Los macrófagos residentes de TREM2hi protegen el corazón séptico al mantener la homeostasis de los cardiomiocitos

Nature Metabolism volumen 5, páginas 129–146 (2023)Citar este artículo

9273 Accesos

5 citas

46 Altmetric

Detalles de métricas

La miocardiopatía inducida por sepsis (SICM) es común en pacientes sépticos con una alta mortalidad y se caracteriza por una respuesta inmune anormal. Debido a la heterogeneidad celular, comprender las funciones de los subconjuntos de células inmunitarias en SICM ha sido un desafío. Aquí identificamos una subpoblación única de macrófagos residentes en el corazón denominada CD163+RETNLA+ (Mac1), que se autorrenueva durante la sepsis y puede ser el objetivo para prevenir la SICM. Al combinar la secuenciación de ARN de una sola célula con el mapeo del destino en un modelo de sepsis en ratones, demostramos que la subpoblación Mac1 tiene firmas transcriptómicas distintas enriquecidas en endocitosis y muestra una alta expresión de TREM2 (TREM2hi). Las células TREM2hi Mac1 eliminan activamente las mitocondrias disfuncionales expulsadas por cardiomiocitos. La deficiencia de Trem2 en los macrófagos afecta la capacidad de autorrenovación de la subpoblación Mac1 y, en consecuencia, da como resultado una eliminación defectuosa de las mitocondrias dañadas, una respuesta inflamatoria excesiva en el tejido cardíaco, una disfunción cardíaca exacerbada y una supervivencia reducida. En particular, la administración intrapericárdica de células TREM2hi Mac1 previene la SICM. Nuestros hallazgos sugieren que la modulación de las células TREM2hi Mac1 podría servir como una estrategia terapéutica para SICM.

La sepsis afecta aproximadamente a 49 millones de personas y provoca más de 11 millones de muertes en todo el mundo cada año1,2. La mayoría de los pacientes con sepsis muestran una función cardíaca aberrante, generalmente denominada SICM3. Como contribuyente importante a la disfunción orgánica, la SICM se caracteriza por una fracción de eyección (FE) reducida y se asocia con una alta mortalidad en los pacientes. Es de destacar que también se observa disfunción miocárdica reversible transitoria en SICM, lo que sugiere que la homeostasis cardíaca puede restaurarse después del estrés séptico4,5,6; sin embargo, los mecanismos que facilitan la rehabilitación cardíaca durante la sepsis no se han dilucidado por completo.

Las células inmunitarias desempeñan funciones vitales en la regulación de la homeostasis tisular después de una lesión cardíaca7. En el tejido cardíaco, los macrófagos son células inmunitarias dominantes, que son muy heterogéneas y de linaje diversificado8,9,10. Durante la última década, los macrófagos derivados de la médula ósea (circulantes) han sido considerados como los únicos fagocitos primarios, que están involucrados, por ejemplo, en la curación y homeostasis del tejido cardíaco11; sin embargo, la evidencia emergente indica que los macrófagos residentes en el corazón (CRM, por sus siglas en inglés) desempeñan un papel fundamental en la eliminación de células y desechos necróticos, la promoción de la angiogénesis, la restricción de la inflamación y la remodelación de tejidos durante el proceso de lesión cardíaca, que son independientes de los macrófagos circulantes10,12, 13 Muy recientemente, un estudio demostró que los CRM eliminan las mitocondrias en descomposición expulsadas por los cardiomiocitos para mantener la salud del corazón14.

Un corazón séptico tiene un alto requerimiento de energía bajo estrés, incluyendo temperatura corporal elevada, hipoxia, taquicardia y tormenta sistémica de citoquinas. En línea con este cambio patológico, la disfunción mitocondrial cardíaca se ha demostrado en muchos estudios con animales15,16. Clínicamente, la disfunción mitocondrial se correlaciona directamente con malos resultados de sepsis17,18. Por lo tanto, el mantenimiento de la homeostasis mitocondrial cardíaca es fundamental para la recuperación de la SICM; sin embargo, la forma en que las células inmunitarias sirven como manipuladores del control de calidad mitocondrial en el corazón séptico sigue siendo completamente desconocida.

En el presente estudio, al combinar la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) con técnicas de mapeo del destino, perfilamos los cambios dinámicos de las células inmunitarias cardíacas, especialmente los macrófagos cardíacos, en el corazón séptico murino. Identificamos una subpoblación CD163+RETNLA+ Mac1 con capacidad de autorrenovación que fue fundamental para apoyar la función cardíaca bajo estrés séptico. El análisis funcional y fenotípico profundo reveló que la subpoblación Mac1 se caracterizaba por firmas transcriptómicas endocíticas y por una alta expresión de TREM2. Además, observamos que la subpoblación de macrófagos TREM2hi eliminó activamente las mitocondrias expulsadas por cardiomiocitos y, por lo tanto, promovió la homeostasis cardíaca en la sepsis. La ablación de Trem2 en los macrófagos perjudicó la capacidad de autorrenovación de las células Mac1, lo que resultó en la acumulación de mitocondrias disfuncionales en el espacio extracelular del miocardio y exacerbó la función cardíaca después de la sepsis. Finalmente, la administración intrapericárdica de células TREM2hi Mac1 mejoró la función cardíaca y previno la SICM. Estos hallazgos brindan una perspectiva para el desarrollo de inmunoterapias de SICM dirigidas a TREM2.

Para explorar los mecanismos de la disfunción miocárdica reversible durante el estrés séptico, establecimos el modelo murino séptico (modelo de punción y ligadura cecal (CLP)) y perfilamos el corazón séptico mediante ecocardiografía y biomarcadores de lesión cardíaca. Como era de esperar, la función cardíaca se deterioró constantemente con la progresión de la sepsis y empeoró significativamente 3 días después de CLP. Posteriormente, la función cardíaca se recuperó gradualmente (datos extendidos Fig. 1a-d). De manera congruente, los parámetros de lesión cardíaca (lactato deshidrogenasa (LDH), troponina I, Anp y Bnp) también mostraron cambios dinámicos comparables (Datos extendidos Fig. 1e-h). Debido al papel crucial de la inflamación en la patología de la SICM, los marcadores inflamatorios cardíacos se midieron mediante una matriz de proteínas multiplex. Los niveles de factor estimulante de colonias de granulocitos, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, interleucina (IL)-4, IL-1α, IL-9, interferón (IFN)-γ, IL-1β, IL-21 e IL-10 en el corazón alcanzó un pico 3 d después de CLP y luego disminuyó lentamente a medida que avanzaba el tiempo (Datos extendidos Fig. 1i). Estos resultados indican que los cambios dinámicos de la función cardíaca durante la progresión de la sepsis son consistentes con el entorno inflamatorio del tejido cardíaco.

A continuación, caracterizamos los tipos y estados de las células inmunitarias involucradas en SICM utilizando scRNA-seq. Las células CD45+ nucleadas metabólicamente activas se separaron mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) de 14 ratones en diferentes momentos. Se seleccionó un total de 29 537 células con control de calidad positivo para un análisis posterior, lo que generó en promedio alrededor de 9362 lecturas mapeadas y 2718 genes por célula (Fig. 1a y Datos extendidos Fig. 2a). Como era de esperar, el análisis de agrupamiento imparcial reveló múltiples grupos de células inmunitarias cardíacas (Fig. 1b), que incluían macrófagos (Adgre1 y Fcgrt), monocitos (Plac8 y Chil3), neutrófilos (S100a8/a9), células asesinas naturales (NK)/T (Cd3e, Klrk1 e Il7r), células B (Igkc y Cd79a) y células en ciclo (Mki67 y Stmn1) (Fig. 1c, d y Datos extendidos Fig. 2b, c). Entre ellos, los macrófagos fueron las células más abundantes con un rico conjunto de subgrupos en el corazón. Al comparar los cambios de las células inmunes en cada momento, encontramos que los porcentajes de macrófagos disminuyeron ligeramente, mientras que la heterogeneidad de los subgrupos de macrófagos fue más sustancial después de CLP. Mientras tanto, se reclutaron grandes cantidades de neutrófilos y monocitos en el miocardio después de la sepsis (Fig. 1e, f). Además de los hallazgos de scRNA-seq, el análisis de citometría de flujo confirmó los cambios paralelos en las células inmunes cardíacas durante la progresión de la sepsis (Datos extendidos Fig. 2d, e).

a, Diagrama esquemático que muestra la tubería scRNA-seq de células inmunitarias cardíacas murinas durante la progresión de la sepsis. SS, estado estacionario. b, Gráficos de proyección y aproximación de colector uniforme (UMAP) de 29 537 células inmunitarias cardíacas asignadas en 15 grupos de los corazones de 14 ratones WT en SS, 3, 7 y 21 días después de CLP. Las células cardíacas de 3 o 4 ratones se mezclaron como una muestra. c, Gráficos UMAP de células inmunitarias cardíacas coloreadas por tipo de célula. d, mapa de calor que muestra genes marcadores de grupos seleccionados (arriba, codificados por colores por grupo y condición) con genes ejemplares y anotación de tipo de célula etiquetada. e, gráficos UMAP de células inmunitarias cardíacas de ratones WT en diferentes momentos de sepsis, anotados por tipo de célula como en c. Cada punto de tiempo es contribuido por tres (SS o 21 d) o cuatro ratones (3 o 7 d). f, Gráficos de barras que muestran la distribución de tipos de células inmunitarias de ratones WT en diferentes puntos temporales de sepsis (Datos ampliados, Figs. 1 y 2).

Datos fuente

Dado que el compartimento de monocitos y macrófagos representa la población más grande y más significativamente alterada de células inmunitarias cardíacas durante la sepsis, realizamos un análisis de conglomerados no supervisado para investigar la heterogeneidad y el papel de los monocitos y macrófagos cardíacos. Se identificaron cinco subgrupos de macrófagos (Mac1–5), dos subgrupos de monocitos (Mon1 y Mon2) y un subgrupo de células dendríticas (DC) (Fig. 2a). Mac1 se caracterizó por la expresión de Retnla, Lyve1, Cd163 y Folr2, que se parecían a las firmas de los macrófagos residentes en tejido cardíaco19. Mac2 expresó niveles relativamente altos de genes de presentación de antígenos, cuyas características eran consistentes con el grupo del complejo principal de histocompatibilidad (MHC)-II informado anteriormente19,20. Mac3 estaba enriquecido en Cxcl13, Ccl8, Saa3 y algunos genes estimulados por IFN (Ifit3 e Irf7). Este grupo podría ser proinflamatorio y contener células inducibles por IFN21. Mac4 fue identificado por la expresión de Cd72 y Acp5, que fueron confirmados como marcadores de células patológicamente proinflamatorias22. Mac5 correspondió a macrófagos CCR2+12,19,23, que también expresaron altos niveles de genes de presentación de antígenos (H2-Aa y H2-Eb1). Mon1 fue el grupo de monocitos clásico con alta expresión de Ly6c2, mientras que Mon2 fue el grupo de monocitos no clásico con baja expresión de Ly6c2 (refs. 24, 25). El grupo de DC se caracterizó por altos niveles de Xcr1, Naaa e Irf8, que se informaron como marcadores de DCs26 clásicos (Fig. 2b y Extended Data Fig. 3a). Luego comparamos las diferencias dinámicas en las proporciones relativas de los ocho subgrupos entre las diferentes etapas del SICM. En particular, los subgrupos Mac1 y Mac2 se presentaron predominantemente en corazones en estado estacionario, mientras que los niveles del subconjunto Mac1 se redujeron drásticamente 3 días después de CLP. Los niveles de Mac3 y Mac4, por su parte, aumentaron notablemente 3 d después de CLP; sin embargo, a medida que la función cardíaca se recuperó gradualmente 7 y 21 días después de CLP, se restauró el subgrupo Mac1 (Fig. 2c, d). También usamos citometría de flujo e inmunofluorescencia para confirmar los resultados de scRNA-seq seleccionando CD163 y RETNLA como marcadores para Mac1. De manera consistente, la frecuencia relativa y los números absolutos de Mac1 disminuyeron 3 días después de CLP y se restauraron 7 y 21 días después de CLP (Fig. 2e, f y Datos extendidos Fig. 3b-d). Posteriormente, el análisis de correlación encontró que los números absolutos de Mac1 se correlacionaron positivamente con la FE del corazón y se correlacionaron negativamente con los niveles séricos de troponina cardíaca I (cTnI) durante la progresión de la sepsis (Fig. 2g, h). En conjunto, estos datos revelan un subgrupo distinto de CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+ Mac1 que está asociado con la restauración de la disfunción cardíaca después del estrés séptico.

a, gráficos UMAP de 24,058 monocitos-macrófagos asignados a los ocho grupos de la Fig. 1c. b, mapa de calor que muestra los 20 principales genes marcadores de grupos (arriba, codificados por colores por grupo y condición) con genes ejemplares y anotaciones de grupo etiquetadas. c, Gráficos UMAP del compartimento de monocitos-macrófagos de ratones WT en SS, 3, 7 y 21 días después de CLP, anotados por grupo como en a. d, Gráficos de barras que muestran la distribución de grupos dentro del compartimento de monocitos-macrófagos de ratones WT después de CLP. e, Gráficos de contorno representativos que muestran el análisis de citometría de flujo de macrófagos cardíacos CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+ de ratones WT después de CLP. f, Cuantificación de macrófagos CD163+RETNLA+ por mg de tejido cardíaco. Las barras muestran la media ± sem Los valores de P bilaterales se determinaron mediante análisis de varianza (ANOVA) unidireccional con la prueba de comparación múltiple de Tukey. g,h, Correlación del número de macrófagos cardíacos CD163+RETNLA+ con los niveles de EF y cTnI. Los datos se presentan como correlación de rango de Spearman de dos colas. Las líneas discontinuas representan intervalos de confianza del 95%. Cada símbolo representa un animal (SS, n = 8 ratones; CLP 3 días, n = 8 ratones; CLP 7 días, n = 9 ratones; CLP 21 días, n = 10 ratones) (f, g). Los resultados representan cuatro experimentos independientes en esta figura (Datos extendidos Fig. 3).

Datos fuente

Para determinar la posible relación entre los monocitos y el subgrupo Mac1, examinamos los estados inmunológicos dinámicos y las transiciones celulares del compartimento de monocitos y macrófagos mediante el algoritmo Monocle27. En el análisis de pseudotiempo, redujimos la muestra de monocitos-macrófagos a 1500 células para proporcionar una trayectoria de desarrollo celular clara. Observamos que las células Mac1 se ubicaron al comienzo de la trayectoria del pseudotiempo, mientras que las células Mon1, Mon2 y DC se ubicaron al final de la trayectoria. Además, la mayoría de las células Mac2 estaban en el término de la trayectoria de pseudotiempo, mientras que las células Mac3, de manera similar a las células Mac1, estaban localizadas en la rama de inicio (Fig. 3a, b y Datos extendidos Fig. 4a). El seguimiento de las alteraciones de la expresión génica en los compartimentos de monocitos y macrófagos reveló patrones de desarrollo que definen el fenotipo y la función de los subconjuntos de macrófagos. En resumen, el grupo Mac1 se caracterizó por niveles de expresión regulados al alza de Cd163, Lyve1, Retnla, Mrc1, Gas6 y Folr2 y niveles de expresión regulados a la baja de genes de monocitos (Plac8 y Chil3). Los grupos Mon1, Mon2, Mac5 y DC se caracterizaron por una expresión aumentada de Ccr2, Il1b, Chil3 y Plac8, mientras que el grupo Mac2 se caracterizó por una alta expresión de genes presentadores de antígenos (H2-Aa y H2-Ab1). Estos grupos de células mostraron la expresión reducida del perfil del gen Mac1 (Fig. 3c y Datos extendidos, Fig. 4b).

a, La predicción de Monocle de la trayectoria de desarrollo de monocitos y macrófagos con la información del grupo de Seurat en la Fig. 2a mapeada al lado. b, La predicción de Monocle de la trayectoria de desarrollo de monocitos y macrófagos con cada grupo basado en Seurat que se muestra por separado. c, Mapa de calor de los 50 DEG principales junto con el pseudotiempo. La posición relativa de los subconjuntos individuales a lo largo del pseudotiempo se ilustra a continuación. d, Gráficos de contorno representativos que muestran la expresión de tdTomato (CX3CR1) en macrófagos CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+, CD45+CD11b+F4/80+ (no CD163+RETNLA+) y CD45+CD11b+F4 /80−LY6C+ monocitos. Gráfico que muestra el porcentaje de células tdTomato+ aisladas de corazones de ratones WT en cada momento a lo largo de la sepsis. NS, no significativo. e, Gráficos de contorno representativos que muestran la expresión de tdTomato (CX3CR1) y CD163 en macrófagos CD45+CD11b+F4/80+RETNLA+ controlados y gráficos que muestran números absolutos de macrófagos CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+tdTomato+ aislados de corazones de ratones WT en cada punto de tiempo después de la sepsis. f, Histogramas representativos que muestran la expresión de Ki67 en macrófagos CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+ y gráfico que muestra la cuantificación de la intensidad de fluorescencia media (MFI) de Ki67 en SS, 3 y 7 días después de CLP. Los puntos representan sujetos individuales (d–f); SS, n = 5 ratones; CLP 3 días, n = 6 ratones; CLP 7 días, n = 7 ratones. Los datos se muestran como media ± sem; Los valores de P bilaterales se determinaron mediante ANOVA unidireccional, seguido de la prueba de comparación múltiple de Games-Howell (d) o Sidak (d-f); los resultados representan tres experimentos independientes (datos extendidos Fig. 4).

Datos fuente

Para confirmar los resultados del análisis de pseudotiempo anterior, utilizamos además una línea de ratón Cx3cr1CreERT2–IRES–YFP inducible por tamoxifeno cruzada con ratones informadores Rosa26-stop-tdTomato (denominados Cx3cr1CreERT2:Rosa26tdTom; Datos extendidos Fig. 4c) para rastrear células Mac1 en SICM. Las señales de fluorescencia de tdTomato de estos ratones informadores distinguieron de forma fiable los MRC de los macrófagos derivados de monocitos reclutados19. Alrededor del 95 % de los monocitos circulantes (CD115+CD11b+) y ~89 % de los macrófagos cardíacos (F4/80+CD11b+) fueron tdTomato+ 1 semana después de la primera administración de tamoxifeno. Tres semanas después de la administración de tamoxifeno, los monocitos circulantes fueron reemplazados gradualmente por monocitos tdTomato−, mientras que su contribución a los macrófagos cardíacos fue insignificante. En el punto temporal de 5 semanas, casi el 85 % de los macrófagos y ~98 % de las células CD163+RETNLA+ Mac1 en el corazón retuvieron tdTomato+, que luego se mantuvo en niveles similares (Datos extendidos Fig. 4d). Seis semanas después de la administración de tamoxifeno, los ratones Cx3cr1CreERT2:Rosa26tdTom se sometieron a cirugía CLP. Observamos que más del 95% de las células CD163+RETNLA+ Mac1 permanecieron como tdTomato+ 3 y 7 días después de CLP (Fig. 3d). En consecuencia, la proporción y el número absoluto de células tdTomato+ Mac1 en el corazón séptico se redujeron notablemente 3 días después de CLP y se recuperaron parcialmente 7 días después de CLP (Fig. 3e). Para determinar la proliferación de células Mac1 in vivo, se evaluó la expresión de Ki67. Las células tdTomato+ Mac1 exhibieron una alta expresión de Ki67 3 días después de CLP en comparación con aquellas en estado estacionario, lo que indica que las células Mac1 presentaron un estado proliferativo activo bajo estrés séptico (Fig. 3f y Datos extendidos Fig. 4e). Estos datos sugieren que las células CD163+RETNLA+ Mac1 son CRM de autorrenovación, independientes de la reposición de los monocitos circulantes y muestran ráfagas proliferativas durante la sepsis.

Luego buscamos explorar las características funcionales del subconjunto Mac1 en SICM. El análisis de enriquecimiento de Gene Ontology (GO) reveló que 156 genes expresados ​​​​diferencialmente (DEG) regulados positivamente en Mac1 estaban relacionados con la fagocitosis y la endocitosis en términos biológicos (Fig. 4a). Es de destacar que el gen Trem2 relacionado con la fagocitosis se reguló positivamente en las células Mac1 en relación con otros macrófagos. (Datos ampliados Fig. 5a). Luego examinamos la expresión de Trem2 en todos los grupos de células y observamos que Trem2 era particularmente abundante en el subconjunto Mac1 (Fig. 4b y Extended Data Fig. 5b). La tinción de inmunofluorescencia mostró la expresión de TREM2 en células Mac1, así como la colocalización con CD163 (Fig. 4c). El análisis de citometría de flujo mostró que las células CD163+RETNLA+ Mac1 expresaron niveles más altos de TREM2 en comparación con otros macrófagos (Fig. 4d y Datos extendidos Fig. 5c). Además, para determinar el papel de TREM2 para la remodelación del subconjunto de macrófagos en SICM, realizamos CLP en ratones deficientes en Trem2 (Trem2-/-) y controles de compañeros de camada de tipo salvaje (WT) y analizamos sus compartimentos cardíacos de monocitos y macrófagos. por scRNA-seq. El análisis de grupos no supervisado de los compartimentos de monocitos y macrófagos en ratones Trem2-/- y WT mostró tipos y proporciones similares de subgrupos en estado estacionario y 3 días después de CLP, respectivamente (Datos extendidos Fig. 5d). En particular, observamos que la proporción de células Mac1 disminuyó significativamente en ratones WT y Trem2-/- 3 días después de CLP (Datos extendidos Fig. 5e). En el día 7 después de CLP, las células Mac1 se recuperaron a recuentos normales en ratones WT, pero la proporción de células Mac1 en ratones Trem2-/- no pudo restaurarse (Fig. 4e, f). El análisis de citometría de flujo confirmó que el porcentaje y el número absoluto de células Mac1 CD163+RETNLA+ en ratones Trem2-/- no se recuperaron el día 7 después de CLP en comparación con los controles WT (Fig. 4g). Por el contrario, las proporciones de otros compartimentos de células inmunes cardíacas no se vieron afectadas por la deficiencia de Trem2, con la excepción de la reducción en la proporción de macrófagos en ratones Trem2-/- 3 y 7 días después de CLP y un modesto aumento en la proporción de neutrófilos 7 d después de CLP (datos extendidos Fig. 5f). Además, revelamos que la capacidad proliferativa de los CRM CD163 + RETNLA + disminuyó significativamente en ratones Trem2-/- en comparación con los controles WT 3 días después de CLP indicado por la expresión de Ki67 (Fig. 4h). Estos resultados sugieren colectivamente que TREM2 es un marcador para el subconjunto Mac1 y es esencial para la remodelación de las células Mac1 en corazones sépticos.

a, Gráficos de puntos que muestran los 20 procesos biológicos principales para los DEG regulados al alza de Mac1 analizados por GO. Las flechas rojas indican vías relacionadas con la endocitosis. b, gráficos UMAP y gráficos de violín que muestran la expresión de Trem2 en el compartimento de monocitos-macrófagos. c, Imágenes de inmunofluorescencia representativas de CD163 (verde), TREM2 (rojo) y núcleos (azul) en tejido cardíaco de ratones WT en SS (n = 5) y 7 días después de CLP (n = 5). Las líneas de puntos indican macrófagos CD163+TREM2+. Barras de escala, 20 μm. d, Histogramas representativos del análisis de citometría de flujo de la expresión de TREM2 en macrófagos cardíacos CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+ y CD45+CD11b+F4/80+(no CD163+RETNLA+) de ratones WT en SS y 7 días después CLP. e, Gráficos UMAP que muestran los resultados de agrupamiento de células correspondientes a la Fig. 2a para un total de 13,405 monocitos-macrófagos en corazones WT y Trem2 knockout (KO) a los 7 días después de CLP. f, Distribución de grupos dentro de los subconjuntos de monocitos y macrófagos en corazones WT y Trem2-KO a los 7 días después de CLP. g, Porcentajes y números absolutos de macrófagos CD163+RETNLA+ analizados por citometría de flujo de corazones de ratones WT (n = 6) y Trem2-KO (n = 6) 7 días después de CLP. h, Gráficos de contorno representativos que muestran la expresión de Ki67 en macrófagos CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+ seleccionados y gráfico que muestra los porcentajes de células que expresan Ki67 en WT (n = 5–6) y Trem2-KO (n = 6 –7) corazones en SS y 3 d después de CLP. Cada símbolo representa un ratón (g,h). Los datos se presentan como media ± sem; Los valores de P bilaterales se determinaron mediante la prueba t no pareada (g) y ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Sidak (h). Los resultados representan tres experimentos independientes (c,d,g,h). Ver también Datos extendidos Fig. 5.

Datos fuente

Los cardiomiocitos expulsaron mitocondrias disfuncionales en vesículas dedicadas denominadas "exóforas", que se caracterizan por tener un diámetro medio de 3,5 ± 0,1 μm y un volumen medio de 31,0 ± 2,5 μm314, similar a las estructuras descritas en las neuronas de Caenorhabditis elegans28. Los macrófagos cardíacos son indispensables para mantener la homeostasis cardíaca al limpiar estas partículas subcelulares y las mitocondrias defectuosas14. Nuestros datos sugirieron que se interrumpió la homeostasis de los macrófagos en los corazones sépticos. Especulamos que la homeostasis interrumpida de los macrófagos podría afectar la eliminación de las mitocondrias dañadas derivadas de los cardiomiocitos durante la sepsis. En primer lugar, se cruzaron ratones αMHCCre con ratones Rosa26TdTom y solo los cardiomiocitos de los ratones generados (denominados ratones CardRED) expresaron fluorescencia roja. Observamos que la acumulación de algunas partículas subcelulares, definidas como exoferos, se colocalizaron con la proteína mitocondrial Tom20 en el espacio extracelular de corazones sépticos de ratones CardRED (Fig. 5a, b y Video complementario 1). El análisis de microscopía electrónica de transmisión (TEM) reveló una acumulación significativa de mitocondrias libres en la periferia de los cardiomiocitos 3 días después de CLP (datos extendidos Fig. 6a, b). Además, estos exóforos se purificaron con citometría de flujo14. Observamos que los exóforos cardíacos fueron positivos para las sondas mitocondriales MitoTracker Green y MitoNIR (datos extendidos Fig. 6c, d), también mostraron un potencial de membrana reducido y pérdida de capacidad de respuesta a los agentes hiperpolarizantes (datos extendidos Fig. 6e). Estos resultados sugieren que la sepsis provoca la acumulación de mitocondrias disfuncionales expulsadas por cardiomiocitos en el espacio extracelular del corazón.

a, Imágenes de inmunofluorescencia y reconstrucción 3D que muestran la presencia de material Tom20+ en exóforos derivados de cardiomiocitos de corazones de ratones CardRED sépticos. b, Presencia de material Tom20+ en exóforos derivados de cardiomiocitos de corazones de ratones CardRED en SS y 3 días después de CLP. Gráfico que muestra el número de exóforos por campo de visión (FOV); n = 6 por grupo. c, imagen TEM de una célula mononuclear que capta mitocondrias mediante seudópodos extendidos en corazones sépticos (CLP 7 d). d, Imágenes que muestran exoferos derivados de cardiomiocitos (rojo) que contienen mitocondrias (Tom20, blanco) presentes en macrófagos TREM2+ (verde) de corazones de ratones CardRED (n = 4). e, mitocondrias derivadas de cardiomiocitos (mt-Dendra2, verde) presentes en macrófagos TREM2+ (rojo) de corazones de ratones MitoCard (n = 4). f, Mitocondrias derivadas de cardiomiocitos (mt-Dendra2, verde) localizadas en lisosomas (LAMP1, blanco) de macrófagos TREM2+ (rojo) en corazones de ratones MitoCard (n = 3). g, los macrófagos TREM2+ (verde) tomaron mitocondrias derivadas de cardiomiocitos (mt-Keima-458, cian) y algunas mitocondrias en un ambiente ácido (mt-Keima-561, rojo) de corazones de ratones infectados con AAV9-Tnnt2-mt-Keima . h, macrófagos CD163+ (verde) englobaron mitocondrias derivadas de cardiomiocitos en corazones de ratones WT y Trem2-/- infectados con AAV9-Tnnt2-mt-Keima, respectivamente. Gráfico que muestra los porcentajes de mitocondrias mt-Keima+ en macrófagos CD163+ (n = 5 por grupo). Para cada animal, seleccionamos al azar cinco áreas de visualización y se analizaron cinco células Mac1. Se calculó la proporción del área de las mitocondrias mt-Keima en una única célula Mac1 con respecto al área de la misma célula Mac1. La proporción en el grupo KO se normalizó a la proporción del grupo de control. i, La incorporación de proteína tdTomato derivada de cardiomiocitos en macrófagos CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+ y monocitos CD45+CD11b+F4/80−LY6C+ de quimeras WT → CardRED o KO → CardRED 7 días después de CLP. Gráfico que muestra la cuantificación de MFI de tdTomato (n = 6–7 por grupo). j, Presencia de material Tom20+ (cian) en exóforos derivados de cardiomiocitos (rojo) de corazones de quimeras WT → CardRED y KO → CardRED 7 días después de CLP. Gráfico que muestra los números de exopher por FOV (n = 6 por grupo). Las barras de escala se indican en las imágenes. Las barras se muestran como media ± sem (b,h,j) y mediana con rango intercuartílico (i). Los valores de P bilaterales se determinaron mediante la prueba t no pareada (b, h, j) y la prueba U de Mann-Whitney (i). Los resultados representan cuatro (b), tres (d–f) y dos (g–j) experimentos independientes (datos extendidos, figuras 6 y 7).

Datos fuente

Dado que las mitocondrias libres y el ADN mitocondrial (ADNmt) pueden provocar daño cardíaco, la eliminación de exóforos que contienen mitocondrias derivadas de cardiomiocitos es importante para mantener la homeostasis cardíaca y restaurar la función cardíaca óptima29,30. A continuación, exploramos el mecanismo para la eliminación de mitocondrias disfuncionales en el corazón séptico. Las imágenes de TEM mostraron que algunas células adyacentes a los cardiomiocitos mostraban un tamaño y una morfología similares a los macrófagos. Estos macrófagos estiraron seudópodos, que rodearon las vesículas que contenían mitocondrias en la periferia de los cardiomiocitos sépticos (Fig. 5c y Datos extendidos, Fig. 6f). De manera consistente, las imágenes confocales y tridimensionales (3D) mostraron que los exóforos envueltos en células TREM2+ (rojo) contenían mitocondrias en corazones sépticos de ratones CardRED (Fig. 5d y Video complementario 2).

Para cuantificar la actividad fagocítica de las células TREM2hi Mac1 (CD45+CD11b+F4/80+CD163+), el análisis de citometría de flujo con los corazones de ratones CardRED reveló una mayor incorporación de la proteína tdTomato derivada de cardiomiocitos en las células Mac1 en comparación con las células que no son Mac1 ( Datos extendidos Fig. 6g). Además, se generaron ratones informadores de mitocondrias específicos de cardiomiocitos (MitoCard) cruzando mtD2Flox/Flox con ratones αMHCCre/+31 y las imágenes confocales mostraron que las mitocondrias derivadas de cardiomiocitos se localizaron en macrófagos TREM2+ (Fig. 5e y Video complementario 3). El análisis de citometría de flujo también mostró que las células TREM2hi Mac1 incorporaron más mitocondrias derivadas de cardiomiocitos durante SICM (Datos extendidos Fig. 6h). Además, realizamos la tinción TUNEL con corazones de ratones WT sépticos y descubrimos que el porcentaje de células TUNEL+cTnI+ en el total de células (TUNEL+cTnI+/4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)) era muy bajo (alrededor de 1 %) en el día 3 después de la sepsis (Datos extendidos Fig. 6i). Estos resultados excluyeron la posibilidad de que las células TREM2hi incorporen material apoptótico derivado del corazón séptico.

Para dilucidar el destino de las mitocondrias derivadas de cardiomiocitos en las células Mac1, realizamos la inmunotinción de TREM2 con el marcador de lisosoma Lamp1 con las secciones del corazón de ratones MitoCard sépticos y observamos que las señales de mt-Dendra2 en las células TREM2+ se localizan parcialmente en los lisosomas LAMP1+ (Fig. 5f y Vídeo complementario 4). A continuación, empaquetamos el virus adenoasociado serotipo 9 (AAV9)-Tnnt2-mt-Keima virus y se realizó una inyección intramiocárdica del virus AAV9 para asegurar la expresión específica de la proteína Keima en las mitocondrias (mt-Keima) de los cardiomiocitos (Datos extendidos Fig. 7a)32. La tinción de inmunofluorescencia reveló que abundantes partículas mt-Keima+ se concentraron en macrófagos TREM2+ (Fig. 5g). Keima es sensible al pH y su pico del espectro de excitación puede cambiar de la longitud de onda más corta (verde, en el ambiente neutral) a la más larga (roja, en el ambiente ácido)33. El video y las imágenes en 3D mostraron que mt-Keima en los macrófagos TREM2+ exhibió señales de fluorescencia verde y roja en los corazones de ratones sépticos WT inyectados con el virus AAV9-Tnnt2-mt-Keima (Fig. 5g y Video complementario 5), lo que sugiere que las mitocondrias tomadas por las células Mac1 puede ser entregado al ambiente lisosomal ácido. Juntos, estos datos indican que las células TREM2hi Mac1 tienen una actividad sólida en la eliminación de mitocondrias disfuncionales derivadas de cardiomiocitos.

El análisis de datos de scRNA-seq reveló que la mayoría de las firmas de genes endocíticos como Wwp1, Ccr5, Cd36, Eps15, Cltc, Mrc1, Ccl24, Dab2 y Folr2 en toda la población de macrófagos disminuyó en ratones Trem2-/- en comparación con las células WT ( Datos extendidos Fig. 7b,c). Luego examinamos el efecto de TREM2 en la captación de mitocondrias derivadas de cardiomiocitos por macrófagos. La inyección intramiocárdica del virus AAV9-Tnnt2-mt-Keima se realizó con ratones WT y Trem2-/-, respectivamente. Los ratones sépticos Trem2-/- mostraron una captación reducida de mitocondrias cardiomiocíticas y Keima por macrófagos CD163+ (Fig. 5h y Video complementario 5). A continuación, trasplantamos células de médula ósea de ratones WT o Trem2-/- a ratones receptores CardRED irradiados y 8 semanas después, se realizó la cirugía CLP (Datos extendidos Fig. 7d). Descubrimos que las células WT → CardRED CD163 + RETNLA + Mac1 eliminaron más material derivado de cardiomiocitos que las células Trem2-/- → CardRED CD163 + RETNLA + Mac1 7 días después de CLP (Fig. 5i). De manera consistente, la inmunofluorescencia mostró que se acumularon más mitocondrias derivadas de cardiomiocitos en el corazón de las quimeras Trem2-/-→CardRED (Fig. 5j). Además, los ratones con deficiencia de Trem2 exhibieron una acumulación severa de mitocondrias libres en el espacio extracelular de los cardiomiocitos 7 días después de CLP (datos extendidos, figura 7e), pero esto no se encontró en ratones con deficiencia de Trem2 en estado estacionario (datos extendidos, figura 7f). ). Estos datos sugieren que TREM2 facilita la eliminación de las mitocondrias dañadas por las células Mac1 en corazones sépticos.

Para determinar la importancia fisiológica de las células TREM2hi Mac1 en SICM, comparamos la tasa de supervivencia, la función sistólica cardíaca, los marcadores de lesión cardíaca y la inflamación entre ratones WT y Trem2-/- después de CLP. Como se muestra en la Fig. 6a, la mortalidad de los ratones sépticos Trem2-/- aumentó notablemente. Además, el ensayo de ecocardiografía reveló que los ratones Trem2-/- tenían una peor función cardíaca indicada por una FE más baja, un acortamiento fraccional (FS) y un gasto cardíaco (CO), especialmente 7 y 21 días después de CLP, en comparación con los controles de compañeros de camada WT (Fig. 6b y Datos extendidos Fig. 8a,b). Las concentraciones de cTnI y LDH en el suero, así como los niveles de ARN mensajero de Anp y Bnp en los tejidos cardíacos, aumentaron en ratones sépticos Trem2-/- (Fig. 6c y Datos extendidos Fig. 8c-e). Además, la deficiencia de Trem2 elevó significativamente los niveles de ARNm de mediadores proinflamatorios después de CLP (Datos extendidos Fig. 8f-i).

a, Análisis de supervivencia de ratones WT (n = 18) y Trem2-/- (n = 30) después de monitorear el rendimiento de CLP durante 7 días. Los ratones b, c, WT y Trem2-/- se sometieron a CLP y se examinó la función cardíaca en SS y 3, 7 y 21 días después de CLP. Gráfico que muestra el % de FE (b) medido por ecocardiografía (n = 7–8 ratones para cada grupo) y los niveles de cTnI (c) en el suero (n = 5–8 ratones para cada grupo). d, Imágenes representativas de ecocardiografía en modo M y % FE de quimeras WT → WT (Trem2+/+Ch) y quimeras Trem2-/-→WT (Trem2-/-Ch) 7 días después de CLP. e, Imágenes representativas de ecocardiografía Doppler de onda continua y relación E/A de quimeras Trem2+/+Ch y Trem2-/-Ch 7 días después de CLP. f, Gráfico que muestra el CO medido por ecocardiografía. g,h, Gráficos que muestran los niveles de cTnI (g) y LDH (h) en el suero de las quimeras Trem2+/+Ch y Trem2−/−Ch 7 días después de CLP (d–h, n = 11 ratones para cada grupo) . i, Gráficos que muestran los niveles de proteína de ANP y BNP en el suero de las quimeras Trem2+/+Ch y Trem2-/-Ch 7 días después de CLP. j, Gráficos que muestran los niveles de proteína del factor de necrosis tumoral (TNF)-α, IL-1β, IL-6 y CCL2 en los tejidos cardíacos de las quimeras Trem2+/+Ch y Trem2−/−Ch 7 días después de CLP (i,j, n = 10 ratones para cada grupo). k, Imágenes representativas de TEM (izquierda) y puntuación de lesión de mitocondrias (derecha) de quimeras Trem2+/+Ch y Trem2-/-Ch 7 días después de CLP. Barras de escala, 5 μm. Gráfico de barras que muestra la puntuación de lesión mitocondrial por FOV. Cada símbolo representa un FOV de imágenes TEM. Cada grupo tiene cuatro ratones y se seleccionaron aleatoriamente cinco FOV para el ensayo de cada animal. l,m, Gráficos que muestran los niveles de ATP (l) en lisados ​​de tejido cardíaco y los niveles de lactato sérico (m) de las quimeras Trem2+/+Ch y Trem2−/−Ch 7 días después de CLP (l,m, n = 11 ratones para cada grupo). Cada símbolo representa un animal (b–j,l,m). Las barras se muestran como media ± sem (b–f,h–l) y mediana con rango intercuartílico (g,m). Los valores de P de dos caras se determinaron mediante la prueba de rango logarítmico de Kaplan-Meier (a), ANOVA de dos vías con la prueba de comparaciones múltiples de Sidak (b, c), prueba t no pareada (d-f, h-k) y Mann- Prueba U de Whitney (g, m). Los resultados representan al menos cuatro (b,c) y tres (d–m) experimentos independientes (Datos extendidos Fig. 8).

Datos fuente

Los macrófagos derivados de la médula ósea contribuyen al grupo de microglia residente en ratones quiméricos34,35. Los receptores irradiados (antecedentes CD45.1) se trasplantaron con células de médula ósea de ratones WT o Trem2-/- (antecedentes CD45.2), respectivamente (Datos extendidos Fig. 8j). El ensayo de citometría de flujo mostró que la eficiencia de la reconstitución de células Mac1 fue superior al 90 % en quimeras irradiadas 8 semanas después del trasplante de médula ósea (TMO) (Datos ampliados Fig. 8k, l). Los resultados de la citometría de flujo y la PCR en tiempo real revelaron que las quimeras Trem2-/-→WT (Trem2-/-Ch) mostraron un nivel más bajo de proteína TREM2 en los macrófagos cardíacos y un nivel más bajo de ARNm de Trem2 en los tejidos cardíacos que las quimeras WT → WT (Trem2+/+Ch ), respectivamente (Datos extendidos Fig. 8m). Ocho semanas después de BMT, los ratones quiméricos se sometieron a CLP. Encontramos que la deficiencia específica de Trem2 en macrófagos exacerbó la disfunción cardíaca, la lesión miocárdica y la inflamación cardíaca después de la sepsis (Fig. 6d-j y Datos extendidos Fig. 8n, o). Además, las quimeras Trem2-/-Ch exhibieron daño mitocondrial agravado (Fig. 6k), niveles reducidos de ATP (Fig. 6l) y niveles aumentados de lactato (Fig. 6m). Estos resultados sugieren que TREM2 es esencial para que Mac1 proteja la función cardíaca después de la sepsis.

Finalmente, buscamos examinar si el tratamiento con células Mac1 podría proteger la función cardíaca después de la sepsis. Las células TREM2hi Mac1 y no Mac1 clasificadas de los corazones de ratones CD45.1 se trasplantaron respectivamente al espacio pericárdico de ratones CD45.2 inmediatamente después de CLP. A los animales de control se les inyectó por vía intrapericárdica el mismo volumen de Matrigel (MG) (Fig. 7a). El análisis de citometría de flujo mostró que las células Mac1 y no Mac1 trasplantadas pueden sobrevivir y persistir en los corazones receptores durante al menos 7 días después de CLP (datos extendidos, Fig. 9a). La proporción de células Mac1 en el total de células CD45+ aumentó significativamente en los corazones de los ratones inyectados con células Mac1 en los puntos de tiempo examinados en comparación con los ratones inyectados con MG (datos extendidos, Fig. 9b,c). De manera similar, la proporción de células que no son Mac1 en el total de células CD45+ también aumentó en los corazones de los ratones a los que no se les inyectó Mac1 en los puntos de tiempo examinados en comparación con los ratones a los que se les inyectó MG (Datos extendidos Fig. 9d, e). Además, las células Mac1 y no Mac1 se marcaron con CellTracker Orange (CTMMR) y luego se transfirieron a la cavidad pericárdica inmediatamente después de CLP. Después de 3 días, el ensayo histológico indicó que las células trasplantadas estaban ampliamente distribuidas en el miocardio (Datos ampliados, Fig. 9f). Además, transferimos por vía intrapericárdica las células Mac1 marcadas con CMTMR a ratones MitoCard. Tres días después, las imágenes confocales y 3D mostraron que las células inyectadas engullían mitocondrias derivadas de cardiomiocitos (datos extendidos, figura 9g y video complementario 6). Estos datos muestran colectivamente que las células Mac1 trasplantadas pueden ingresar al miocardio, sobrevivir en el corazón de los ratones receptores durante al menos 7 días y engullir mitocondrias derivadas de cardiomiocitos.

a, Ilustración esquemática del trasplante de células TREM2hi Mac1 en ratones WT. Las células TREM2hi Mac1 (CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+) y no Mac1 (CD45+CD11b+ F4/80+ y no CD163+RETNLA+) aisladas de ratones WT se mezclaron con MG y se trasplantaron a la cavidad pericárdica de Ratones WT (2 × 105 células por animal) inmediatamente después de CLP. A los ratones de control se les inyectó solo MG. Los ratones fueron sacrificados y analizados 3 días después del trasplante. b–e, Imágenes representativas de ecocardiografía en modo M (b) y gráficos que muestran % de EF (c), % de FS (d) y CO (e) medidos por ecocardiografía (b–e, +MG, n = 5 ratones; +non -Mac1, n = 9 ratones; +Mac1, n = 10 ratones). f, g, Gráficos que muestran los niveles de cTnI y LDH en el suero. h, Gráficos que muestran los niveles de ARNm de Anp y Bnp en los tejidos del corazón. i, Gráficos que muestran los niveles de proteína de ANP y BNP en el suero. j, Gráficos que muestran los niveles de ARNm de Tnfα, Il1β, Ccl2 e Il6 en tejidos cardíacos. k, Gráficos que muestran los niveles de proteína de TNF-α, IL-1β, IL-6 y CCL2 en tejidos cardíacos. l, Imágenes TEM representativas (izquierda) y puntuación de lesión mitocondrial (derecha). Barras de escala, 5 μm. Cada símbolo representa un FOV. Cada grupo tiene cuatro ratones y se seleccionaron al azar cinco FOV para el ensayo de cada animal. m, Gráfico que muestra los niveles de ATP en lisados ​​de tejido cardíaco. n, Gráfico que muestra los niveles de lactato sérico. (f–k,m,n, +MG, n = 5 ratones; +no Mac1, n = 9 ratones; +Mac1, n = 9 ratones). Cada símbolo representa un animal en c–k, n, m. Las barras se muestran como media ± sem Los valores de P bilaterales se determinaron mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Games-Howell (c–h,j,n,m) o Tukey (i,k). Los resultados representan cuatro experimentos independientes (b–n). Véanse también las figuras de datos ampliados. 9 y 10.

Datos fuente

En comparación con las células no Mac1 trasplantadas intrapericárdicamente o los grupos MG, los corazones de ratones sépticos que fueron trasplantados con células TREM2hi Mac1 mostraron una función cardíaca significativamente mejorada (Fig. 7b-e). Consistentemente, el trasplante con células TREM2hi Mac1 mejoró la lesión cardíaca (Fig. 7f-i), la inflamación (Fig. 7j, k), el daño mitocondrial (Fig. 7l), aumentó los niveles de ATP (Fig. 7m) y redujo los niveles de lactato (Fig. .7n).

A continuación, se aislaron células WT Mac1 y Trem2-/- Mac1 de los corazones de ratones WT o Trem2-/- y se trasplantaron por vía intrapericárdica (2 × 105 células por ratón) en los corazones de ratones Trem2-/- inmediatamente después de CLP (Extended Datos Fig. 10a). Tres y 7 días después, la ecocardiografía reveló que el trasplante con células WT Mac1 mejoró significativamente la función cardíaca de los ratones sépticos en comparación con los ratones Trem2-/- inyectados con células Trem2-/- Mac1 o grupos MG (datos extendidos Fig. 10b-d). Consistentemente, el trasplante con células WT Mac1 mejoró la lesión cardíaca, la inflamación (datos extendidos Fig. 10e-j), niveles mejorados de ATP (datos extendidos Fig. 10k) y niveles reducidos de lactato (datos extendidos Fig. 10l). En conjunto, estos resultados sugieren que la administración de células TREM2hi Mac1 puede ser un enfoque terapéutico potencial para la prevención y el rescate de la disfunción cardíaca en la sepsis.

Los pacientes con SICM tienen una alta tasa de mortalidad4,36,37 y sus corazones sépticos están asociados con un metabolismo energético alto y daño mitocondrial catastrófico5,38. Los macrófagos están involucrados en la inflamación cardíaca, la eferocitosis, la remodelación de tejidos y la homeostasis11,13,39; sin embargo, las funciones de distintos subconjuntos de macrófagos en el corazón séptico no se han dilucidado por completo. En el presente estudio, investigamos un subconjunto de macrófagos cardíacos en corazones sépticos y en estado estacionario, que se caracterizó por una alta expresión de TREM2 y la capacidad de autorrenovación, definida como células TREM2hi Mac1. La alta expresión de TREM2 es esencial para la función de las células Mac1 en la eliminación de mitocondrias defectuosas y la protección del corazón séptico (Datos ampliados, Fig. 10m). Además, la inyección intrapericárdica de células CD163+RETNLA+TREM2hi Mac1 podría prevenir la disfunción cardíaca de ratones sépticos.

La acumulación de estudios destacó la composición heterogénea y los cambios específicos de tejido de los macrófagos en estado estacionario y diferentes entornos patológicos como el infarto de miocardio8,11,19,22. Nuestros datos de scRNA-seq revelaron la presencia de cinco poblaciones de macrófagos, Mac1–5, en el corazón de ratones en estado estacionario, que fueron indicados por un estudio anterior19. Los subconjuntos Mac1 y Mac2 fueron los subconjuntos de macrófagos cardíacos dominantes, que se caracterizaron por la expresión de genes relacionados con la fagocitosis (Trem2) y la presentación de antígenos (H2-Aa), respectivamente. Los subconjuntos Mac3–5 tenían proporciones bajas y genes altamente expresados ​​relacionados con la estimulación de IFN (Irf7), inflamación patológica (CD72) y quimiocinas (Ccr2), respectivamente. Encontramos que el subconjunto Mac1 exhibió un cambio dinámico, disminuyó a los 3 días y se recuperó a los 7 días después de CLP, que estaba bien correlacionado con el deterioro y la recuperación de la función cardíaca en la sepsis. Los subconjuntos de Mac3 y Mac4 aumentaron significativamente junto con respuestas inflamatorias sistémicas exacerbadas y movilización de la médula ósea. Un estudio reciente mostró que en un modelo de constricción aórtica transversal, CD72 era un marcador clave de un subconjunto de macrófagos proinflamatorios, en el que muchos genes se superponían con Mac4 identificado en nuestro estudio22, lo que sugiere que el subconjunto de Mac4 expresado en CD72 está estrechamente relacionado con la inflamación. y lesión cardiaca en SICM.

En cuanto al origen, los macrófagos cardíacos se pueden subdividir en subconjuntos CCR2− residentes derivados de embriones (residente) y subconjuntos CCR2+ reclutados derivados de hematopoyéticos (circulantes)11,12,13. Los subconjuntos CCR2− se reponen a través de la proliferación local, median la estabilidad metabólica y promueven la recuperación cardíaca después de una lesión14,19. Por el contrario, los subconjuntos CCR2+ reclutados aumentan la inflamación y el estrés oxidativo40. Dick et al. encontraron que un subconjunto de macrófagos cardíacos residentes TIMD4+LYVE1+MHC-IIloCCR2−, que se mantuvo por autorrenovación, inhibe la remodelación adversa y promueve la recuperación de la función cardíaca después de un infarto de miocardio14. De acuerdo con este estudio, identificamos un subconjunto de CRM CD163+RETNLA+ (células Mac1), que disminuyó notablemente con el estrés séptico. Tras la progresión de SICM, las células Mac1 residentes mostraron una capacidad de autorrenovación y presentaron un papel protector en el corazón séptico. Un manuscrito reciente también mostró que el número de macrófagos cardíacos disminuyó 1 día después de CLP y luego aumentó a niveles superiores a los normales en 28 días41. La recuperación del número de macrófagos cardíacos estuvo dominada por la proliferación local, mientras que el reclutamiento periférico representó solo el 6,2%41. Estos hallazgos sugieren un papel esencial de las células Mac1 residentes autorrenovables en la protección de la función cardíaca en la sepsis.

Como receptor transmembrana de la superfamilia de inmunoglobulinas, la activación de TREM2 conduce a la fosforilación de DAP12 y, en consecuencia, promueve la proliferación y supervivencia celular, modula la fagocitosis y contrarresta la inflamación42,43. Observamos que el subconjunto Mac1 presenta TREM2hi y su proliferación mejoró durante la sepsis. Además, la deficiencia de Trem2 no afectó la cantidad de células Mac1 en el corazón sano, pero perjudicó significativamente la restauración de estos macrófagos en el corazón séptico. Nuestro estudio anterior mostró que TREM2 era apenas detectable en el hígado, los pulmones y el bazo de ratones en estado estacionario, mientras que la expresión de TREM2 aumentó significativamente en estos tejidos después de CLP y el bloqueo de la sepsis polimicrobiana exacerbada por TREM244, lo que sugiere su efecto protector contra la sepsis. La función específica de los macrófagos TREM2+ en otros órganos requiere más investigación. Estudios previos demostraron que la deficiencia de Trem2 resultó en una disminución de la proliferación de macrófagos en condiciones patológicas45,46 e indujo la detención del ciclo celular47. De manera similar, notamos que la deficiencia de Trem2 disminuyó notablemente la proliferación de células Mac1 en SICM. Nuestros hallazgos sugieren que TREM2 juega un papel esencial en la recuperación de SICM a través de la reconstitución de la subpoblación CD163 + RETNLA + Mac1.

Las mitocondrias extracelulares y el mtDNA pueden desencadenar inflamación y causar daño cardíaco29,30. Un estudio reciente mostró que los MRC eliminaban los desechos mitocondriales extruidos para preservar la homeostasis de los cardiomiocitos de larga vida y desempeñaban una función protectora14. Nuestros hallazgos actuales indicaron que las mitocondrias disfuncionales aumentaron notablemente en el espacio extracelular del miocardio, en paralelo con la disfunción cardíaca bajo estrés séptico. De acuerdo con resultados previos41, la sepsis mostró un efecto muy leve sobre la supervivencia de las células cardíacas. Las células Mac1 exhibieron una potente capacidad para eliminar mitocondrias anormales derivadas de cardiomiocitos en SICM. Además, la ablación de Trem2 reguló a la baja los genes endocíticos en los CRM y exacerbó la acumulación de mitocondrias defectuosas en el corazón y la disfunción cardíaca. Además, la administración intrapericárdica de macrófagos CD163+RETNLA+TREM2hi podría sobrevivir y engullir mitocondrias defectuosas derivadas de cardiomiocitos, que en consecuencia protegen contra la disfunción miocárdica séptica. Nuestros hallazgos sugieren que las células TREM2hi Mac1 tenían una poderosa función de endocitosis y preservaban la homeostasis cardíaca al eliminar las mitocondrias defectuosas durante la sepsis.

En resumen, nuestro estudio ha revelado un subconjunto de macrófagos CD163+RETNLA+ (Mac1), que presenta una alta expresión de TREM2. TREM2 es esencial para la autorrenovación y remodelación de las células Mac1 en el corazón séptico. Las células TREM2hi Mac1 eliminan las mitocondrias defectuosas y el trasplante de células Mac1 contribuye a la recuperación de la función cardíaca durante la SICM. Nuestro estudio destaca que mantener la función de este subconjunto mediante el aprovechamiento de TREM2 podría ser una posible estrategia terapéutica para las enfermedades cardíacas en la clínica.

Los ratones C57BL/6 WT se obtuvieron del Centro de animales de laboratorio SLAC de Shanghái. M. Colonna proporcionó amablemente ratones Trem2-/- de la Universidad de Washington en St. Louis. M. Shang de la Universidad de Zhejiang proporcionó amablemente ratones αMHCCre. Los siguientes ratones se compraron en Jackson Laboratory: Rosa26-stop-tdTomato, Cx3cr1CreERT2–IRES–YFP, mtD2flox/+ (B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG−COX8A/Dendra2)Dcc/J) y B6;CD45. 1 ratón (B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ). Los ratones αMHCCre se cruzaron con Rosa26-stop-tdTomato o mtD2flox/flox, para generar ratones indicadores fluorescentes de cardiomiocitos (denominados ratones CardRED) o ratones indicadores fluorescentes de mitocondrias específicos de cardiomiocitos (denominados ratones MitoCard). Los ratones se alojaron en un ambiente libre de patógenos específicos, con un ciclo de luz-oscuridad de 12 h y la temperatura ambiente se mantuvo a 22 °C. Los ratones fueron alimentados con comida irradiada (SZS9126, XIETONG BIO-ENGINEERING) y agua esterilizada. Las jaulas se esterilizaron en autoclave y se cambiaron una vez por semana. Solo se usaron ratones machos en los experimentos. Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang y se realizaron de acuerdo con las pautas institucionales (números de referencia 2017442 y 2021858).

Se administró anestesia a ratones macho de 8 semanas de edad con ketamina (50 mg kg-1) y xilazina (5 mg kg-1) inyectadas por vía intraperitoneal antes de la depilación abdominal. Luego, los ratones fueron expuestos a un corte longitudinal de 1,5 cm en el cuadrante inferior del abdomen y luego se aisló el ciego. Las tres cuartas partes distales del ciego se ligaron con suturas de seda 4-0 y se hicieron dos punciones en el ciego ligado con una aguja de calibre 22, induciendo sepsis inducida por CLP subletal. Luego, el ciego se volvió a colocar en la cavidad abdominal después de que se extruyeron las heces y la herida se suturó con una sutura de seda 4-0. Cada ratón recibió 1 ml de solución salina estéril después de la operación48. La tasa de supervivencia se evaluó cada 2 h durante 7 días.

Para etiquetar el destino de los macrófagos cardíacos, se cruzaron ratones Cx3cr1CreERT2–IRES–YFP con ratones Rosa26-stop-tdTomato. A la edad de 6 semanas, a los ratones Cx3cr1CreERT2:Rosa26tdTom se les administró 4 mg de tamoxifeno (Meilunbio) por ratón en aceite de maíz y nuevamente 48 h después. Después de 5 semanas, se sacrificaron los ratones para los ensayos.

Se obtuvieron células de médula ósea de fémures y tibias de ratones macho donantes de 8 semanas de edad. En primer lugar, se lavó la médula ósea con PBS preenfriado. Después de la lisis de glóbulos rojos, se obtuvo una suspensión unicelular a través de un filtro de 70 µm. Se transfirió un total de 1 × 107 células de médula ósea a ratones macho receptores letalmente irradiados (8 Gy) por vía intravenosa. Los ratones quiméricos recibieron antibióticos a través del agua potable durante 1 semana. Después de 8 semanas, se completó la construcción del modelo.

Los vectores de virus adenoasociados recombinantes serotipo 2/9 (AAV 2/9) que llevan mt-Keima con el promotor específico cardíaco cTnT se diseñaron como se describió anteriormente14 y fueron fabricados por OBiO Technology. A cada ratón se le administró un título de 3 × 1011 virus AAV9-Tnnt2-mt-Keima mediante inyección intracardíaca. Después de 6 semanas, se usaron ratones para experimentos CLP.

El ARN total se obtuvo de tejidos y células de ratón usando TRIzol (Ambion). Las muestras de ADN complementarias se sintetizaron con el kit de reactivos PrimeScript RT (Takara) y la expresión génica se analizó con qPCR utilizando SYBR premix Ex Taq (Takara) en el sistema Lightcycler 480 (Roche). Las secuencias de cebadores utilizadas se enumeran en la Tabla complementaria 1.

Se administró ecocardiografía en ratones bajo anestesia con isoflurano usando un sistema Vevo 2100 (VisualSonics). La temperatura corporal normal se mantuvo mediante una plataforma de calentamiento. Paraesternal bidimensional estándar (2D) y vista de eje corto en modo M se utilizó para medir las dimensiones internas del ventrículo izquierdo (VI) en diástole (LVIDd) y sístole (LVID), el volumen interno del VI en diástole (LVEDV) y sístole. (LVESV) y la frecuencia cardíaca (FC). La FE del VI se adquirió como ((LVEDV − LVESV) / ​​LVEDV) × 100, la LV FS se adquirió como ((LVIDd−LVIDs) / LVIDd) × 100 y la CO se adquirió como (LVEDV − LVESV) × HR. Para el análisis de la disfunción diastólica se utilizó una vista apical 2D mediante Doppler de onda pulsada. Se detectaron ondas máximas de velocidad diastólica temprana y tardía (E y A, respectivamente) y se adquirió la relación E/A. El análisis de imágenes se realizó fuera de línea utilizando Vevo LAB v.3.1.0 (VisualSonics).

Se incrustaron corazones frescos con un compuesto de temperatura de corte óptimo y se cortaron en secciones de 10 μm. Después de secar al aire durante 1 h, los portaobjetos se fijaron en paraformaldehído al 4 % durante 20 min, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1 % en citrato de sodio al 0,1 % durante 15 min y se bloquearon con tampón de bloqueo (BSA al 3 % + FBS al 5 % + FBS al 0,1 %). % Tween 20) durante 30 min a temperatura ambiente. Luego, las secciones de tejido se incubaron a 4 °C durante la noche con anticuerpos primarios contra anti-CD68 de rata (dilución 1:250; Abcam), anti-CD163 de ratón (dilución 1:100; Santa Cruz), anti-TREM2 de rata (dilución 1:100). ; I+D), anti-Tom20 de conejo (dilución 1:200; Abcam), anti-LAMP1 de rata (dilución 1:50, DSHB) y cTnI (dilución 1:250; Abcam). Después de lavarse tres veces con PBST durante 5 min cada una, los portaobjetos se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados a temperatura ambiente durante 2 h, luego se lavaron tres veces con DPBS y se sellaron con un agente de bloqueo que contenía DAPI. Para analizar la apoptosis de los cardiomiocitos, la tinción TUNEL se realizó con un kit TUNEL de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las imágenes se adquirieron con el microscopio confocal Olympus OSR (OLYMPUS IX83-FV 3000-OSR) o Zeiss LSM 880 (con AiryScan rápido) y se procesaron con el software ImageJ Pro Plus v.6.0 (Media Cybernetics).

Para analizar las vesículas derivadas de cardiomiocitos que contenían mitocondrias, las muestras de ratones CardRED se tiñeron con anticuerpo primario anti-Tom20 de conejo (dilución 1:250, Abcam) y anticuerpo secundario anti-conejo de burro conjugado con Alexa fluor 488 (dilución 1:500, Invitrogen ). Las imágenes se adquirieron con Zeiss LSM 880 (con AiryScan) a un intervalo de 0,38 μm por paso z (z = 7–8 μm) para reconstrucciones 3D. Se procesó un análisis de reconstrucción 3D de los experimentos anteriores utilizando el software Imaris v.9.7 (Bitplane). Después de reconstruir los cardiomiocitos, las vesículas y las mitocondrias con una herramienta de superficie basada en un detalle de 0,2 mm y una intensidad absoluta, analizamos la distancia entre las vesículas Tom20+tdTomato+ y los cardiomiocitos para demostrar que las vesículas estaban fuera de los cardiomiocitos. Luego cuantificamos las vesículas Tom20+tdTomato+ en cinco FOV aleatorios por muestra.

Se tomaron imágenes de la fluorescencia de Mt-Keima en dos canales mediante dos excitaciones secuenciales (488 nm, verde; 561 nm, rojo) usando un Zeiss LSM 880 (Zeiss LSM 880 con AiryScan rápido). Se mantuvieron configuraciones de imagen idénticas para comparar en diferentes condiciones experimentales. Todas las imágenes se analizaron con el software ImageJ Pro Plus v.6.0 (Media Cybernetics) para calcular la relación entre el área de la proteína fluorescente roja y la proteína fluorescente verde.

Todos los anticuerpos aplicados se enumeran en la Tabla complementaria 2.

Las muestras de corazón recolectadas se obtuvieron de la pared ventricular anterior y se cortaron en cubos de 2 mm3 (2 × 1 × 1 mm). Estas muestras se fijaron en glutaraldehído al 2,5 % (pH 7,2) durante 2 días a temperatura ambiente. Luego, los cubos se incrustaron con resina epoxipropano siguiendo métodos estándar. Los cortes se observaron y escanearon utilizando un TEM Tecnai G2 Spirit de 120 kV (Thermo FEI) con una cámara de dispositivo de carga acoplada.

Las mitocondrias miocárdicas se observaron mediante TEM y se analizaron semicuantitativamente como se describió anteriormente49. Se seleccionaron al azar cinco FOV para fotografía con el mismo aumento y se eligieron al azar aproximadamente 20 mitocondrias en cada campo para el análisis. Cada muestra se analizó en busca de 100 mitocondrias. Cada mitocondria se calificó en una escala de 0 a 4 según el grado de lesión (las puntuaciones más altas indicaron una lesión más grave).

De acuerdo con las instrucciones del fabricante, los niveles de lactato en suero se detectaron con un kit de ensayo de ácido láctico (Nanjing Jiancheng), los niveles de LDH en suero se analizaron con un kit de ensayo de lactato deshidrogenasa (Nanjing Jiancheng) y los niveles de cTnI en suero se determinaron con un kit ELISA de cTnI de ratón ( Nube-Clon). El contenido de ATP en el corazón se midió usando un kit de ensayo ATP (Beyotime) y los niveles séricos de ANP y NT-proBNP se determinaron usando kits ELISA de ratón (USCN Life Science). Los niveles de proteína IL-1β, IL-6, TNF-α y CCL2 en lisados ​​de tejido cardíaco se determinaron utilizando kits ELISA de ratón (NOVUS (IL-1β e IL-6) y MULTI SCIENCES (TNF-α y CCL2)).

Los ratones fueron anestesiados por inhalación de isoflurano. Posteriormente, los corazones se perfundieron con 20 ml de tampón de perfusión (1x DPBS con CaCl2 0,8 mM) para eliminar la sangre periférica de las cámaras. Posteriormente, se extrajeron las aurículas y las válvulas del corazón aislado y se trituraron los ventrículos en cubos de ~1 mm. Los corazones fueron digeridos con 0.25 mg ml-1 de Liberase TL (Sigma-Aldrich), 20 μg ml-1 DNase I (Sinopharm Chemical Reagent) y 10 mM HEPES (Sigma-Aldrich) en DMEM libre de suero (Gibco) a 37ºC. ºC durante 15 min. Luego, la suspensión de tejido se trituró usando micropipetas de 1000 μl. La suspensión celular resultante se obtuvo a través de un filtro de 70 μm para eliminar la masa de tejido no digerida, se lavó con PBS que contenía FBS al 2 % y se diluyó en 1 ml de HBSS. A continuación, la suspensión celular se extendió sobre una capa superior de Percoll (Yeason) al 15 % y al 60 % y se sometió a centrifugación en gradiente de densidad a 400 g durante 20 min. La capa de células entre las superficies líquidas se recogió y se lavó con 10 ml de DPBS para obtener suspensiones de células individuales para experimentos posteriores.

Para el análisis de citometría de flujo, las suspensiones unicelulares se tiñeron con anticuerpos relativos a 4 °C durante 30 min en un volumen final de 200 μl. Las células se lavaron con DPBS, se resuspendieron en un volumen final de 400 μl y se filtraron a través de un filtro de 40 μm. Las muestras se recolectaron en un BD Fortessa (BD Biosciences) con el software BD FACSDiva v.8.0.1 y se analizaron con el software FlowJo v.10.6.2 (TreeStar). Los detalles de la inmunotinción y la estrategia de activación de las células inmunitarias y las subpoblaciones de macrófagos cardíacos en el corazón séptico se muestran en las Figs. de datos ampliados. 2d y 3b.

Para medir la función mitocondrial, se usaron fibroblastos L-929 como control para evaluar la capacidad de respuesta al tratamiento en comparación con vesículas aisladas. Se empleó oligomicina (tecnología de señalización celular, 5 μM) para promover la hiperpolarización de la membrana mitocondrial. Se aplicó cianuro de carbonilo-4 (trifluorometoxi) fenilhidrazona (Sigma-Aldrich, 2 μM) para desacoplar la fosforilación oxidativa en las mitocondrias y despolarizar las membranas mitocondriales. Tanto las vesículas aisladas como las células L-929 se administraron a 37 °C durante 1,5 h. Luego, las células o vesículas se tiñeron en medio de cultivo suplementado con 1x MitoNIR (Abcam), que es una sonda fluorescente que mide el potencial de la membrana mitocondrial, durante 20 min a 37 °C. Las células o vesículas fueron adquiridas por un BD Fortessa (BD Biosciences). MFI se analizó utilizando el software FlowJo (TreeStar).

Evaluamos la expresión de Ki67 fijando y permeabilizando las células con un conjunto de tampones de tinción del factor de transcripción Foxp3 (Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y luego tiñendo las células con el anticuerpo anti-Ki67 como se mencionó anteriormente.

Para la clasificación FACS, las suspensiones unicelulares se tiñeron con anticuerpos relativos durante 30 min a 4 °C y luego se lavaron con DPBS. Los sedimentos se resuspendieron con 200 μl de DPBS. Para los experimentos de scRNA-seq, se agregaron Calcein Blue AM (Thermo Fisher Scientific, 4 μg ml−1) y Vybrant DyeCycle Ruby (Thermo Fisher Scientific, 10 μM) en soluciones de 200 μl y se incubaron durante 10 min a 4 °C. Después de la incubación, se obtuvieron células CD45+ nucleadas vivas en un Beckman MoFlo Astrios EQ con una boquilla de 100 μm (Beckman). Para los experimentos de trasplante de Mac1, los macrófagos cardíacos TREM2hi Mac1 (CD45+ CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+) y no Mac1 (CD45+CD11b+F4/80+ y no CD163+RETNLA+) se clasificaron y recolectaron por separado para experimentos adicionales.

Se recogieron células individuales en RPMI 1640 que contenía FBS al 5%. La exclusión con azul de tripano confirmó la viabilidad celular. Las células ordenadas se contaron y la concentración se ajustó a 700-1200 células μl-1. Luego, las suspensiones de una sola célula se cargaron en un Chromium 10x para capturar no más de 10 000 células individuales mediante los kits de reactivos Chromium Single Cell 3' v.3 (10x Genomics). Las células se dividieron en perlas de gel en el instrumento Chromium, donde se produjo la lisis celular y la transcripción inversa del ARN con código de barras. Se llevó a cabo la amplificación de ADN y la construcción de bibliotecas. Las bibliotecas se secuenciaron en un Novaseq 6000 (Illumina) por LC-Bio Technology. Los datos se alinearon con el genoma de referencia GRCm38 usando CellRanger v.4.0 (10x Genomics).

La salida de CellRanger se cargó en Seurat (v.3.1.1) para la agrupación en clústeres sin supervisión. Se eliminaron todos los genes expresados ​​en menos de una célula. Se excluyeron las células que expresan menos de 200 y más de 6000 genes, el identificador molecular único cuenta más de 40 000 y el porcentaje de expresión génica del ADN mitocondrial (ADNmt) superior al 20 %. Los genes mitocondriales se excluyeron de la matriz de expresión.

Para visualizar los datos, utilizamos el paquete Seurat para su posterior análisis. Primero, usamos el método LogNormalize de la función de Normalización del paquete Seurat para evaluar el valor de expresión de los genes. En segundo lugar, realizamos un análisis de componentes principales en la matriz de expresión normalizada con genes altamente variables identificados por la función FindVariableGenes. Con base en los diez componentes principales principales, obtuvimos el resultado del grupo de celdas no supervisadas mediante el método de agrupación ponderado basado en el gráfico del vecino más cercano compartido. Para detectar genes específicos de grupos, identificamos los genes marcadores mediante el bimod (prueba de relación de probabilidad) de la función FindAllMarkers en Seurat. En comparación con otros grupos, los genes cuya expresión era más del 25 % de las células y un logaritmo medio (cambio de pliegue) > 0,26 en el grupo objetivo se definieron como genes marcadores. Los tipos de células se definieron basándose en marcadores conocidos. Se excluyeron las células que expresaban marcadores de células no inmunes.

La reagrupación de células, la visualización de genes marcadores, el análisis DEG, el análisis de enriquecimiento GO y otros análisis bioinformáticos se realizaron con las herramientas OmicStudio (https://www.omicstudio.cn/tool). Los DEG fueron identificados por el bimod con parámetros predeterminados a través de la función FindAllMarkers bajo los siguientes criterios: (1) registro (cambio de pliegue)> 0.26; (2) valor de P <0,01; y (3) min.pct > 0,1.

Los monocitos y macrófagos de las cuatro muestras WT se muestran en la Fig. 2a-d. La Fig. 4e,f muestra muestras de Trem2-/- y muestras de control de compañeros de camada WT 7 días después de CLP, agregadas y analizadas como se describe anteriormente para comparar el impacto de Trem2-/- en el compartimento de monocitos y macrófagos.

Para el análisis de la trayectoria de una sola célula, utilizamos Monocle v.2.4.0 para investigar las trayectorias de desarrollo entre los subconjuntos de macrófagos/monocitos19,27. Los datos de scRNA-seq se escalaron, normalizaron y agruparon con la herramienta Seurat, luego se redujeron a 1500 celdas y se cargaron en un objeto Monocle. La función DifferentialGeneTest se usó para inferir los DEG de cada grupo y usamos los 800 genes principales con el valor q más bajo para secuenciar las células en el análisis de pseudotiempo. La trayectoria de desarrollo se trazó con el comando plot_cell_trajectory. El 'estado_raíz' (el punto de partida) de la trayectoria se definió como el terminal con menor expresión de genes de monocitos. Después de que se construyeron las trayectorias de las células, la función DifferentialGeneTest detectó los DEG a lo largo del pseudotiempo. Los cambios en los 50 genes principales a través del pseudotiempo con los valores q más bajos se visualizaron mediante un mapa de calor utilizando la función plot_pseudotime_heatmap. Se utilizó la función Plot_genes_in_pseudotime para mostrar la tendencia dinámica de los niveles significativos de expresión génica seleccionados.

Corazones de ratones CardRED se cortaron en trozos pequeños y se digirieron en DPBS con 0,25 mg ml-1 de Liberase TL (Sigma-Aldrich), 20 μg ml-1 de DNasa I (Sinopharm Chemical Reagent) y HEPES 10 mM (Sigma-Aldrich) durante 15 min a 37 °C. Luego, las suspensiones de tejido se adquirieron mediante pipeteo suave. Centrifugamos en serie estas suspensiones a 50 gy 300 gy desechamos el sedimento. A continuación, el sobrenadante se centrifugó a 1000 gy se lavó con DPBS. Los sedimentos se resuspendieron con 200 μl de DPBS. Utilizamos la expresión endógena de tdTomato, CD31 y Vybrant DyeCycle Ruby (Thermo Fisher Scientific, 10 μM) para definir las vesículas cardíacas. La estrategia de activación para las vesículas cardíacas se muestra en Datos extendidos Fig. 6c. El material se clasificó en un Beckman MoFlo Astrios EQ (Beckman) con una boquilla de 100 μm.

Las células clasificadas por FACS se lavaron con DPBS y se cuantificaron. Los macrófagos cardíacos (2 × 105 células) se resuspendieron en 25 μl de MG (Corning). Después de anestesiar e intubar a los ratones receptores, se abrió el tórax del ratón y se inyectó MG que contenía macrófagos cardíacos en la cavidad pericárdica utilizando una aguja de calibre 30. A los animales de control solo se les inyectó por vía intrapericárdica 25 µl de MG.

Para los experimentos de distribución y supervivencia celular, las células Mac1 y no Mac1 clasificadas se tiñeron con CMTMR (50 nM) a 37 °C durante 20 min y luego se lavaron con DPBS. Los macrófagos marcados (2 × 105 células) se resuspendieron en 25 μl de MG y luego se trasplantaron a la cavidad pericárdica inmediatamente después de CLP. Tres días más tarde se sacrificaron los ratones. Se recogieron muestras de corazón y se realizaron criosecciones. Las imágenes se adquirieron utilizando un Zeiss LSM 880 (con AiryScan rápido) de acuerdo con los procedimientos estándar y se analizaron con el software ImageJ Pro Plus v.6.0.

La proteína total se aisló del corazón del ratón utilizando RIPA (Applygen) y el sobrenadante se analizó mediante una micromatriz de anticuerpos basada en vidrio y en sándwich para medir cuantitativamente 20 citoquinas (RayBiotech). Cada citocina se analizó por cuadruplicado por matriz. Luego, se cargaron 100 µl de sobrenadante en cada pocillo, se incubaron durante la noche a 4 °C y luego se lavaron exhaustivamente. Se incubó un anticuerpo de detección marcado con biotina durante 2 h seguido de la aplicación de estreptavidina conjugada con AlexaFluor 555 a temperatura ambiente durante 1 h. Los portaobjetos se analizaron con un escáner InnoScan 300 (Innopsys) con excitación de 532 nm y emisión de 635 nm. Obtuvimos datos sin procesar (imágenes) del escáner e intensidades puntuales integradas (archivo .txt delimitado por tabuladores) utilizando el software Mapix v.7.3.1. La visualización de datos se obtuvo mediante Q-Analyzer Software (RayBiotech). Todos los datos sin procesar se convirtieron en log2 para el análisis estadístico.

Todos los análisis estadísticos se realizaron con SPSS v.21.0 (IBM) o Prism v.8.0 (GraphPad Software). Para la comparación entre dos grupos, los datos distribuidos normalmente se evaluaron mediante la prueba t de Student de dos colas no pareadas y los datos sin una distribución normal se evaluaron mediante la prueba U de Mann-Whitney. Para más de dos grupos, los datos distribuidos normalmente se evaluaron mediante ANOVA de una o dos vías, seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Games-Howell, Sidak o Tukey y los datos sin una distribución normal se evaluaron mediante la comparación múltiple de Kruskal-Wallis con Dunn. prueba. Las correlaciones se analizaron mediante el coeficiente de correlación de Pearson. La tasa de supervivencia se analizó mediante el análisis de Kaplan-Meier y la prueba de rango logarítmico. Los datos se presentan como media ± sem o mediana con rango intercuartílico

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de scRNA-seq para este estudio se han depositado en Gene Expression Omnibus con el código de acceso GSE190856. Todos los datos y materiales están disponibles en el documento y en la información complementaria. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

Rudd, KE et al. Incidencia y mortalidad por sepsis a nivel mundial, regional y nacional, 1990–2017: análisis para el Estudio de carga global de morbilidad. Lanceta 395, 200–211 (2020).

Artículo Google Académico

Cantante, M. et al. Las definiciones del tercer consenso internacional para sepsis y shock séptico (Sepsis-3). JAMA 315, 801–810 (2016).

Artículo CAS Google Académico

Ammann, P. et al. Elevación de troponina I en sepsis y shock séptico. Medicina de Cuidados Intensivos 27, 965–969 (2001).

Artículo CAS Google Académico

Brechot, N. et al. Oxigenación de membrana extracorpórea venoarterial para rescatar el shock cardiogénico inducido por sepsis: un estudio de cohorte internacional, multicéntrico y retrospectivo. Lancet 396, 545–552 (2020).

Artículo Google Académico

Hollenberg, SM & Singer, M. Fisiopatología de la miocardiopatía inducida por sepsis. Nat. Rev. Cardiol. 18, 424–434 (2021).

Artículo Google Académico

Lelubre, C. & Vincent, J.-L. Mecanismos y tratamiento de la insuficiencia orgánica en la sepsis. Nat. Rev. Nephrol. 14, 417–427 (2018).

Artículo Google Académico

Swirski, FK & Nahrendorf, M. Cardioinmunología: el sistema inmunitario en la homeostasis y la enfermedad cardiacas. Nat. Rev. Inmunol. 18, 733–744 (2018).

Artículo CAS Google Académico

Heidt, T. et al. Contribución diferencial de los monocitos a los macrófagos cardíacos en estado estacionario y después de un infarto de miocardio. Circ. Res. 115, 284–295 (2014).

Artículo CAS Google Académico

Pinto, AR et al. Revisando la composición celular cardíaca. Circ. Res. 118, 400–409 (2016).

Artículo CAS Google Académico

Williams, JW y col. Biología, clasificación y fenotipo de los macrófagos en la enfermedad cardiovascular: serie de macrófagos JACC en CVD (parte 1). Mermelada. Col. Cardiol. 72, 2166–2180 (2018).

Artículo CAS Google Académico

Sansonetti, M. et al. Macrófagos cardíacos residentes: moduladores cruciales de la (pato)fisiología cardíaca. Res. Básica Cardiol. 115, 77 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Bajpai, G. et al. El corazón humano contiene distintos subconjuntos de macrófagos con orígenes y funciones divergentes. Nat. Medicina. 24, 1234–1245 (2018).

Artículo CAS Google Académico

Alvarez-Argote, S. y CC O'Meara, Los roles evolutivos de los macrófagos cardíacos en la homeostasis, la regeneración y la reparación. En t. J. Mol. ciencia https://doi.org/10.3390/ijms22157923 (2021).

Nicolás-Ávila, JA et al. Una red de macrófagos apoya la homeostasis mitocondrial en el corazón. Celda 183, 94–109 (2020).

Artículo Google Académico

Piquereau, J. et al. Papel protector de PARK2/Parkin en la disfunción mitocondrial y contráctil cardiaca inducida por sepsis. Autofagia 9, 1837–1851 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Brealey, D. et al. Disfunción mitocondrial en un modelo de roedor a largo plazo de sepsis e insuficiencia orgánica. Soy. J. Physiol. Regulatorio, Integrador compensación Fisiol. 286, R491–R497. (2004).

Artículo CAS Google Académico

Brealey, D. et al. Asociación entre la disfunción mitocondrial y la gravedad y el resultado del shock séptico. Lancet 360, 219–223 (2002).

Artículo CAS Google Académico

Pinto, BB et al. La supervivencia mejorada en un modelo de sepsis en ratas a largo plazo se asocia con una menor absorción de calcio mitocondrial a pesar de una mayor demanda energética. crítico Cuidado Med. 45, e840–e848 (2017).

Artículo CAS Google Académico

Dick, SA et al. Los macrófagos cardíacos residentes que se autorrenuevan limitan la remodelación adversa después de un infarto de miocardio. Nat. inmunol. 20, 29–39 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Farbehi, N. et al. El perfil de expresión de una sola célula revela el flujo dinámico de las células del estroma cardíaco, vasculares e inmunitarias en condiciones de salud y lesiones. eLife https://doi.org/10.7554/elife.43882 (2019).

Rey, KR et al. IRF3 y los interferones tipo I alimentan una respuesta fatal al infarto de miocardio. Nat. Medicina. 23, 1481–1487 (2017).

Artículo CAS Google Académico

Ni, S.-H. et al. Los análisis transcriptómicos de una sola célula de las células inmunitarias cardíacas revelan que los macrófagos positivos para CD72 impulsados ​​por Rel inducen lesiones en los cardiomiocitos. Cardiovasc. Res. 118, 1303–1320 (2022).

Artículo CAS Google Académico

Martini, E. et al. La secuenciación unicelular del infiltrado inmunitario del corazón de ratón en la insuficiencia cardíaca provocada por sobrecarga de presión revela el grado de activación inmunitaria. Circulación 140, 2089–2107 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Epelman, S., Lavine, KJ & Randolph, GJ Origen y funciones de los macrófagos tisulares. Inmunidad 41, 21–35 (2014).

Artículo CAS Google Académico

Narasimhan, PB et al. Monocitos no clásicos en salud y enfermedad. año Rev. Inmunol. 37, 439–456 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Forte, E. et al. Las células dendríticas de cebado cruzado exacerban la inmunopatología después del daño tisular isquémico en el corazón. Circulación 143, 821–836 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Trapnell, C. et al. La dinámica y los reguladores de las decisiones del destino celular se revelan mediante el ordenamiento pseudotemporal de células individuales. Nat. Biotecnología. 32, 381–386 (2014).

Artículo CAS Google Académico

Melentijevic, I. et al. Las neuronas de C. elegans desechan agregados de proteínas y mitocondrias bajo estrés neurotóxico. Naturaleza 542, 367–371 (2017).

Artículo CAS Google Académico

Oka, T. et al. El ADN mitocondrial que escapa de la autofagia provoca inflamación e insuficiencia cardíaca. Naturaleza 485, 251–255 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Zhou, R. et al. Un papel para las mitocondrias en la activación del inflamasoma NLRP3. Naturaleza 469, 221–225 (2011).

Artículo CAS Google Académico

Pham, AH, McCaffery, JM & Chan, DC Líneas de ratones con mitocondrias fotoactivables para estudiar la dinámica mitocondrial. Genes 50, 833–843 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Sol, N. et al. Medición de la mitofagia in vivo. mol. Celda 60, 685–696 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Sol, N. et al. Un método de imagen basado en fluorescencia para medir la mitofagia in vitro e in vivo usando mt-Keima. Nat. Protocolo 12, 1576–1587 (2017).

Artículo CAS Google Académico

Bruttger, J. et al. La ablación de células genéticas revela grupos de microglía autorrenovable local en el sistema nervioso central de los mamíferos. Inmunidad https://doi.org/10.1016/j.immuni.2015.06.012 (2015).

Mildner, A. et al. La microglía en el cerebro adulto surge de los monocitos Ly-6ChiCCR2+ solo en condiciones definidas del huésped. Nat. Neurosci. 10, 1544-1553 (2007).

Artículo CAS Google Académico

Jeong, HS et al. Factores de riesgo y resultados de la disfunción miocárdica inducida por sepsis y la miocardiopatía inducida por estrés en sepsis o shock séptico: un estudio retrospectivo comparativo. Medicina 97, e0263 (2018).

Artículo CAS Google Académico

Poelaert, J. et al. Función sistólica y diastólica del ventrículo izquierdo en el shock séptico. Medicina de Cuidados Intensivos 23, 553–560 (1997).

Artículo CAS Google Académico

Martín, L. et al. El corazón séptico: comprensión actual de los mecanismos moleculares y las implicaciones clínicas. Cofre 155, 427–437 (2019).

Artículo Google Académico

Frodermann, V. & Nahrendorf, M. Macrófagos y salud cardiovascular. Fisiol. Rev. 98, 2523–2569 (2018).

Artículo CAS Google Académico

Bajpai, G. et al. Los macrófagos cardíacos CCR2- y CCR2+ residentes en tejidos orquestan diferencialmente el reclutamiento de monocitos y la especificación del destino después de una lesión miocárdica. Circ. Res. 124, 263–278 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Hoyer, FF et al. Las respuestas de macrófagos específicas de tejido a lesiones remotas impactan en el resultado del desafío inmunitario local subsiguiente. Inmunidad https://doi.org/10.1016/j.immuni.2019.10.010 (2019).

Deczkowska, A., Weiner, A. & Amit, I. Fisiología, patología y posibles aplicaciones terapéuticas de la vía de señalización TREM2. Celda 181, 1207–1217 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Ulland, TK & Colonna, M. TREM2: un actor clave en la biología microglial y la enfermedad de Alzheimer. Nat. Rev. Neurol. 14, 667–675 (2018).

Artículo CAS Google Académico

Chen, Q. et al. El receptor desencadenante expresado en las células mieloides-2 protege contra la sepsis polimicrobiana al mejorar la eliminación bacteriana. Soy. J. Resp.Crit. Cuidado Med. 188, 201–212 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Seno, H. et al. La reparación eficiente de heridas en la mucosa del colon requiere la señalización de Trem2. PNAS 106, 256–261 (2009).

Artículo CAS Google Académico

Wang, Y. et al. La respuesta microglial temprana mediada por TREM2 limita la difusión y la toxicidad de las placas amiloides. Exp. J. Medicina. 213, 667–675 (2016).

Artículo CAS Google Académico

Zheng, H. et al. TREM2 promueve la supervivencia microglial al activar la vía Wnt/β-catenina. J. Neurosci. 37, 1772-1784 (2017).

Artículo CAS Google Académico

Rittirsch, D. et al. Inmunodiseño de sepsis experimental por ligadura y punción cecal. Nat. Protocolo 4, 31–36 (2009).

Artículo CAS Google Académico

Flameng, W. et al. Correlatos ultraestructurales y citoquímicos de la protección del miocardio por hipotermia cardíaca en el hombre. J. Thorac. Cardiovasc. Cirugía 79, 413–424 (1980).

Artículo CAS Google Académico

Descargar referencias

Dedicamos este artículo al Prof. Andreas Hoeft (Departamento de Anestesiología y Medicina de Cuidados Intensivos, Hospital Universitario de Bonn), quien lamentablemente falleció antes de que se enviara el artículo para su publicación. El Prof. Hoeft jugó un papel importante en este estudio y agradecemos especialmente su contribución a su conceptualización. También agradecemos a D. Neculai (Departamento de Biología Celular y Departamento de Patología del Hospital Sir Run Run Shaw, Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang) y M. Guan (Instituto de Genética, Universidad de Zhejiang) por su útil discusión y asesoramiento lingüístico. Agradecemos a C. Yang (Centro de Microscopía Crioelectrónica, Universidad de Zhejiang); L. Xie y J. Li (Centro de Microscopía Electrónica, Universidad de Zhejiang); S. Liu, G.Xiao, J. Xuan, X. Song y Y. Li (Instalaciones principales, Facultad de Medicina, Universidad de Zhejiang) por la asistencia técnica; L. Wang y H. Lou (Centro de animales de laboratorio, Universidad de Zhejiang) por su apoyo en estudios con animales; J. Zhao y J. Lin (The Second Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine) por su ayuda con la ecocardiografía, X. Wang y H. Zhu (The First Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine) por su ayuda con el aislamiento de cardiomiocitos y análisis estadístico análisis. También agradecemos al personal de LC-Bio Technology por los servicios de secuenciación. Este estudio fue financiado parcialmente por la Fundación de Ciencias Naturales de China (82230074, 81720108025 a XF, 82072221 a KZ, 81971809 a YJ y 92049108 a XL), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Zhejiang (LZ22H150002 a KZ) y la National Key Research and Programa de Desarrollo de China (2018YFC2001904 a XF y 2017YFE0196600 a XL).

Estos autores contribuyeron por igual: Kai Zhang, Yang Wang, Shiyu Chen, Jiali Mao

Fallecido: Andreas Hoeft.

Departamento de Anestesiología y Cuidados Intensivos, El Primer Hospital Afiliado, Escuela de Medicina de la Universidad de Zhejiang, Hangzhou, China

Kai Zhang, Yang Wang, Shiyu Chen, Jiali Mao, Yue Jin, Hui Ye y Xiangming Fang

Departamento de Medicina de Cuidados Críticos, Primer Hospital Popular de Hangzhou afiliado, Escuela de Medicina de la Universidad de Zhejiang, Hangzhou, China

yang wang

Hospital Infantil, Centro Nacional de Investigación Clínica para la Salud Infantil, Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang, Hangzhou, China

Yan Zhang, Xiwang Liu, Chenchen Gong, Xuejun Cheng, Xiaoli Huang, Qixing Chen y Xuekun Li

Departamento de Anestesiología y Medicina de Cuidados Intensivos, Hospital Universitario de Bonn, Bonn, Alemania

Andrew Hoeft

Instituto de Medicina Traslacional, Facultad de Medicina, Universidad de Zhejiang, Hangzhou, China

Xuekun Li

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

KZ, YW, SC, JM y XF conceptualizaron y diseñaron el proyecto. KZ y YW realizaron estudios de citometría de flujo y realizaron análisis de scRNA-seq. KZSC, JM, HY, CG e YZ realizaron estudios in vivo. SC, JM, XL, YJ, XC y XH realizaron experimentos in vitro. YJ y SC realizaron un análisis estadístico de los datos. AH proporcionó ideas y consejos críticos. XF, XL, KZ, SC, QC y YW obtuvieron los datos y escribieron el manuscrito. XF, XL y QC supervisaron el estudio.

Correspondencia con Qixing Chen, Xuekun Li o Xiangming Fang.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Metabolism agradece a Andrés Hidalgo, José Ángel Nicolás y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor principal de manejo: Ashley Castellanos-Jankiewicz, en colaboración con el equipo de Nature Metabolism.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

ad, imágenes de ecocardiografía representativas (a) y % de FE (b), % de FS (c) y CO (d) medidos por ecocardiografía en ratones de tipo salvaje (WT) en estado estacionario (SS), 1, 3, 7, y 21 días después de CLP (SS, n = 6 ratones; CLP 3 días, n = 6 ratones; CLP 7 días, n = 5 ratones; CLP 21 días, n = 6 ratones). e,f, Gráficos que muestran los niveles de cTnI (e) y LDH (f) en el suero. g,h, Gráficos que muestran los niveles de ARNm de Anp (g), Bnp (h) en los tejidos del corazón; n = 5-6 (e,f,g,h) ratones para cada tratamiento. i, Mapa de calor que muestra la expresión escalada de 14 citoquinas seleccionadas (fila) en 22 muestras de lisado de tejido cardíaco (columna), coloreadas por diferentes condiciones. En bh, cada símbolo representa un animal y los datos se presentan como media ± SEM. Los valores de P bilaterales se determinaron mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Games-Howell (bd, f) o Tukey (g), Kruskal-Wallis con la prueba de comparaciones múltiples de Dunn (e, h). Se muestran los valores P exactos. Los resultados representan cuatro experimentos independientes (bh).

Datos fuente

a, Gráficos de violín del identificador molecular único (UMI) promedio (izquierda) y números de genes (derecha) de scRNA-seq en diferentes etapas de la sepsis. Cada punto representa una celda. b, gráficos UMAP que muestran la expresión de genes marcadores seleccionados para los tipos de células definidos en la Fig. 1c. c, Gráficos de violín que muestran la expresión de genes marcadores seleccionados en todos los tipos de células definidos correspondientes a la Fig. 1c. d, estrategia de activación de citometría de flujo de 10 colores para identificar varios tipos de células inmunitarias en corazones murinos. e, Gráfico que muestra los porcentajes de células inmunes cardíacas durante la progresión de la sepsis (n = 4 - 5 ratones para cada tratamiento). Cada símbolo representa un animal en e. Los datos se presentan como media ± SEM. Los valores de P bilaterales se determinaron mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey, ns, no significativo. En e, los experimentos se realizaron cuatro veces.

Datos fuente

a, Gráficos UMAP que muestran la expresión de genes marcadores seleccionados para las subpoblaciones de monocitos y macrófagos. b, estrategia de activación para células Mac1 identificadas (CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+). c, gráfico que muestra los porcentajes de macrófagos cardíacos CD163+RETNLA+ durante la progresión de la sepsis (SS, n = 8 ratones; CLP 3 días, n = 8 ratones; CLP 7 días, n = 9 ratones; CLP 21 días, n = 10 ratones). Cada símbolo representa un animal. Las barras muestran la media ± SEM. Los valores de P bilaterales se determinaron mediante ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Games-Howell. d, Imágenes de inmunofluorescencia representativas que muestran la presencia de CD163 (verde), CD68 (rojo) y núcleos (azul) en tejidos cardíacos durante la progresión de la sepsis. n = 6 ratones por grupo. Barras de escala, 20 μm. Se muestran los valores P exactos. Los resultados representan cuatro experimentos independientes (c, d). SS, estado estacionario.

Datos fuente

a, Predicción de monóculo de la trayectoria de desarrollo del compartimento de monocitos-macrófagos con pseudotiempo mapeado a lo largo. b, Expresión génica que define grupos trazada a lo largo del pseudotiempo, con el grupo de Seurat mapeado a lo largo. c, Ilustración esquemática del seguimiento de linaje de células Mac1 en ratones Cx3cr1CreERT2:Rosa26tdTom. d, gráficos de contorno representativos que muestran la expresión de tdTomato (CX3CR1) en monocitos sanguíneos CD115+CD11b+ controlados, macrófagos cardíacos CD45+CD11b+F4/80+, macrófagos CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+ y gráfico que muestra los porcentajes de tdTomato -células marcadas en esas células (0 semana, n = 4 ratones; 1 semana, n = 5 ratones; 3 semanas, n = 5 ratones; 5 semanas, n = 2 ratones; 6 semanas, n = 3 ratones). Las barras son la media ± SEM. e, Gráficos de contorno representativos que muestran la expresión de Ki67 en macrófagos CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+ controlados y gráficos que muestran los porcentajes de expresión de Ki67 en macrófagos CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+ en estado estacionario (SS) , 3 días y 7 días después de CLP. Cada símbolo representa un animal. Los datos se presentan como media ± SEM. Los valores de P bilaterales se determinaron mediante ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Games-Howell. Se muestran los valores P exactos. Los resultados representan cinco (d) y dos (e) experimentos independientes.

Datos fuente

a, Gráficos de volcán que muestran el cambio de pliegue de la expresión génica (eje x, escala log2) y la importancia del valor p (eje y, escala -log10) en el subconjunto Mac1 de estado estacionario (SS) frente al subconjunto Mac2 (izquierda), subconjunto Mac3 (centro) o subconjunto Mac4 (derecha) de 3 días después de CLP. Los genes significativos seleccionados fueron etiquetados. Los valores de P bilaterales se determinaron mediante la prueba U de Mann-Whitney. b, Gráficos de violín que muestran la expresión de Trem2 en todos los tipos de células inmunes definidos correspondientes a la Fig. 1c. c, Gráfico que muestra la cuantificación de la intensidad de fluorescencia media (MFI) de la expresión de TREM2 en macrófagos cardíacos CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+ y CD45+CD11b+F4/80+(no CD163+RETNLA+) en estado estacionario y 7 días post-CLP (n = 8 ratones para cada grupo). Cada símbolo representa un animal. Los datos se presentan como media ± SEM. Los valores de P bilaterales se determinaron mediante Kruskal-Wallis con la prueba de comparación múltiple de Dunn. d, Gráficos UMAP que muestran los resultados de agrupamiento de células del compartimento de monocitos-macrófagos de corazones de controles de compañeros de camada WT y ratones Trem2-KO en estado estacionario y 3 días después de CLP. Los monocitos-macrófagos bajo cada condición se reducen a 1000 células. Las subpoblaciones obtenidas por Seurat fueron idénticas a las previamente identificadas en la Fig. 2a según sus genes marcadores. e, Gráficos de barras que muestran la distribución de grupos de los subconjuntos de monocitos y macrófagos en controles de compañeros de camada WT y ratones Trem2-KO en estado estacionario y 3 días después de CLP. f, gráfico que muestra los porcentajes de células inmunitarias cardíacas en controles WT y ratones Trem2-KO a los 0, 3 y 7 días después de CLP (n = 4-5 ratones para cada tratamiento). Cada símbolo representa un ratón. Los datos se presentan como media ± SEM, los valores de P bilaterales se determinaron mediante la prueba U de Mann-Whitney, ns, no significativo. Los resultados representan tres experimentos independientes (c, f).

Datos fuente

a, imágenes TEM que muestran vesículas en corazones de ratones WT 3 días después de CLP. b, imágenes TEM que muestran vesículas de mitocondrias intersticiales cardíacas (puntas de flecha rojas) de ratones WT en estado estacionario (SS) o 3 días después de CLP. Gráfico de barras que muestra el número de mitocondrias libres por campo de visión (FOV). Cada símbolo representa un FOV. Se seleccionan al azar cinco campos de visión para el ensayo de cada animal (n = 3). c, Ilustración esquemática de la estrategia de activación para recolectar vesículas de corazones de ratones. d, análisis de citometría de flujo de vesículas purificadas teñidas con las sondas selectivas de mitocondrias MitoTracker Green y MitoNIR (n = 3 por grupo). e, Potencial de membrana mitocondrial en vesículas cardíacas y fibroblastos cultivados según lo evaluado por los niveles de MFI de MitoNIR en condiciones basales y en presencia de agentes despolarizantes (FCCP) o hiperpolarizantes (Oligomicina) (n = 3-4 por grupo). f, imágenes TEM representativas pseudocoloreadas de dos células mononucleares (grises) que toman vesículas que contienen mitocondrias (marrones) de cardiomiocitos (verdes) de ratones WT 7 días después de CLP. g, La incorporación de proteína tdTomato derivada de cardiomiocitos en macrófagos CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+, macrófagos CD45+CD11b+F4/80+ (no CD163+RETNLA+) y macrófagos CD45+CD11b+F4/80-LY6C+ monocitos de ratones αMHCCre/+ (control) y αMHCCre/+:Rosa26TdTom (CardRED) en SS y 7 días después de CLP (ratones de control, n = 4; CardRED SS, n = 5; CardRED CLP 7d, n = 8). h, La incorporación de la proteína mt-Dendra2 derivada de cardiomiocitos en macrófagos CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+, macrófagos CD45+CD11b+F4/80+(no CD163+RETNLA+) y macrófagos CD45+CD11b+F4/80 -Monocitos LY6C+ de ratones αMHCCre/+ (control) y αMHCCre/+:mtD2Flox/Flox (MitoCard) en SS y 7 días después de CLP (ratones de control, n = 4; MitoCard SS, n = 6; MitoCard CLP 7d, n = 6). i, Proporciones de células TUNEL+ y TUNEL+cTnI+ en corazones de ratones WT en SS y 3 días después de CLP (n = 6 ratones por grupo). Todas las barras de escala se indican en las imágenes. Los datos se presentan como media ± SEM (b,e,g,h,i). Los valores de P bilaterales se determinaron mediante la prueba U de Mann-Whitney (b), o mediante la prueba de comparación múltiple de Kruskal-Wallis con Dunn (p. ej., h, i). Los resultados representan tres (a,b,d,gi) y dos (e,f) experimentos independientes.

Datos fuente

a, Ilustración esquemática de las mitocondrias de los cardiomiocitos marcadas con el virus AAV9-Tnnt2-mt-Keima. Panel derecho que muestra las señales de fluorescencia de mt-Keima en corazones de ratones WT en las semanas 0, 3 y 6 después de la infección por el virus, respectivamente. Las mitocondrias marcadas con Keima se indicaron mediante una fluorescencia diferente en entornos neutros (Keima 458 nm; verde) y ácidos (Keima 561 nm; rojo). Barras de escala, 20 μm. b, Gráficos de dispersión que muestran los niveles de expresión promedio (escala log10 (FPKM+1)) de las poblaciones totales de macrófagos de los controles de compañeros de camada WT (eje y) y ratones Trem2-/- (eje x). c, Gráficos de violín que muestran la expresión génica endocítica seleccionada en macrófagos totales de controles de compañeros de camada WT y ratones Trem2-/-. d, Protocolo de estudio de trasplante de médula ósea de donantes WT o Trem2-/- en ratones receptores CardRED. e, f, Imágenes representativas de TEM que muestran vesículas de mitocondrias intersticiales cardíacas de ratones WT y Trem2-/- en estado estacionario (f) y 7 días después de CLP (e), Barras de escala, 5 μm. Gráfico de barras que muestra la cuantificación del número de mitocondrias libres por campo de visión (FOV). Cada símbolo representa un FOV (n = 3 ratones para cada tratamiento). Se seleccionan al azar cinco campos de visión para el ensayo de cada animal. Los datos se presentan como media ± SEM (e,f). Los valores de P bilaterales se determinaron mediante la prueba U de Mann-Whitney (e, f). Los resultados representan dos experimentos independientes (e,f).

Datos fuente

Los ratones ai, WT y Trem2-/- se sometieron a CLP y se examinó la función cardíaca en estado estacionario (SS) y 3, 7 y 21 días después de CLP. Gráfico que muestra FS% (a); CO (b) medido por ecocardiografía; Gráfico que muestra los niveles de LDH en el suero (c); Gráficos que muestran los niveles de ARNm de Anp (d), Bnp (e), Tnfα (f), Il-1β (g), Ccl2 (h) e Il-6 (i) en los lisados ​​​​de tejido cardíaco (ab, n = 7– 8 ratones; c, n = 6-8 ratones; di, n = 6-7 ratones para cada tratamiento). j, Protocolo de estudio de trasplante de médula ósea (BMT) de donantes WT y Trem2-/- (antecedentes CD45.2) en receptores WT (antecedentes CD45.1). k, Gráficos de contorno representativos de las expresiones de CD45.1 y CD45.2 en el subconjunto CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+ Mac1 controlado en ratones receptores 1, 3, 5 y 8 semanas después del BMT. l, Gráfico que muestra los porcentajes de células CD45.2+ en el subconjunto CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+ Mac1 después de BMT (n = 4-7 ratones para cada grupo). m, Gráficos de contorno representativos de la expresión de TREM2 en CD45+CD11b sincronizado +F4/80+CD163+ macrófagos en corazones de quimeras WT→WT (Trem2+/+Ch) y quimeras Trem2-/-→WT (Trem2-/-Ch) 8 semanas después de BMT. Gráfico que muestra los niveles de ARNm de Trem2 en lisados ​​de tejido cardíaco (n = 6 ratones para cada grupo). n, Gráficos que muestran los niveles de ARNm de Anp y Bnp en los lisados ​​de tejido cardíaco 7 días después de CLP (n = 11 ratones para cada grupo). o, Gráficos que muestran los niveles de ARNm de Tnfα, Il1β, Ccl2 e Il6 en los lisados ​​de tejido cardíaco 7 días después de CLP (n = 11 ratones para cada grupo). Cada símbolo representa un animal. Todos los datos se presentan como media ± SEM. Los valores de P bilaterales se determinaron mediante la prueba U de Mann-Whitney (ai,mo) o mediante la prueba de comparación múltiple de Kruskal-Wallis con Dunn (l). Los resultados representan al menos cuatro (ai,l) y tres (mo) experimentos independientes.

Datos fuente

a, se aislaron células TREM2hi Mac1 (CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+) y no Mac1 (CD45+CD11b+F4/80+ y no CD163+RETNLA+) de ratones CD45.1. Se mezclaron células Mac1 o no Mac1 (2 × 105 células por ratón) con Matrigel (MG) y se trasplantaron en los corazones de ratones CD45.2, respectivamente. Siete días después del trasplante, los macrófagos de los corazones de los receptores (CD45.2) se analizaron con un ensayo de citometría de flujo. b, c, Gráficos que muestran los porcentajes del total de células Mac1 (b) y CD45.1+ Mac1 (c) dentro de las poblaciones CD45+ de los corazones de los receptores (CD45.2) a los 1, 3 y 7 días después de la célula trasplante, respectivamente (n = 6 ratones para cada tratamiento). d,e, Gráficos que muestran los porcentajes del total de células no Mac1 (d) y CD45.1+ no Mac1 (e) dentro de las poblaciones CD45+ de corazones de receptores (CD45.2) a 1, 3 y 7 días ) después del trasplante de células, respectivamente (n = 5-6 ratones para cada tratamiento). f,g, se obtuvieron células TREM2hi Mac1 (CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+) y no Mac1 (CD45+CD11b+F4/80+ y no CD163+RETNLA+) de corazones de ratones WT mediante FACS y teñidos por CMTMR. Luego, ambos tipos de células (2 × 105 células/ratón mezcladas con Matrigel) se inyectaron respectivamente en la cavidad pericárdica de los ratones receptores inmediatamente después de CLP. f, Imágenes de inmunofluorescencia representativas que muestran las células trasplantadas en el epicardio (Epi), el intermiocardio (Inter) y el endocardio (Endo) de los ratones receptores 3 días después del trasplante de células. Señales CMTMR (rojas) que indican celdas Mac1 o no Mac1; capa epicárdica (EL); miocardio (Myo); capa interna (IL). Barra de escala, 20 μm. g, Imágenes de inmunofluorescencia representativas que muestran las células Mac1 marcadas con CMTMR trasplantadas en ratones MitoCard 3 días después de CLP. Imágenes de reconstrucción 3D del área del cuadro discontinuo, que ilustran las mitocondrias derivadas de cardiomiocitos (mtDendra2+, verde) presentadas en las células trasplantadas (CTMMR+, rojo). Los núcleos se mostraron en azul (DAPI). Barra de escala, 10 μm. n = 6 ratones por grupo (f, g). Las barras muestran la media ± SEM, los valores de P bilaterales se determinaron mediante ANOVA unidireccional con comparaciones múltiples (be). Los resultados representan cuatro (be) y dos (f,g) experimentos independientes.

Datos fuente

a, Ilustración esquemática del trasplante de células Mac1 en ratones Trem2-/-. Las células Mac1 (CD45+CD11b+F4/80+CD163+RETNLA+) aisladas de ratones WT y Trem2-/- se mezclaron con Matrigel (MG), respectivamente, y luego se trasplantaron a la cavidad pericárdica de ratones Trem2-/- (2x 105 células/animal) inmediatamente después de CLP. A los ratones de control se les inyectó MG solamente. Los ratones se analizaron 3 o 7 días después del trasplante. bd, Gráficos que muestran EF% (b), FS% (c) y CO (d) medidos por ecocardiografía. e,f, Gráficos que muestran los niveles de cTnI (e) y LDH (f) en el suero. g,h, Gráficos que muestran los niveles de ARNm de Anp (g) y Bnp (h) en los lisados ​​de tejido cardíaco. i, j, Gráficos que muestran los niveles de ARNm de Tnfα, Il1β, Ccl2 e Il6 en los lisados ​​de tejido cardíaco a los 3 (i) y 7 (j) días después de CLP. k, Gráfico que muestra el contenido de ATP en lisados ​​de tejido cardíaco. l, Gráficos que muestran los niveles de lactato sérico. bl, cada símbolo representa un animal (n = 6 ratones para cada tratamiento). Todos los datos se presentan como media ± SEM. Valores de p bilaterales de Kruskal-Wallis con la prueba de comparación múltiple de Dunn, ns, no significativos. m, Diagrama esquemático que muestra las mitocondrias derivadas de cardiomiocitos que fagocitan TREM2hi Mac1 y protegen el corazón séptico. scRNA-seq descubre un subconjunto de macrófagos cardíacos que expresaba mucho TREM2 y CD163; La sepsis estimula la liberación masiva de mitocondrias derivadas de cardiomiocitos; Las células TREM2hi Mac1 eliminan las mitocondrias defectuosas y protegen el corazón séptico. Los resultados representan dos (bl) experimentos independientes.

Datos fuente

Tablas complementarias 1 a 3 y leyendas de los videos complementarios 1 a 6.

La sepsis induce la liberación de exoferos derivados de cardiomiocitos. La reconstrucción 3D de cortes de corazón de ratones CardRED muestra la presencia de mitocondrias (Tom20, cian) en exóforos derivados de cardiomiocitos (rojo) y la acumulación de exóforos Tomato+ colocalizados con Tom20 en corazones sépticos.

Las células Mac1 toman exóforos cardíacos que contienen mitocondrias en SICM. Reconstrucción 3D de cortes de corazón de ratones CardRED. Células Mac1 (TREM2, verde) fagocitaron exoferos derivados de cardiomiocitos (rojo). Los exóforos en las células Mac1 incluían mitocondrias (Tom20, blanco).

Transferencia de mitocondrias derivadas de cardiomiocitos a células Mac1. Reconstrucción 3D de cortes de corazón de ratones MitoCard. Las células Mac1 (TREM2, rojo) incorporaron mitocondrias derivadas de cardiomiocitos (mtDendra2, verde).

Mitocondrias derivadas de cardiomiocitos procesadas con fagolisosomas LAMP1+ en células Mac1. Reconstrucción 3D de cortes de corazón de ratones MitoCard. Mitocondrias derivadas de cardiomiocitos (mtDendra2, verde) fagocitadas por células Mac1 (TREM2, rojo) parcialmente localizadas en lisosomas (LAMP1, blanco).

La deficiencia de Trem2 afecta la captación de mitocondrias derivadas de cardiomiocitos por el subconjunto de Mac1 en el corazón séptico. Parte 1: Ilustración esquemática de las mitocondrias de los cardiomiocitos marcadas con el virus AAV9-Tnnt2-mt-Keima. Las mitocondrias marcadas con Keima se indicaron mediante una fluorescencia diferente en entornos neutros (Keima 458nm, verde) y ácidos (Keima 561nm, rojo). Parte 2: la reconstrucción 3D mostró que los macrófagos TREM2+ (verde) absorbieron mitocondrias derivadas de cardiomiocitos (mtKeima-458, cian) y algunas mitocondrias en un ambiente ácido (mtKeima-561, rojo) en los corazones de AAV9-Tnnt2-mt-Keima -ratones infectados. Parte 3: los macrófagos CD163+ (verde) incorporaron mitocondrias derivadas de cardiomiocitos (mtKeima-458, cian; mtKeima-561, rojo) en corazones de ratones WT y Trem2-/- infectados con AAV9-Tnnt2-mt-Keima.

Las células Mac1 trasplantadas engullen mitocondrias derivadas de cardiomiocitos en SICM. Reconstrucción 3D de cortes de corazón de ratones MitoCard. Las células Mac1 inyectadas (CTMMR, rojo) fagocitaron mitocondrias derivadas de cardiomiocitos (mtDendra2, verde).

Datos de RNA-seq de una sola célula y datos de fuente estadística.

Datos de RNA-seq de una sola célula y datos de fuente estadística.

Fuente de datos estadísticos.

Fuente de datos estadísticos.

Fuente de datos estadísticos.

Fuente de datos estadísticos.

Fuente de datos estadísticos.

Fuente de datos estadísticos.

Fuente de datos estadísticos.

Fuente de datos estadísticos.

Fuente de datos estadísticos.

Datos de RNA-seq de una sola célula y datos de fuente estadística.

Fuente de datos estadísticos.

Datos de RNA-seq de una sola célula y datos de fuente estadística.

Fuente de datos estadísticos.

Fuente de datos estadísticos.

Fuente de datos estadísticos.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Zhang, K., Wang, Y., Chen, S. et al. Los macrófagos residentes de TREM2hi protegen el corazón séptico al mantener la homeostasis de los cardiomiocitos. Nat Metab 5, 129–146 (2023). https://doi.org/10.1038/s42255-022-00715-5

Descargar cita

Recibido: 04 febrero 2022

Aceptado: 22 de noviembre de 2022

Publicado: 12 enero 2023

Fecha de emisión: enero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42255-022-00715-5

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt

Nature Reviews Cardiología (2023)

Metabolismo de la naturaleza (2023)

Informes actuales de cardiología (2023)