Millipore) para la transferencia de lectina. La membrana se bloqueó con albúmina de suero bovino al 3 % (Sigma-Aldrich) en solución salina tamponada con Tris (Tris 20 mM, NaCl 0,5 M, pH 7,5; TBS) a 4 °C durante la noche. Posteriormente, la membrana se incubó con 1,0 μg/ml de lectinas biotinadas SNA/EBL (específica ɑ2,6-SA; Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE. UU.) y MAL II (específica ɑ2,3 SA; Vector Laboratories) en TBST ( TBS que contenía Tween 20 al 0,05 % durante 1 h. Después de lavar dos veces con tampón TBST, las membranas se incubaron con avidina conjugada con peroxidasa de rábano picante (kit VECTASTAIN ABC; Vector Laboratories) durante 1 hora. La membrana se lavó con tampón TBST y la tinción se realizó con reactivos de detección de transferencia Western ECL (GE Healthcare Bio-Sciences).

Para el análisis de SPR, se adquirió IVIG de GC pharma, Yong-in, Korea. Los FcγR humanos se adquirieron de Sino Biological Inc, Beijing, China (FcγRIA-10256-H08H; FcγRIIA 167 Arg-10374-H08H; FcγRIIIA F176V-10389-H08H1; FcRn-CT009-H08H; DC-SIGN-10200-H01H). rhIgG1 Fc se purificó a partir de suero de pollo ALB::hIgG1 Fc juvenil. El análisis SPR se realizó con Biacore T200 (GE Healthcare, Chicago, IL, EE. UU.). Los FcγR se inmovilizaron en un chip sensor CM5 (BR-1005-30, GE Healthcare). Se inyectaron IVIG y rhIgG1 Fc en el chip sensor revestido con FcγRs. Los ensayos cinéticos se realizaron mediante dilución en serie al triple para FcγRIA, FcγRIIA, FcγRIIIA, DC-SIGN y dilución en serie al doble para FcRn. Para FcγRIA y DC-SIGN, la dilución comenzó desde 300 nM. Para FcγRIIA, la dilución comenzó desde 20 μM. Para FcγRIIIA, la dilución comenzó con 3 μM de IVIG y 300 nM de hIgG1 Fc. Para FcRn, la dilución comenzó con 500 nM de IVIG y 250 nM de rhIgG1 Fc. La regeneración se realizó mediante inyección de glicina 10 mM para FcγRIA, FcγRIIA, FcγRIIIA, DC-SIGN y Tris-HCl 100 mM para FcRn. La constante de disociación (KD) para la unión monomérica de IVIG y rhIgG1 Fc a FcγRs se calculó mediante un modelo cinético de ciclo único para FcγRIA, FcγRIIA, FcγRIIIA y un modelo cinético multiciclo para FcRn, DC-SIGN.

Los ensayos de ADCC se realizaron utilizando un kit completo de bioensayo de reportero de ADCC (G7014, Promega, Madison, WI, EE. UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, las células WIL2-S positivas para CD20 se resuspendieron en RPMI 1640 y suero humano bajo en IgG y se sembraron a razón de 10 000 células por pocillo en una placa de cultivo opaca de 96 pocillos que contenía células T Jurkat efectoras que expresan FcγRIIIA manipuladas genéticamente. Estas células T Jurkat modificadas genéticamente también tienen un gen informador de luciferasa cuya expresión está impulsada por el elemento de respuesta NFAT. Luego, se agregaron IVIG (GC pharma) o rhIgG Fc y anticuerpo anti-CD20 diluido en serie y se incubaron durante 6 h a 37 °C, CO2 al 5 %. El entrecruzamiento de FcγRIIIA y la activación de la señalización de NFAT se determinó mediante el ensayo Bio-Glo Luciferase y se tomaron medidas en un lector de microplacas.

Los ensayos de ADCP se realizaron utilizando un kit completo de bioensayo ADCP Reporter (G9901, Promega) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, las células Raji positivas para CD20 se resuspendieron en RPMI 1640 y suero humano bajo en IgG y se sembraron a razón de 10 000 células por pocillo en una placa de cultivo opaca de 96 pocillos que contenía células T Jurkat efectoras que expresan FcγRIIA manipuladas genéticamente. Estas células T Jurkat modificadas genéticamente también tienen un gen informador de luciferasa cuya expresión está impulsada por el elemento de respuesta NFAT. Luego, se añadieron IVIG o rhIgG Fc y anticuerpo anti-CD20 diluido en serie y se incubaron durante 6 horas a 37 °C, 5 % de CO2. La reticulación de FcγRIIA y la activación de la señalización de NFAT se determinaron utilizando el ensayo Bio-Glo Luciferase y se tomaron medidas en un lector de microplacas.

Se usaron 8 semanas de ratón C57BL/6 hembra en un experimento in vivo. Antes de comenzar el experimento, se recolectaron muestras de sangre de cada ratón de la vena de la cola. Las plaquetas se tiñeron con una solución de azul de cresilo brillante al 1% y los recuentos de plaquetas se calcularon bajo el microscopio óptico (0 h recuentos de PLT). Después de eso, se inyectaron dosis de 1 g/kg, 0,33 g/kg y 0,12 g/kg de IVIG (GC pharma) y dosis de 0,33 g/kg, 0,12 g/kg y 0,033 g/kg de rhIgG1 Fc por vía intraperitoneal (ip) cavidad. Después de 2 h de inyección de IVIG y rhIgG1 Fc, se inyectó el anticuerpo antiplaquetario MWReg30 (0,1 μg/g) en la cavidad ip. Después de 4 h de MWReg30, se extrajo sangre de la vena de la cola y se realizó la tinción de plaquetas usando una solución de azul de cresilo brillante al 1%, y se calcularon los recuentos de plaquetas bajo el microscopio óptico (recuentos de PLT de 4 h). El porcentaje de recuentos de plaquetas residuales se calculó dividiendo los recuentos de PLT de 4 h por los recuentos de PLT de 0 h.

Se recogió el bazo de cada ratón 6 h después de la inyección de PBS, IVIG (1 g/kg) y rhIgG1 Fc (0,33 g/kg). Las células de bazo se tiñeron usando un kit de detección de Treg de ratón (130-120-674, Miltenyi Biotic, Bergisch Gladbach, Alemania). Las células se tiñeron con anticuerpo anti-CD25 de ratón marcado con APC y anticuerpo CD4 marcado con Vio-Blue durante 30 min en refrigeración. A continuación, las células se lavaron con PBS, se permeabilizaron y se fijaron con una solución de fijación/permeabilización durante 30 min en la oscuridad y bajo refrigeración. Después de lavar dos veces, las células se trataron con anticuerpo anti-Foxp3 de ratón marcado con PE durante 30 min en la oscuridad y bajo refrigeración. Las células teñidas se corrieron en un citómetro de flujo (BD Biosciences, San Jose, CA) y los datos se analizaron usando un software FlowJo (Tree Star, Ashland, OR).

Se recogió el bazo de cada ratón 6 h después de la inyección de PBS, IVIG (1 g/kg) y rhIgG1 Fc (0,33 g/kg). El ARN total se extrajo de muestras de bazo utilizando el reactivo TRIzol (Molecular Research Center, EE. UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante y el ADNc se sintetizó utilizando el sistema de síntesis de primera cadena Superscript III (Invitrogen). La mezcla de PCR contenía 2 μL de tampón de PCR, 1 μL de colorante EvaGreen qPCR 20x (Biotium, Hayward, CA, EE. UU.), 0,4 μL de mezcla de 10 mmol/L de dNTP y 10 pmol de cebadores directos e inversos específicos de genes (Cuadro complementario 3). RT-qPCR se realizó por triplicado. La expresión génica diana relativa se cuantificó después de la normalización frente a la expresión de gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) de ratón como control endógeno.

Para el análisis de vida media, se inyectaron ip rhIgG1 Fc purificada a partir de yema de huevo y Fc recombinante derivada de células HEK293 (10702-HNAH, Sino Biological Inc) en ratones hembra C57BL/6 durante 8 semanas a una dosis de 100 μg/ratón. Después de 24 h de la inyección, se recogió sangre a través de la vena de la cola durante 5 días y se obtuvo el suero mediante centrifugación. La concentración sérica de rhIgG1 Fc purificada a partir de yema de huevo y Fc recombinante derivada de células HEK293 se determinó mediante ELISA utilizando un kit ELISA de IgG humana (Abcam). La vida media se calculó mediante análisis de regresión no lineal.

Cada experimento se realizó con al menos tres muestras y animales biológicamente independientes para la reproducibilidad y el análisis estadístico se realizó con GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA, EE. UU.). Las diferencias significativas entre más de dos grupos se determinaron mediante un análisis de varianza ANOVA unidireccional con la prueba de comparación múltiple de Bonferroni. El análisis estadístico entre dos grupos se analizó mediante una prueba t pareada. Los datos se presentaron como valores de media ± desviación estándar. Un valor de P < 0,05 indicó significación estadística.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el presente estudio se pueden encontrar en las figuras, tablas e información complementaria. Los datos de origen utilizados para generar gráficos en el texto principal están disponibles en Datos complementarios 1. La imagen de gel sin procesar se puede encontrar en la Fig. 5 complementaria. Todos los demás datos están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Este trabajo fue apoyado por la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el gobierno de Corea (MSIT) [NRF-2015R1A3A2033826].

Estos autores contribuyeron igualmente: Jin Se Park, Hee Jung Choi.

Departamento de Biotecnología Agrícola e Instituto de Investigación de Agricultura y Ciencias de la Vida, Universidad Nacional de Seúl, Seúl, República de Corea

Jin Se Park, Hee Jung Choi, Kyung Min Jung, Kyung Youn Lee, Ji Hyeon Shim, Kyung Je Park, Young Min Kim y Jae Yong Han

Avinnogen Co., Ltd, 1 Gwanak-ro, Gwanak-gu, Seúl, República de Corea

Jin Se Park y Young Min Kim

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JYH participó en el diseño del estudio y la coordinación general; JSP participó en el diseño del estudio y llevó a cabo los experimentos, interpretación de datos y escribió el primer borrador del manuscrito; HJC llevó a cabo los experimentos, la interpretación de datos y escribió el primer borrador del manuscrito. KMJ, KYL y JHS llevaron a cabo experimentos. KJP llevó a cabo el manejo de animales experimentales. YMK y JYH llevó a cabo la interpretación de datos y participaron en la redacción de la versión final del manuscrito.

Correspondencia a Jae Yong Han.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Eve Rogers y Anam Akhtar. Un archivo de revisión por pares está disponible.

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Park, JS, Choi, HJ, Jung, KM et al. Producción de IgG1 Fc humana recombinante con un patrón de N-glicosilación beneficioso para la actividad antiinflamatoria utilizando pollos con genoma editado. Commun Biol 6, 589 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04937-5

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Recibido: 28 abril 2022

Aceptado: 12 de mayo de 2023

Publicado: 01 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04937-5

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Producción de IgG1 Fc humana recombinante con N beneficioso