Programación del ensamblaje multicelular con moléculas sintéticas de adhesión celular

Nature, volumen 614, páginas 144–152 (2023)Citar este artículo

26k Accesos

3 citas

459 Altmetric

Detalles de métricas

Las moléculas de adhesión celular son omnipresentes en los organismos multicelulares y especifican interacciones célula-célula precisas en procesos tan diversos como el desarrollo de tejidos, el tráfico de células inmunitarias y el cableado del sistema nervioso1,2,3,4. Aquí mostramos que se puede generar una amplia gama de moléculas de adhesión celular sintéticas mediante la combinación de interacciones extracelulares ortogonales con dominios intracelulares de moléculas de adhesión nativas, como cadherinas e integrinas. Las moléculas resultantes producen interacciones célula-célula personalizadas con propiedades de adhesión similares a las interacciones nativas. La identidad del dominio intracelular de las moléculas de adhesión celular sintéticas especifica la morfología y la mecánica de la interfaz, mientras que diversos dominios de interacción extracelulares homotípicos o heterotípicos especifican independientemente la conectividad entre las células. Este conjunto de herramientas de moléculas de adhesión ortogonales permite el ensamblaje racionalmente programado de arquitecturas multicelulares, así como la remodelación sistemática de tejidos nativos. La modularidad de las moléculas de adhesión celular sintéticas proporciona información fundamental sobre cómo pueden haber evolucionado las distintas clases de interfaces célula-célula. En general, estas herramientas ofrecen poderosas capacidades para la ingeniería de células y tejidos y para el estudio sistemático de la organización multicelular.

La capacidad de programar sistemáticamente la adhesión célula-célula proporcionaría nuevas y poderosas herramientas para estudiar el desarrollo, la neurobiología y la inmunología, y podría facilitar la reparación de tejidos multicelulares y el diseño de células terapéuticas5,6 (Fig. 1a). No obstante, la ingeniería de adhesión en células de metazoos sigue siendo un área poco explorada en biología sintética.

a, Diversos roles funcionales de la adhesión celular. b, El diseño conceptual de los receptores synCAM. El dominio extracelular de una CAM (izquierda) se reemplaza por GFP y un nanocuerpo de unión a GFP (anti-GFP; derecha). También se muestra un control de sujeción que carece de un ICD (centro). c, Proyección máxima de ×20 imágenes de microscopía confocal de interfaces synCAM por pares. Barra de escala, 10 µm. t = 3 h. Una célula que expresa GFP (azul) está unida a una célula que expresa anti-GFP (naranja). Se indica el dominio CAM TM e ICD para cada par (la correa es el control que carece del ICD) (arriba). Abajo, el canal GFP de las interfaces de arriba, destacando las diferencias en el enriquecimiento del receptor en la interfaz. Los niveles de expresión de synCAM coincidentes se muestran en Datos extendidos Fig. 1. d, Los ángulos de contacto medidos desde las interfaces que se muestran en a. n = 20 (anclaje), n = 20 (WT ECAD), n = 20 (DLL1), n ​​= 20 (JAM-B), n = 20 (NCAM-1), n ​​= 20 (ICAM-1), n = 20 (ECAD), n = 20 (ITGB1), n ​​= 20 (ITGB2), n = 15 (MUC4). También se muestran los ángulos de contacto para la interacción célula-célula homotípica WT ECAD. e, La fracción de enriquecimiento de GFP en la interfaz célula-célula de c. n = 20 (anclaje), n = 20 (DLL1), n ​​= 20 (JAM-B), n = 20 (NCAM-1), n ​​= 20 (ICAM-1), n ​​= 20 (ECAD), n = 20 (ITGB1), n ​​= 20 (ITGB2), n = 15 (MUC4). f, Cuantificación de los ángulos de contacto de células L929 por pares que expresan synCAM GFP/anti-GFP con las afinidades indicadas y en presencia (azul) o ausencia (negro) de un ICD ICAM-1. n = 20 pares. Las barras de error muestran los intervalos de confianza del 95%. t = 3 h. Los niveles de expresión de synCAM coincidentes se muestran en la Fig. 1 de datos extendidos. En la Fig. 3 de datos extendidos se muestra un análisis alternativo (ensayo de clasificación de células de competencia) de la misma serie de células synCAM de afinidad alterada. Para los diagramas de caja en d y e, el la línea central muestra la mediana, los límites de la caja muestran el percentil 25 al 75 y los bigotes muestran los valores mínimo a máximo.

Datos fuente

Las interacciones célula-célula nativa están mediadas por una gran colección de moléculas de adhesión celular (CAM): proteínas transmembrana complejas que se unen a las células vecinas o a la matriz e inducen una respuesta adhesiva mecánica, que a menudo implica reordenamientos del citoesqueleto7,8,9,10,11. Los ejemplos de CAM incluyen integrinas, que ensamblan adherencias focales, y cadherinas, que ensamblan uniones adherentes entre células epiteliales11,12,13,14. La complejidad estructural y la diversidad funcional de las CAM hacen que no quede claro si la unión extracelular y las funciones de reorganización del citoesqueleto mediadas por el dominio intracelular se pueden desacoplar y recombinar para generar nuevas conectividades célula-célula, aunque estudios previos indican el potencial de modularidad15,16,17, 18,19.

Aquí exploramos sistemáticamente la modularidad de las CAM mediante la fusión de dominios de unión extracelulares (ECD) ortogonales a dominios intracelulares (ICD) de CAM endógenos, generando así CAM sintéticas (synCAM). Caracterizamos las interfaces célula-célula resultantes y probamos si las synCAM pueden programar una nueva organización multicelular.

Generamos synCAM heterófilos en los que una interacción de unión ortogonal bien caracterizada, la interacción GFP-anti-GFP (nanocuerpo), se fusiona con los ICD de E-cadherina (ECAD), integrina β1 (ITGB1), integrina β2 (ITGB2), molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1), proteína tipo delta 1 (DLL1), molécula de adhesión de unión B (JAM-B), molécula de adhesión de células neurales 1 (NCAM-1) y mucina 4 (MUC-4)20 (Fig. .1b). La región transmembrana (TM) y el ICD de la CAM del donante se fusionaron con GFP o ECD anti-GFP.

Luego probamos si la synCAM afín emparejada con ICD emparejados simétricamente puede impulsar la formación de uniones entre fibroblastos de ratón L929 (una línea celular con baja adhesión endógena que se usa para evaluar la clasificación de adhesión diferencial de cadherina)21,22. Las células que expresaban synCAM afines se mezclaron en una placa de fondo plano y de unión ultrabaja (ULA) y se tomaron imágenes mediante microscopía confocal (Fig. 1c). Comparamos las interfaces impulsadas por synCAM con las formadas por moléculas de adhesión nativas (por ejemplo, ECAD de tipo salvaje (WT)) o por una atadura simple (GFP o anti-GFP fusionadas con un dominio transmembrana que carece de ICD). synCAMs/tethers coincidieron con la expresión (Datos extendidos Fig. 1).

Varias synCAM (ICD: ECAD, ITGB1, ITGB2, ICAM-1 y MUC-4) formaron interfaces extensas comparables a las observadas con cadherina nativa. Se forman interfaces similares a las nativas a pesar de que estas moléculas carecen por completo de sus grandes dominios extracelulares nativos. Por el contrario, la correa (sin ICD) no formó una interfaz extensa, mostrando solo un pequeño punto de contacto.

Varios otros synCAM (ICD: NCAM-1, JAM-B y DLL1) exhibieron un fenotipo distinto. Las interfaces resultantes eran pequeñas, pero con un enriquecimiento sustancial de la interfaz de las synCAM marcadas con GFP (Fig. 1c). Por el contrario, la señal de GFP en pares de células atadas se mantuvo distribuida por toda la membrana. Por lo tanto, estas synCAM impulsan un fenotipo distinto de agrupamiento espacial enriquecido en la interfaz cuando se activan.

Para analizar cuantitativamente la geometría de la interfaz para las interacciones synCAM (15–20 pares de células), medimos el ángulo de contacto, una métrica estándar de tensión superficial aparente entre células que se correlaciona con el tamaño de la interfaz23,24,25 (Fig. 1d). También medimos la fracción de enriquecimiento (la fracción de synCAM etiquetada con GFP localizada en la interfaz versus la membrana total; Fig. 1e). Estos resultados muestran dos clases fenotípicas principales de synCAM: una clase induce la formación de interfaces célula-célula grandes y extensas (ICD: ECAD, ITGB1, ITGB2 e ICAM-1, MUC-4), y otra clase induce la formación de pequeñas pero interfaces altamente enriquecidas (ICDs: NCAM-1, JAM-B y DLL1) (MUC-4 e ICAM-1 muestran comportamientos híbridos). Cada una de estas clases de interfaz synCAM es distinta de la simple interacción de conexión.

Tanto una fuerte interacción de unión de ECD como un fuerte acoplamiento de ICD con el citoesqueleto podrían contribuir a la formación estrecha de la interfaz célula-célula. La modularidad de synCAM permite la investigación de las contribuciones relativas de ECD y ICD a la fuerza de la interfaz. Usando el ICAM-1 synCAM como un sistema de banco de pruebas, caracterizamos las interfaces célula-célula con una afinidad ECD variada (usando una serie de afinidad de nanocuerpos GFP) o un ICD20 eliminado (Fig. 1f y Datos extendidos Fig. 1). La reducción de la afinidad de ECD de una constante de disociación (Kd) de 0,7 nM a 3 µM (>103 veces) disminuye gradualmente el ángulo de contacto célula-célula resultante, pero incluso el ECD más débil muestra una interfaz significativamente ampliada. Por el contrario, la eliminación del ICD ICAM-1, incluso en presencia de un ECD de alta afinidad, interrumpe la interfaz por completo. Se observó una disminución modesta similar en el ángulo de contacto célula-célula para synCAM con un ICD ITGB1 cuando el ECD Kd varió entre 0,7 nM y 110 nM (datos extendidos, figura 2). Estas observaciones son consistentes con un modelo en el que los cambios citomecánicos mediados por los ICD tienen un papel dominante en la determinación de la fuerza y ​​la morfología de la interfaz23,24.

También caracterizamos cómo la disminución de la afinidad de la interacción ECD afecta el fenotipo de enriquecimiento de la interfaz del synCAM NCAM-1. El receptor de GFP permanece altamente enriquecido en la interfaz incluso cuando la afinidad de ECD varía en un rango de Kd = 0.7 nM a 600 nM (Datos extendidos Fig. 2). Por lo tanto, el fenotipo de interfaz enriquecido también parece estar impulsado en gran medida por la identidad ICD.

El dominio del ICD sobre la afinidad del ECD en la determinación de las propiedades de adhesión se corroboró en ensayos de clasificación de competencia (Datos extendidos Fig. 3). Aquí, las células que expresan dos variantes diferentes de anti-GFP synCAM (ICAM-1 ICD) compiten para clasificarse conjuntamente con las células "cebo" de GFP synCAM. Las células de mayor afinidad clasifican preferentemente con las células cebo en el núcleo del grupo de células. Este ensayo complementario también indica que el ICD determina principalmente las preferencias de adhesión. La expresión de GFP–ICAM-1/anti-GFP–ICAM-1 a niveles más altos también aumentó el ángulo de contacto (Datos extendidos Fig. 4). Por el contrario, la expresión más alta de las ataduras GFP/anti-GFP no cambió el ángulo de contacto.

Para examinar las interfaces de synCAM con más detalle, utilizamos un ensayo más controlado en el que una célula L929 que expresa un synCAM anti-GFP interactúa con una superficie recubierta de GFP (Fig. 2 y Extended Data Fig. 5a). Aquí, debido a que la superficie GFP está inmóvil y no puede reorganizarse, las células synCAM que interactúan se propagan en la superficie. Después de 75 min, las células se fijaron y tiñeron con faloidina para observar el citoesqueleto de actina. Una simple interacción anti-GFP-tether produjo una propagación celular mínima en la superficie de GFP (Fig. 2a). Sin embargo, las synCAM mostraron una vez más dos modos distintos de propagación. Las células que expresan synCAM con ICD de ICAM-1, ITGB1, ITGB2 y ECAD se expandieron uniformemente en la superficie de GFP, desarrollando una densa banda de actina cortical a lo largo de la periferia celular (Fig. 2b). Los estudios cinéticos muestran que esta mayor propagación tiene una fase lenta de decenas de minutos a horas, de acuerdo con un requisito para la remodelación del citoesqueleto (Datos extendidos Fig. 5b-e). Estas synCAM generan una propagación "expansiva" uniforme a lo largo de toda la periferia de la célula. Por el contrario, las synCAM con los ICD MUC-4, NCAM-1 y JAM-B produjeron una morfología de "huevo frito": una masa celular central más pequeña estaba rodeada por protuberancias de membrana delgada en la periferia (Fig. 2c). En estos casos, las estructuras de actina lamellipodial y/o filopodial mediaron la propagación radialmente "protrusiva". En general, estos estudios de extensión de superficie son consistentes con nuestros estudios previos de interfaz célula-célula, ya que las synCAM de expansión expansiva también conducen a interfaces célula-célula más grandes y mayores ángulos de contacto, mientras que las synCAM de propagación protrusiva formaron interfaces pequeñas pero altamente enriquecidas.

a–c, Imágenes representativas teñidas con faloidina de células L929 que expresan las synCAM indicadas que se propagan en una superficie recubierta de GFP. Barras de escala, 10 µm. t = 2 h. La actina (tinción de faloidina) se muestra en verde; la huella completa de la célula (etiqueta de la membrana) se muestra en púrpura. Todas las imágenes se muestran a la misma escala. a, La célula L929 que expresa anti-GFP-tether (sin ICD) muestra una propagación mínima. b, las células L929 que expresan synCAM con ICD de ECAD, ICAM-1, ITGB1 e ITGB2 muestran un fenotipo de expansión expansiva: la célula se propaga de manera circular con actina cortical en la periferia de la huella celular. Consulte los ensayos cinéticos de propagación en Datos ampliados, Fig. 5. c, las células L929 que expresan synCAM con ICD de NCAM-1, JAM-B y MUC-4 muestran un fenotipo de propagación protrusivo (una forma de "huevo frito"): la actina cortical no se extienden muy lejos, pero la huella de la membrana celular se extiende en una capa muy delgada más allá de la célula, a menudo con menos circularidad (es decir, de naturaleza más filopodial o lamelopodial). d, la huella completa de la celda (azul) y el área de la celda (gris) para la propagación celular mediada por synCAM. Para los diagramas de caja, la línea central muestra la mediana, los límites de la caja muestran los percentiles 25 a 75 y los bigotes muestran los valores mínimo a máximo. Área de celda: n = 23 (tether), n = 17 (ECAD), n = 23 (JAM-B), n = 16 (ICAM-1), n ​​= 16 (ITGB1), n ​​= 18 (ITGB2), n = 14 (NCAM-1), n ​​= 12 (MUC-4). Huella de celda: n = 22 (anclaje), n = 21 (ECAD), n = 19 (JAM-B), n = 23 (ICAM-1), n ​​= 16 (ITGB1), n ​​= 12 (ITGB2), n = 14 (NCAM-1), n ​​= 15 (MUC-4). e, interacciones de reclutamiento conocidas de proteínas intracelulares aguas abajo que se encuentran en los ICD de CAM. Consulte el análisis mutacional de los motivos de unión de ICD en Datos ampliados Fig.6.

Datos fuente

Investigamos cómo la propagación celular impulsada por synCAM fue alterada por una serie de inhibidores de moléculas pequeñas de distintos reguladores de actina (Datos extendidos Fig. 6a). Todas las células que expresan synCAM mostraron una propagación mínima en presencia de latrunculina B, que interrumpe la formación de filamentos de actina, lo que confirma la importancia de la actividad del citoesqueleto en todos los modos de propagación celular. Por el contrario, la inhibición de la contractilidad con blebbistatina (pero aún permitiendo la polimerización de actina) permitió que las células synCAM se propagaran, pero sin un ensamblaje controlado de actina en estructuras distintas únicas para las diferentes synCAM. Este resultado enfatiza la competencia entre la expansión y la contractilidad cortical a medida que una célula extiende una nueva interfaz24,26. Para las synCAM de propagación protrusiva (por ejemplo, JAM-B ICD), las láminas lamelipodiales que normalmente se ven en la periferia de la célula son interrumpidas por CK666, lo que indica un papel de su objetivo, el complejo ARP2/3, en la formación de estos protrusivos delgados. estructuras

Las distintas morfologías de interfaz observadas aquí pueden explicarse por los mecanismos postulados de los ICD CAM (Fig. 2e). Aunque difieren individualmente en los detalles, los ICD expansivos (ECAD, ICAM-1, integrinas) reclutan moléculas adaptadoras como β-catenina, talina, vinculina y proteínas ERM, que se cree que se acoplan al citoesqueleto de actina cortical y, por lo tanto, impulsan la expansión del todo el frente celular12,13,27. Por el contrario, los ICD protrusivos (NCAM-1, JAM-B, DLL1) interactúan con las proteínas de andamiaje PDZ o las balsas lipídicas, generalmente formando complejos organizados que implican agrupamiento o condensación de fase28,29,30,31. Los ensamblajes espacialmente enfocados resultantes pueden impulsar respuestas citoesqueléticas protrusivas, como la formación de filopodios y lamelipodios, al reclutar y activar proteínas como N-WASP y ARP2/3. La importancia de estos dominios de interacción ICD en la formación de la interfaz se confirmó mediante el análisis mutacional de motivos de señalización clave (Datos extendidos Fig. 6b-h).

Muchas CAM endógenas se unen de forma homofílica (por ejemplo, ECAD y JAM-B), lo que produce una interfaz con ICD simétricos. Sin embargo, muchas otras CAM endógenas participan en interacciones heterófilas (por ejemplo, ITGB1, ITGB2 e ICAM-1), lo que lleva a interfaces célula-célula con diferentes ICD opuestos. Por lo tanto, utilizamos la plataforma synCAM para investigar cómo los ICD simétricos versus asimétricos afectan la morfología de la interfaz célula-célula. Examinamos todos los pares posibles de diferentes synCAM GFP-anti-GFP en fibroblastos L929 (Fig. 3 y Datos extendidos Fig. 7).

a, Proyección máxima de ×20 imágenes de microscopía confocal de interfaces synCAM por pares (t = 3 h), mostrando ECAD ICD simétrico (izquierda), ECAD asimétrico e interfaces de sujeción (∆ICD) (centro) y ECAD asimétrico balanceado e ICAM-1 interfaces (derecha). Barras de escala, 10 µm. Se muestran los canales mCherry y BFP (arriba) y los canales GFP (abajo) de imágenes representativas de diez pares en tres réplicas independientes. b, Cuantificación del ángulo de contacto (arriba) y enriquecimiento de GFP (abajo) para interfaces synCAM asimétricas por pares. n = 10. La combinación de interfases que presenta el mayor ángulo de contacto o enriquecimiento se destaca en rojo. c, Ejemplo de imágenes de microscopía confocal ×20 de interfaces asimétricas desequilibradas por pares en las que una synCAM protrusiva se une a una synCAM expansiva. t = 3 h. Barras de escala, 10 µm. Se muestran imágenes representativas de diez pares en tres réplicas independientes. Arriba, unión entre una synCAM anti-GFP protrusiva y una synCAM GFP expansiva. Abajo, unión entre una synCAM GFP protrusiva y una synCAM anti-GFP expansiva.

Datos fuente

Las interfaces asimétricas con un ICD (anclaje) completamente eliminado en un lado de la interfaz exhiben interfaces significativamente interrumpidas: muestran una expansión mínima de la interfaz célula-célula y un aumento del ángulo de contacto (Fig. 3a,b). Sin embargo, se puede formar una gran interfaz asimétrica si empareja dos synCAM expansivas (por ejemplo, ECAD-ICAM-1 o ECAD-ITGB2) (Fig. 3a,b). Estos hallazgos sugieren que se pueden formar interfaces grandes y expandidas con synCAM asimétricas si los ICD opuestos producen una interacción equilibrada. De manera análoga, las interfaces asimétricas que emparejan dos ICD que median el enriquecimiento de GFP (por ejemplo, NCAM-1–MUC-4, NCAM-1–JAM-B) generan un fenotipo de enriquecimiento de interfaz que es similar al de las interfaces simétricas (Fig. 3a, b). Por lo tanto, para formar una interfaz productiva, la secuencia exacta de un ICD opuesto es menos crítica que la presencia de ICD con la misma fuerza y ​​morfología.

En particular, cuando creamos interfaces heterotípicas en las que una célula con una synCAM protrusiva se une a una célula con una synCAM expansiva, las células interactuaron con una morfología consistente: formaron una interfaz asimétrica en la que la célula synCAM protrusiva se envuelve alrededor de la célula synCAM expansiva ( Figura 3c). Estos resultados muestran la diversidad de interfaces que se pueden construir con combinaciones synCAM.

Programar la formación de nuevos tejidos multicelulares de novo requiere dictar una conectividad celular específica dentro de un sistema multicelular5,32,33. Los esfuerzos anteriores para controlar ortogonalmente el ensamblaje multicelular, tanto en bacterias como en sistemas de mamíferos, generalmente han utilizado enfoques de anclaje a la superficie5,32,33,34,35. En particular, investigaciones recientes han permitido la creación de patrones personalizados de bacterias modificadas a través de la expresión superficial de pares ortogonales nanocuerpo-antígeno33. Dada la capacidad de las synCAM para dirigir la morfología celular y la estructura del citoesqueleto, probamos si las synCAM podrían diseñarse con una amplia gama de ECD ortogonales para programar racionalmente la conectividad espacial específica. Descubrimos que las synCAM funcionales podrían construirse con múltiples pares de unión de anticuerpo-antígeno distintos, incluido HA-tag-anti-HA fragmento variable de cadena única (scFv); nanocuerpo anti-MBP de proteína de unión a maltosa (MBP); antígeno de superficie de células B CD19-anti-CD19 scFv; nanocuerpo anti-MET de tirosina-proteína quinasa MET; nanocuerpo mCherry-anti-mCherry; y nanocuerpo anti-EGFR del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (Fig. 4a y Video complementario 1). La ortogonalidad de distintas synCAM de ECD se confirmó mediante ensayos de clasificación conjunta, y cuantificamos su eficiencia al excluir las células WT L929 del ensamblaje multicelular (Datos extendidos Fig. 8).

a, synCAM heterofílicas con dominios de reconocimiento extracelulares ortogonales. Se muestra la proyección máxima de ×20 imágenes de la interfaz célula-célula de microscopía confocal de células L929 que expresan synCAM con los ECD del par anticuerpo-antígeno indicado y ICAM-1 (arriba) o ITGB1 (abajo) TM/ICD. Barras de escala, 10 µm. t = 3 h. Se muestran imágenes representativas de cuatro réplicas independientes. La prueba experimental de la clasificación ortogonal se muestra en Datos extendidos, Fig. 8. Consulte el Video complementario 1 para ver un análisis de lapso de tiempo de la formación del ensamblaje ortogonal. b, Ingeniería de ensamblajes heterotípicos personalizados. Proyección máxima de imágenes de microscopía confocal ×20 de células L929 que expresan synCAM con los socios de reconocimiento ECD indicados. t = 2 h. Los ensamblajes forman patrones alternos (izquierda), puente (centro) y cíclicos (derecha). Se muestran imágenes de ejemplo de interacciones cíclicas aisladas. t = 2 h. En el video complementario 2 se muestra un análisis de lapso de tiempo. A continuación se muestran los cuadros de probabilidad de distribución de contacto celular. n = 5. Barras de escala, 50 µm (3 imágenes a la izquierda) y 10 µm (insertos). c, diseño synCAM con un ECD con cremallera de leucina de unión homofílica (arriba). Abajo, proyección máxima de imágenes de microscopía confocal ×20 de células L929 que expresan synCAM de unión homofílica con el ECD con cremallera de leucina Aph4 o IF1 e ICAM-1 TM/ICD (pozo de fondo redondo ULA, 80 células en total). Barras de escala, 50 µm. t = 24 h. Se muestran imágenes representativas de tres réplicas independientes. d, ×20 imágenes de microscopía confocal de clasificación diferencial entre células L929 que expresan WT ECAD o las synCAM de unión homofílica indicadas. Barras de escala, 20 µm. t = 48 h. Las imágenes representativas se muestran con réplicas independientes adicionales en Datos extendidos Fig. 9. n = 15 (ECAD–IF1), n ​​= 15 (ECAD–Aph4), n = 14 (IF1–Aph4) y n = 18 (ECAD–IF1– Aph4). e, Esquema del diseño del receptor y ensayo de clasificación diferencial de células L929 que expresan WT PCAD (naranja) y un synCAM anti-PCAD (anti-PCAD, azul) (izquierda). El synCAM anti-PCAD contiene un ICAM-1 TM/ICD. Derecha, imágenes de proyección máxima del ensayo de clasificación en el que las células L929 que expresan WT PCAD (naranja) se mezclaron con células L929 parentales (arriba) o synCAM (abajo) (azul). Barras de escala, 50 µm. t = 0 h y 24 h. Se muestran imágenes representativas de cuatro réplicas independientes con réplicas adicionales que se muestran en Datos extendidos Fig. 10.

Datos fuente

Probamos si este conjunto de synCAM heterotípicos ortogonales podría programar patrones de unión celular altamente específicos. (Fig. 4b y Video complementario 2). Construimos ensamblajes con los siguientes patrones: (1) interacciones heterófilas alternas de dos células (A↔B) (expresión de un par heterófilo GFP-anti-GFP synCAM en las células A y B); (2) interacciones puente de tres células (A↔B↔C) (expresión de synCAM ortogonales en las células A y C, y ambas synCAM complementarias en la célula puente B); (3) interacciones cíclicas de tres celdas (A↔B↔C↔A) (expresión de dos synCAM ortogonales en cada una de las celdas A, B y C). Los ensamblajes resultantes se organizan según lo dictan las conectividades célula-célula definidas por synCAM. El análisis de distribución del vecino más cercano (usando el software de análisis de imágenes Harmony) mostró que las interacciones especificadas por synCAM dominan el ensamblaje (Fig. 4b). En imágenes ampliadas con un bajo número de celdas, el conjunto de interacción cíclica puede conducir a los ensamblajes multicelulares mínimos de 3 y 4 predichos (Fig. 4b). Por lo tanto, las combinaciones de synCAM pueden especificar las conectividades de unión precisas entre las células.

A continuación, diseñamos synCAM homotípicos a partir de interacciones ECD de bobina en espiral autodimerizante. Utilizamos las cremalleras de leucina Aph4 (una cremallera de leucina diseñada computacionalmente36) y las cremalleras de leucina IF1 (inhibidor de la ATPasa bovina IF1), ya que anticipamos que sus topologías de unión antiparalela podrían favorecer estéricamente las interacciones intercelulares transcelulares sobre la unión intracelular cis36,37. También agregamos un dominio fibcon intermedio (un dominio FN3 de consenso de fibronectina) adyacente a los dominios de bobina enrollada para proporcionar una separación adicional de la región yuxtamembrana, lo que podría favorecer aún más las interacciones transcelulares38 (Fig. 4c).

Probamos si las células que expresan synCAMs homófilas ortogonales podrían generar de manera predecible estructuras con compartimentos segregados. Las células que expresan tres CAM homotípicas ortogonales diferentes (WT ECAD, Aph4-ICAM-1 o IF1-ICAM-1) se mezclaron en combinaciones (Fig. 4d) y se clasificaron sobre la base de las estructuras de ensamblaje resultantes. Las poblaciones de células individuales muestran una clasificación clara a través de sus synCAM homófilas, pero lo más llamativo son los comportamientos de clasificación altamente modulares que resultan. Cuando los tipos de células se mezclaron por pares, observamos que las células IF1 se clasifican en el centro frente a ECAD o Aph4. Las células ECAD y Aph4 se clasifican en una estructura de barra de dos lóbulos. Estas relaciones se mantienen cuando se mezclan los tres tipos de celdas, lo que produce una estructura con un conjunto de celdas de barra ECAD-Aph4 con celdas IF1 en el núcleo (Datos extendidos, Fig. 9 para estadísticas de ensamblaje). Estos resultados muestran cómo un conjunto de herramientas de synCAM ortogonales puede construir estructuras autoorganizadas de múltiples compartimentos con modularidad y previsibilidad.

Probamos si synCAMs podría interactuar directamente con un tejido unido por moléculas de adhesión nativas como P-cadherina (PCAD). Por lo tanto, diseñamos un synCAM con un scFv anti-PCAD fusionado con el ICD ICAM-1 (Fig. 4e, Datos extendidos Fig. 10 y Video complementario 3). Estas células dirigidas a PCAD sintéticas podrían intercalarse de manera efectiva en un esferoide celular unido por PCAD. Por el contrario, las células que carecían de synCAM se excluyeron y clasificaron en el exterior de la estructura. Por lo tanto, las synCAM pueden integrar células en ensamblajes formados por moléculas de adhesión nativas.

Probamos si las moléculas de adhesión sintéticas podían funcionar en células primarias y en células derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPS). GFP/anti-GFP-ICAM-1 synCAMs y GFP/anti-GFP-tether moléculas se expresaron en varias células primarias o derivadas de células iPS (Datos extendidos Fig. 11). Cuando las synCAM basadas en ICAM-1 se expresan en fibroblastos dérmicos humanos primarios, células del estroma mesenquimatoso humano y células de músculo liso derivadas de células iPS, observamos una fuerte localización de las synCAM etiquetadas con GFP en la interfaz formada con células asociadas que expresan un anti funcional afín. -GFP synCAM. Esta relocalización de synCAM a la interfaz célula-célula heterotípica no se observó en células no unidas (GFP synCAM permanece distribuida en toda la célula, no solo en la interfaz) o cuando se co-cultivó con células asociadas que contenían solo una atadura anti-GFP (sin ICD). ). Estos resultados demuestran que las synCAM se involucran funcionalmente entre sí en estos diferentes tipos de células de una manera que depende de los ECD afines y la presencia de ICD funcionalmente coincidentes.

Examinamos si la adhesión sintética podría remodelar y reconfigurar tejidos multicelulares organizados por CAM nativos. Por ejemplo, las células L929 que expresan WT ECAD y WT PCAD se clasifican de manera diferencial entre sí en un conjunto bilobulado6. Examinamos si la introducción de una interacción GFP-anti-GFP synCAM podría obligar a estas dos poblaciones segregantes a integrarse (Fig. 5a). La expresión de una molécula de unión heterotípica convirtió el ensamblaje bilobulado en una estructura de dos capas (capa central), que mantiene la segregación, pero aumenta ligeramente el número de contactos heterófilos en relación con el ensamblaje bilobulado. Por el contrario, la expresión de las synCAM más fuertes (ICAM-1 o ECAD ICD) convirtió la estructura bilobulada en una estructura integrada, con los dos tipos de células en un único compartimento mixto. Estos synCAM también podrían forzar la integración de poblaciones de células L929 ordenadas diferencialmente que expresan WT PCAD o WT NCAD (datos extendidos Fig. 12a, b). Por lo tanto, las synCAM se pueden usar para remodelar sistemáticamente ensamblajes multicelulares.

a, Esquema del experimento usando synCAMs para forzar la integración de poblaciones L929 de clasificación diferencial. Comenzamos con poblaciones L929 que expresan WT ECAD (azul) o WT PCAD (naranja), lo que conduce a la segregación en una estructura binodal. La imagen muestra cómo la clasificación se altera por la expresión de la integración de synCAM heterófilo con interacciones de diferentes fuerzas (frente al receptor de sujeción). Se muestran proyecciones máximas de ×20 imágenes de microscopía confocal. Barras de escala, 20 µm. t = 24 h. Vea el Video complementario 3 para un análisis de lapso de tiempo. Una demostración similar de la integración de synCAM de poblaciones de células segregadas por PCAD/NCAD se muestra en Datos extendidos Fig. 7. b, células L929 que expresan WT PCAD (naranja) mezcladas con una monocapa MDCK (azul) forman esferoides que se asientan pasivamente sobre el epitelio MCDK capa. Agregar synCAMs GFP-anti-GFP con interacciones de fuerza creciente (frente al receptor de sujeción) conduce a un aumento del acoplamiento mecánico entre los tejidos epiteliales y esferoides. Cuando son lo suficientemente fuertes, los dos tipos de células forman una red compleja similar a un entramado (ICAM synCAM). Las imágenes muestran el montaje en t = 24 h. Se muestran vistas ampliadas en 3D (arriba) y con proyección máxima alejada (abajo). Barras de escala, 100 µm (arriba) y 1 mm (abajo). Consulte el vídeo complementario 4 para ver un análisis de lapso de tiempo de la evolución del tejido acoplado.

Para examinar más a fondo la remodelación de tejidos, probamos si las synCAM podrían alterar las monocapas epiteliales, un bloque de construcción fundamental para diversos tejidos y órganos. Por ejemplo, la modulación de la estructura epitelial por interacciones con células mesenquimales es un tema común en el desarrollo. Utilizamos células de riñón canino Madin-Darby (MDCK) como capa de células epiteliales iniciales. Cuando se agrega una población de células L929 que expresan PCAD, forman grupos de esferoides homotípicos segregados que se asientan sobre la capa epitelial confluente de MDCK. Los tejidos epiteliales iniciales (MDCK) y esferoides (PCAD-L929) muestran interacciones mínimas, funcionando como ensamblajes independientes (Fig. 5b).

Examinamos si la introducción de interacciones de adhesión sintética puente (utilizando ECD GFP-anti-GFP con ICD simétricos) podría obligar a los distintos tejidos epiteliales y esferoides a interactuar. Cuando se agrega una interacción de sujeción mínima (sin ICD), las células PCAD-L929 se asientan firmemente en la capa epitelial de MDCK, pero aún actúan de manera independiente, manteniendo su estructura esferoide segregada. Sin embargo, la introducción de un synCAM ECAD más fuerte da como resultado que los esferoides de PCAD-L929 se extiendan en protuberancias más planas en forma de áster que contactan más ampliamente con la capa epitelial. Finalmente, agregar la interacción de puente ICAM-1 synCAM aún más fuerte provoca una reorganización cooperativa sustancial de ambos tejidos (Fig. 5b, datos extendidos, Fig. 12c y video complementario 4). En este caso, las celdas L929 se organizan en una red de celosía continua sobre las celdas MDCK. Además, la capa epitelial de MDCK muestra una confluencia reducida, quizás porque la fuerte interacción de puente entre las células L929 y MDCK parece extraer las células MDCK de la superficie en los espacios intermedios de la red. Presumimos que este tejido cooperativo emerge de las fuerzas opuestas de los dos tejidos. La fuerte atracción homotípica (PCAD) entre las células L929 combinada con la fuerte interacción de puente sintético (synCAM) entre las células L929 y las células MDCK da como resultado que estas dos poblaciones adopten un estado mecánicamente equilibrado. La red resultante recuerda a la red de tubos capilares autoorganizados de células endoteliales activadas. En resumen, esta configuración de red parece proporcionar una solución que permite que las células L929 mantengan simultáneamente un alto grado de interacción homotípica, junto con un alto grado de interacción heterotípica con la capa epitelial de MDCK. Se observó una estructura de red reticular emergente similar en un experimento análogo en células primarias (capa epitelial intestinal primaria de ratón más fibroblastos embrionarios de ratón; datos ampliados, Fig. 12d). En resumen, las synCAM pueden acoplar sistemáticamente poblaciones de células independientes para producir sistemas multicelulares cuya mecánica cooperativa produce estructuras tisulares complejas.

Aquí revelamos el potencial para la ingeniería de diversas moléculas de adhesión sintéticas que comparten los principios de diseño de las moléculas de adhesión nativas, pero que especifican conectividades nuevas y ortogonales entre las células. Aunque los metazoos despliegan una plétora de CAM para mediar en diversas interacciones celulares y el ensamblaje de tejidos, es probable que la evolución siga sin explotar muchas más interfaces. La estrategia de diseño synCAM utilizada aquí integra dos mecanismos para controlar la adhesión sintética. En primer lugar, el dominio de interacción extracelular especifica la conectividad (unión) célula-célula, que puede ser homófila o heterófila con una afinidad controlada con precisión. En segundo lugar, el dominio intracelular dicta la reorganización del citoesqueleto y determina en gran medida la mecánica y la morfología de la interfaz. La ortogonalidad y la capacidad de ajuste del reconocimiento del dominio extracelular junto con la modularidad de la salida del dominio intracelular amplía el posible conjunto de interfaces que se pueden generar. Por lo tanto, este conjunto de herramientas puede alterar tanto la conectividad célula-célula como el tipo de interfaz resultante. Además, la combinación de varias synCAM y CAM nativas para crear un sistema de células acopladas mecánicamente puede generar tejidos con estructuras emergentes complejas.

El amplio espectro de ICD de adhesión susceptibles de ingeniería quimérica demuestra que la función del dominio intracelular es, hasta cierto punto, independiente del mecanismo de reconocimiento extracelular endógeno. En particular, las interacciones extracelulares simples utilizadas aquí no coinciden con la mayor sofisticación regulatoria de muchos ECD naturales, que también pueden mostrar oligomerización en cis, unión por captura y cambios alostéricos8,39,40,41,42. No obstante, las synCAM siguen siendo suficientes para ensamblar interfaces similares de célula a célula. La modularidad de las CAM proporciona información sobre cuántas CAM naturales pueden haber evolucionado. Por ejemplo, las proteínas con ECD de cadherina se encuentran en los coanoflagelados (los parientes unicelulares más cercanos a los metazoos), pero carecen de los ECD de metazoos43,44. Estas proteínas pueden haber sido utilizadas por los coanoflagelados para unirse a alimentos o sustratos en lugar de para la adhesión célula-célula, y luego cooptadas para la adhesión célula-célula a través de la recombinación con dominios de señalización intracelular43.

Este estudio respalda un papel dominante del dominio intracelular al dictar el carácter de las interfaces célula-célula mediadas por CAM. Las interacciones de anclaje entre células que no interactúan con el citoesqueleto no pueden generar interfaces fuertes y extensas, sin importar cuál sea la afinidad de unión extracelular. Por el contrario, las synCAM que consisten en ICD que interactúan con el citoesqueleto facilitan una morfología más compleja que depende de la identidad del ICD en cada lado de la interfaz. Estas observaciones son consistentes con estudios previos que sugieren que los ICD de cadherina remodelan la tensión de la corteza para impulsar la expansión de la interfaz celular y la resistencia a la separación celular23,24,45,46,47,48.

Finalmente, mostramos que las synCAM proporcionan un conjunto de herramientas versátil para programar estructuras multicelulares, ya sea de novo o intercalando o remodelando tejidos formados por CAM nativas. El conjunto de herramientas de synCAMs también permite la perturbación sistemática de los sistemas de autoorganización que podrían usarse para analizar el mecanismo de diversos procesos de desarrollo. En el futuro, estos tipos de moléculas de adhesión diseñadas podrían aplicarse potencialmente para abordar problemas terapéuticos, como dirigir con precisión la reparación y regeneración de tejidos o controlar las interacciones y el tráfico de células inmunes y neurales.

Los oligonucleótidos se adquirieron de Integrated DNA Technologies. El reactivo de clonación In-Fusion, CloneAmp HiFi PCR Premix, el kit concentrador Lenti-X y las células químicamente competentes Stellar se adquirieron en Takara Bio. Los kits de minipreparación y las columnas giratorias se adquirieron de Qiagen. El reactivo de transfección FuGENE HD se adquirió de Promega. DMEM, GlutaMAX, Alexa Fluor 647 Phalloidin (A22287) y Alexa Fluor 555 Phalloidin (A34055) se adquirieron de Thermo Fisher Scientific. El suero bovino fetal (FBS) se adquirió de la instalación de cultivo celular de la Universidad de California, San Francisco (UCSF). Se adquirieron células de fibroblastos de ratón L929 (ATCC, CCL-1) de la American Type Culture Collection. Las células MDCK fueron un regalo del laboratorio Mostov de la UCSF. Las células primarias de fibroblastos dérmicos (CC-2511), los fibroblastos embrionarios de ratón (M-FB-481) y las células madre mesenquimales derivadas de médula ósea humana (PT-2501) se adquirieron de Lonza Bioscience. Las placas de múltiples pocillos de fondo redondo tratadas con unión ultrabaja de 384 pocillos Nexcelom 3D se adquirieron de Nexcelom Bioscience. Las placas de fondo plano Cellstar Cell-Repellent Surface de 384 pocillos se adquirieron de Greiner Bio-One. Las placas tratadas con TC de fondo transparente plano de formación de imágenes ópticas de 384 pocillos se adquirieron de Corning. Las células madre pluripotentes humanas H9 (hPSC) (WA09) se adquirieron de WiCell. EDTA (46-034-CI) y Matrigel reducido en factor de crecimiento (356231) se adquirieron de Corning (Corning). Geltrex, calificado para hESC (A1413302), Essential 8 Flex Medium Kit (A2858501), Essential 6 Flex Medium Kit (A1516401) y Advanced DMEM/F12 (12634028) se adquirieron de Thermo Fisher Scientific. La proteína de activina A humana/ratón/rata recombinante (338-AC-050) se adquirió de R&D Systems. FBS para células iPS (1701) se adquirió de ScienCell. El tinte de membrana plasmática rojo intenso CellMask se adquirió de Invitrogen. El reactivo Phalloidin-iFluor 405 (ab176752) se adquirió de Abcam.

Los siguientes anticuerpos se compraron y diluyeron en PBS antes de su uso según el protocolo del fabricante: anticuerpos conjugados con etiqueta de epítopo DYKDDDDK Alexa Fluor 647 (1042E, conejo, R&D Systems, IC8529R, AEOB0118081, 1:100); Anticuerpos conjugados con etiqueta de epítopo DYKDDDDK Alexa Fluor 488 (1042E, conejo, R&D Systems, IC8529G, AEOA0521031, 1:100); anticuerpos monoclonales de ratón anti-MYC-tag (9B11) (conjugado AlexaFluor 647) (Cell Signaling Technology, 2233, 25, 1:100); anticuerpos monoclonales de ratón anti-HA-tag (6E2) (conjugado AlexaFluor 647) (Cell Signaling Technology, 3444, 15, 1:100); anticuerpos antihumanos conjugados con HGFR/c-MET (95106) AlexaFluor 488 (R&D Systems, FAB3582G, 1:50); anticuerpos anti-EGFR (DH8.3) (AlexaFluor 647) (Novusbio, 50599AF647, 1:50); y anticuerpos anti-6xHis tag (HIS.H8) (Abcam, ab18184, 1:100).

La clasificación celular y la citometría de flujo se realizaron utilizando el clasificador de células FACSAria II o el citómetro de flujo LSR II (Beckton-Dickinson). La microscopía confocal se realizó utilizando el microscopio confocal de disco giratorio automatizado Opera Phenix con un objetivo de inmersión en agua de ×20 en placas de 384 pocillos; la Nikon TiE con unidad confocal de disco giratorio CSU-X1 con objetivos de inmersión en aceite de ×60 y ×100; o el Zeiss LSM 980 con Airyscan 2 con un objetivo de inmersión en agua ×40.

Todas las construcciones se clonaron en un vector pHR que contenía el promotor SFFV, la secuencia consenso de Kozak y una secuencia señal escindible de hemaglutinina de influenza (MKTIIALSYIFCLVFA)50.

Para diseñar las construcciones synCAM, se identificaron regiones transmembrana e intracelulares de moléculas de adhesión celular a partir de anotaciones topológicas en UniProt51. Los genes con codones optimizados que codifican cada región CAM ICD y TM se adquirieron de Integrated DNA Technologies y se insertaron en el vector utilizando la clonación In-Fusion. Cada región CAM TM e ICD se fusionó con un dominio de unión extracelular (por ejemplo, GFP, anti-GFP) utilizando la clonación In-Fusion (Tabla complementaria 2). Las secuencias para todos los ECD de nanocuerpos o scFv se obtuvieron de trabajos informados anteriormente o de patentes disponibles públicamente20,52,53,54,55,56. Para los experimentos que involucran células epiteliales intestinales, se clonaron un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) y un gen de puromicina-N-acetiltransferasa (Puro) aguas abajo de las construcciones GFP-ICAM-1 y GFP-tether dentro del vector pHR. RF Biotech verificó la secuencia de los plásmidos.

El lentivirus se generó mediante la cotransfección de vectores que codifican proteínas de empaquetamiento (pMD2.G y p8.91) con el plásmido pHR de interés utilizando el reactivo de transfección Fugene 6 HD (según el protocolo del fabricante) en células HEK293T sembradas en placas de 6 pocillos a aproximadamente 70ºC. % de confluencia. Dos días después de la transfección, se recolectaron los sobrenadantes virales, se pasaron a través de un filtro de 0,45 mm y se usaron inmediatamente para la transducción.

Para la transducción de células primarias, el lentivirus se concentró 20 veces usando el kit Lenti-X Concentrator (Takara) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Se cultivaron células L929 y MDCK en DMEM que contenía FBS al 10%. Para generar líneas celulares estables, el sobrenadante viral (50–400 µl) se diluyó con 1,5 ml de medio y se sembró directamente con células (1 × 105 L929 o MDCK) en placas de 12 pocillos. Luego, 24 h después de la infección, el medio viral se reemplazó con medio de crecimiento normal y las células se expandieron en un matraz T25. Las células se tiñeron para la etiqueta de epítopo apropiada utilizando un anticuerpo marcado con fluorescencia y se clasificaron para la expresión mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). A menos que se indique lo contrario, se utilizó una población clasificada en masa para cada experimento. Para generar las líneas celulares GFP-ICAM-1 y GFP-tether L929 con niveles de expresión ajustados, el virus total agregado a las células se tituló entre 50 y 400 µl, y las células se clasificaron para diferentes niveles de expresión de synCAM usando FACS. Para las synCAM Aph4 e IF1, se establecieron poblaciones de células individuales clasificando las células individuales en una placa de 96 pocillos.

Para confirmar el nivel de expresión de synCAMs en cada línea celular, las células se analizaron usando FACS. Las células se separaron con TrypLE y se transfirieron a una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Las células se sedimentaron mediante centrifugación (durante 4 min a 400 g), se eliminó el sobrenadante y las células se resuspendieron en 40 μl de PBS que contenía un anticuerpo conjugado con colorante fluorescente. Las células se tiñeron durante 50 min a 4 °C. A continuación, las células se lavaron dos veces con PBS y se resuspendieron en PBS con FBS al 5 %. A continuación, las células se analizaron mediante citometría de flujo (BD LSR II, BD FACSDiva). Luego, los datos de citometría de flujo se analizaron utilizando FlowJo (TreeStar).

Antes de llevar a cabo el experimento, todas las líneas celulares se separaron con TrypLE, se resuspendieron en 1 ml de DMEM, se contaron y luego se diluyeron a 4 × 105 células por ml. Las células L929 que expresan de forma estable BFP citosólica y una sinCAM GFP se mezclaron 1:1 con células L929 que expresan mCherry citosólica y una sinCAM anti-GFP en una placa de fondo plano de 384 pocillos con una superficie repelente de células (3,2 × 104 células, 80 µl volumen total, 37 °C). En t = 3 h, se tomaron imágenes de las placas con un aumento de × 20 utilizando microscopía confocal de fluorescencia (Phenix). Las imágenes de máxima proyección se exportaron desde el software del fabricante (Harmony). Se identificaron distintos pares de células de tamaño similar y se midieron los ángulos de contacto en ImageJ. El porcentaje de enriquecimiento de GFP se determinó en ImageJ midiendo la señal de GFP localizada en la interfaz célula-célula como una fracción de la presente en toda la célula. El análisis de datos para el ángulo de contacto medido y los valores de enriquecimiento se realizó en Prism 9 (GraphPad).

Caracterizamos la tasa, el tamaño de la interfaz y la morfología de la propagación de células synCAM en una superficie recubierta de GFP. La proteína GFP purificada se diluyó hasta una concentración final de 0,5 µM en PBS y se aplicó un volumen suficiente (~100 µl) para cubrir la superficie inferior de una cámara de formación de imágenes con fondo de vidrio de 8 pocillos. Esta solución se incubó durante 10 min en hielo. Se eliminó el exceso de solución y se enjuagó la cámara con PBS. A continuación, la cámara se bloqueó con una solución de 10 mg ml−1 de albúmina de suero bovino (BSA) y 1 mg ml−1 de beta caseína (Sigma-Aldrich) durante un mínimo de 1 h en hielo. Se eliminó la solución de bloqueo y se lavó la cámara tres veces con PBS. Al usar cámaras CellVis (C8-1.5HN), se usaron un anticuerpo anti-6x-His (ab18184) y GFP marcado con 6x-His (ab134853) para obtener una cobertura completa de la superficie con GFP. Se incubó una dilución de 100X de anticuerpo en PBS en la superficie de la cámara durante 1 hora a 4 °C. Después de lavar tres veces con PBS, se incubó en la superficie una solución de 10 µg ml−1 que contenía GFP marcada con His durante 1 hora a 4 °C. A continuación, la cámara se bloqueó con una solución de 10 mg ml-1 de BSA y 1 mg ml-1 de beta caseína (Sigma-Aldrich) durante un mínimo de 1 h en hielo. Se eliminó la solución de bloqueo y se lavó la cámara tres veces con PBS.

Para preparar las células para el ensayo de propagación, se separaron las células L929 usando EDTA de tripsina y se resuspendieron en medio de cultivo celular. Se añadieron alrededor de 50 µl de solución celular resuspendida de un matraz T25 confluente a 200 µl de medio de cultivo celular y se colocaron en la cámara de formación de imágenes. A continuación, la cámara se transfirió a un microscopio confocal de disco giratorio equipado con una platina de control ambiental de Oko Labs. Se tomaron imágenes de las células con un objetivo de inmersión en aceite de ×60 cada 3 min durante un período de 2 h. Durante los primeros 60 a 90 minutos, se observó la propagación de distintas células en la superficie al monitorear las proteínas fluorescentes citoplasmáticas expresadas en el citoplasma de las células synCAM.

Las imágenes se analizaron binarizando la intensidad para obtener una máscara de la celda, que luego podría usarse para calcular el área de extensión total (A) y el perímetro (p) de la huella. Para caracterizar la morfología de la interfaz, se calculó y comparó la circularidad (c = p2/4πA) entre diferentes synCAM. Estas mediciones también se realizaron utilizando un anticuerpo fluorescente de etiqueta anti-bandera (construcciones synCAM de etiquetas) para medir el área y la morfología directamente en la interfaz con el cubreobjetos. Para comparar diferentes cinéticas de esparcimiento, el cambio en el área a lo largo del tiempo se ajustó con la siguiente forma: A = bt1/4 donde b es el coeficiente de tasa de esparcimiento. Este modelo se utilizó previamente para comparar la cinética de propagación de células en una superficie adhesiva26. El análisis se implementó en MATLAB (2020a).

Para visualizar el citoesqueleto de actina, se fijaron células en expansión y se tiñeron para inmunohistoquímica de acuerdo con procedimientos estándar. Las células se fijaron en PFA al 4 % en tampón de citoesqueleto (PIPES 10 mM, NaCl 100 mM, sacarosa 300 mM, EGTA 1 mM, MgCl2 1 mM) durante 20 min en hielo. A continuación, las células se lavaron tres veces y se permeabilizaron con una solución de Triton X-100 al 0,1 % en PBS durante 10 min en hielo y se lavaron de nuevo tres veces. A continuación, las células se bloquearon con BSA al 10 % en PBS (PBS-BSA) durante un mínimo de 1 hora a 4 °C. Para visualizar el citoesqueleto de actina, las células se tiñeron con faloidina marcada con fluorescencia (conjugada con colorantes fluorescentes Alexa 647, 555 o 405). Luego se tomaron imágenes de las células usando un microscopio confocal de disco giratorio usando un objetivo de aumento de ×100. Las periferias celulares se determinaron mediante tinción con tinción de membrana plasmática de color rojo intenso CellMask (Invitrogen). Para las mediciones que investigan los efectos de los inhibidores del citoesqueleto en la propagación celular, las células se introdujeron en un medio que contenía el inhibidor y se permitieron que se propagaran sobre la superficie recubierta con GFP (CK666 (100 µM), latrunculina B (5 µM), SMIFH2 (100 µM), los inhibidores de blebbistatina (50 µM) se adquirieron de Abcam). Luego, las células se fijaron y tiñeron de acuerdo con el procedimiento anterior antes de obtener imágenes con el microscopio Zeiss 980 Airyscan y un objetivo de inmersión en agua ×40 (Zen Blue).

Antes de llevar a cabo el experimento, todas las líneas celulares se separaron con TrypLE, se resuspendieron en 1 ml de DMEM, se contaron y luego se diluyeron a 1 × 103 células por ml. Las células L929 que expresan de forma estable BFP citosólica y una sinCAM anti-GFP de afinidad variable se mezclaron 1:1:1 con células L929 que expresan mCherry citosólica y una sinCAM anti-GFP de afinidad variable, y células L929 que expresan GFP-ICAM-1 en pocillos distintos de un pocillo de fondo redondo ULA de 384 pocillos (80 µl de volumen total). En t = 24 h, se tomaron imágenes de los pozos con un aumento de × 20 usando microscopía confocal de fluorescencia (Phenix).

Para cuantificar la organización de diferentes células que expresan synCAM en el ensayo de clasificación diferencial multicelular, calculamos la función de distribución radial g (r) de pilas confocales 3D multicanal. Se tomaron imágenes de las células que expresaban mCherry y BFP con un aumento de ×20 con un tamaño de paso z de 10 µm. Cada segmento en la pila de imágenes se umbralizó y binarizó para cada canal de color, y se encontró el centro de masa (COM) del grupo. g(r) se encontró calculando la distancia de cada píxel desde el COM y normalizando la densidad de píxeles dentro del grupo. Para crear un valor único que capture la distribución de celdas en el clúster, calculamos el COM de la distribución g(r) y restamos este valor para las celdas mCherry del valor para las celdas BFP. Por lo tanto, los valores grandes indican que las celdas mCherry están más cerca del centro del clúster y los valores pequeños indican que las celdas BFP están más cerca del centro del clúster. El análisis de imágenes se implementó en MATLAB (2020a).

Se generaron células L929 que expresan de forma estable synCAM con pares heterofílicos ortogonales y un mCherry o BFP citosólico. Antes de llevar a cabo el experimento, las líneas celulares se separaron con TrypLE, se resuspendieron en 1 ml de DMEM, se contaron y luego se diluyeron a 4 × 105 células por ml. Cada par se mezcló 1:1 en una placa de fondo plano de 384 pocillos con una superficie repelente de células (3,2 × 104 células, 80 µl de volumen total, 37 °C). En t = 3 h, se tomaron imágenes de las placas con un aumento de × 20 utilizando microscopía confocal de fluorescencia (Phenix). Las imágenes de máxima proyección se generaron utilizando el software del fabricante.

Para validar la ortogonalidad de los pares de synCAM heterófilos, se caracterizó un subconjunto por la capacidad de clasificar diferencialmente las células L929 parentales. Las líneas celulares synCAM se separaron usando TrypLE, se resuspendieron en 1 ml de DMEM, se contaron y luego se diluyeron a 1 × 103 células por ml. Las células L929 parentales se separaron usando TrypLE, se tiñeron con CellTrace Far Red de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se diluyeron a 1 × 103 células por ml. Dos synCAM y las células WT L929 se mezclaron 1: 1: 1 (80 µl en total) en un pocillo de fondo redondo ULA y se tomaron imágenes después de 24 h con un aumento de × 20 utilizando microscopía confocal de fluorescencia (Phenix). Luego se generaron imágenes de máxima proyección utilizando el software del fabricante (Harmony). Dentro del software, las celdas individuales se segmentaron y el centro del ensamblaje se calculó sobre la base de la posición promedio de todas las celdas. A continuación, se determinó la distancia de las células WT (Far Red) L929 y las células synCAM (BFP) desde el centro del conjunto previamente calculado. Luego se calculó la diferencia entre la distancia promedio de las celdas WT y synCAM y se representó como un mapa de calor, con distancias mayores correspondientes a una mayor exclusión de las celdas WT del ensamblaje.

Las synCAM homotípicas se diseñaron para alterar estéricamente las interacciones cis de ECD de la región de unión. Las cremalleras de leucina antiparalelas, que deberían favorecer la unión trans sobre la cis, se fusionaron con un dominio conector fibcon, que extiende el receptor desde la región yuxtamembrana37,38,36. Los esfuerzos para diseñar synCAM homotípicos sin el enlazador fibcon no tuvieron éxito. Estos ECD diseñados se fusionaron con un ICAM-1 TM/ICD.

Se generaron células L929 que expresan de forma estable los receptores homofílicos synCAM y mCherry citosólicos. Las líneas celulares clonales se obtuvieron mediante clasificación de células individuales. Las líneas celulares se separaron usando TrypLE, se resuspendieron en 1 ml de DMEM, se contaron y luego se diluyeron a 1 × 103 células por ml. Las células se incubaron en una placa de fondo redondo ULA de 384 pocillos (80 células, 80 µl de volumen total, 37 °C) durante 24 hy luego se tomaron imágenes mediante microscopía confocal de fluorescencia (Phenix). Las imágenes de máxima proyección se generaron utilizando el software del fabricante (Harmony).

Previamente se generaron células L929 que expresan WT PCAD y mCherry citosólico6. Las células L929 que expresan BFP citosólica con o sin expresión estable de un synCAM anti-PCAD (ICAM-1 TM/ICD) se mezclaron 1:1 con células L929 que expresan de forma estable WT PCAD y mCherry citosólica en una placa de fondo redondo ULA de 384 pocillos ( 80 células, 80 l de volumen total, 37 °C) durante 24 h y se tomaron imágenes mediante microscopía confocal de fluorescencia (Phenix). Las imágenes de máxima proyección se generaron utilizando el software del fabricante (Harmony). Dentro del software Harmony, se calculó el área total abarcada por las células L929 que expresan WT PCAD (mCherry) y las células WT o anti-PCAD (BFP) para cada imagen de proyección máxima en cada punto de tiempo de pocillos distintos. Luego se calculó y representó la relación del área de BFP a células mCherry durante 24 h, con una relación aumentada correspondiente a la exclusión de células BFP del ensamblaje multicelular (Datos extendidos Fig. 10b). Además, para t = 24 h, las celdas se segmentaron y la posición del centro del ensamblaje se calculó como la posición promedio de las celdas mCherry+ y BFP+. A continuación, se calculó la distancia relativa de las células BFP+ y mCherry+ al centro del conjunto (datos ampliados, figura 10c), correspondiendo una mayor distancia a una mayor exclusión de células BFP+ L929.

Para los experimentos de patrones multicelulares, las líneas celulares L929 se separaron usando TrypLE, se resuspendieron en 1 ml de DMEM, se contaron y luego se diluyeron a 1 × 103 células por ml. Antes de la dilución, las synCAM Aph4 e IF1 se tiñeron con CellTrace Far Red y CFSE, respectivamente, de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Para generar el patrón alternante de dos células, se mezclaron células L929 que expresaban GFP–ICAM-1 (célula 1) con células L929 que expresaban mCherry citosólico y LaG16–ICAM-1 (anti-GFP) (célula 2) (1:1 80 µl total). Para generar el patrón puente de tres células, se mezclaron células L929 que expresan GFP-ECAD (celda 1) con células que expresan mCherry citosólico, LaG16-ECAD y anti-CD19-ICAM-1 (celda 2), y células que expresan BFP citosólico y CD19 –ICAM-1 (celda 3) (1:2:1 80 µl total). Para generar el patrón cíclico de tres células, se mezclaron células L929 que expresan GFP-ECAD y anti-MBP-ICAM-1 (celda 1) con células que expresan LaG16-ECAD y mCherry-ICAM-1 (celda 2), y células que expresan MBP –ICAM-1, LaM4–ICAM-1 y BFP citosólico (celda 3) (1:1:1 80 µl total). En todos los casos, las células se sembraron en pocillos de fondo redondo ULA y se tomaron imágenes después de 2 h usando microscopía confocal (Phenix). Se generaron imágenes de proyección máxima de distintos pozos utilizando el software del fabricante (Harmony). Para calcular las tablas de probabilidad de interacción, las celdas se segmentaron en Harmony para cada imagen de máxima proyección. Los contactos célula-célula se identificaron a partir de las posiciones de las células segmentadas, y la probabilidad de cada interacción se calculó y representó como un mapa de calor.

Para formar los ensamblajes cíclicos aislados de tres y cuatro células, las células L929 expresan GFP-ECAD y anti-MBP-ICAM-1 (celda 1); LaG16–ECAD y mCherry–ICAM-1 (celda 2); y MBP–ICAM-1, LaM4–ICAM-1 y BFP citosólico (célula 3) se diluyeron a 4 × 103 células por ml y se sembraron en un pocillo de fondo plano con una superficie repelente de células. Se identificaron pares individuales y se generaron y exportaron imágenes de proyección máxima.

Se mezclaron células L929 que expresaban Wt ECAD y BFP citosólica, Aph4–ICAM-1 o IF1–ICAM-1 (ya sea individualmente o las tres juntas) en pocillos de fondo redondo ULA (1:1 o 1:1:1, 80 µl totales). Se tomaron imágenes de las células después de 48 h usando microscopía confocal. Las imágenes de proyección máxima se generaron a partir de distintos pozos utilizando el software del fabricante (Harmony) y se clasificaron según el fenotipo de ensamblaje.

Se cultivaron fibroblastos dérmicos humanos adultos (NHDF-Ad) y fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) en DMEM que contenía FBS al 10%. Las células madre mesenquimales (MSC) se cultivaron en medio de crecimiento de células madre mesenquimales (Lonza).

Para generar células estables que expresan las construcciones synCAM, el sobrenadante viral (15 µl de virus concentrado x20) se diluyó con 1,5 ml de medio y se sembró directamente con células cultivadas hasta un 80 % de confluencia (5 x 104 MSC, MEF o NHDF sembradas en un 12 -bien plato). Luego, 24 h después de la transducción, el medio viral se reemplazó con medio de crecimiento normal y las células se expandieron en una placa de 6 pocillos. Los MEF se clasificaron adicionalmente para la expresión de construcciones synCAM por FACS.

Bajo la aprobación oficial del Comité de Investigación de Gametos, Embriones y Células Madre Humanas de la UCSF (GESCR) para FF, utilizamos las líneas de células madre embrionarias humanas WA09 adquiridas de WiCell en este estudio. Estas líneas celulares y su muestra original están completamente anonimizadas y ningún autor tuvo acceso a los identificadores.

Las hPSC (WA09, WiCell) se mantuvieron en medio E8 en placas de seis pocillos recubiertas con Geltrex. Dos días antes de iniciar la diferenciación del músculo liso, las hPSC se disociaron con EDTA y se volvieron a sembrar en una placa de seis pocillos recubierta con Geltrex. Una vez que las hPSC alcanzaron la confluencia, se aspiró el medio E8 y se reemplazó con 1 ml por pocillo de Essential 6 con 100 ng ml−1 de activina A. Al día siguiente, se aspiró el medio y se reemplazó con 2 ml por pocillo de medio E6 con 10 ng ml−1 −1 BMP4. Dos días después, se aspiró el medio y se reemplazó con 2 ml por pocillo de medio E6 con 10 ng ml-1BMP4. Durante los días 5 a 9, las células se mantuvieron con medio E6 fresco + FBS al 2 % en días alternos. Desde el día 10 en adelante, el medio se reemplazó tres veces por semana con Advanced DMEM/F12 + 10% FBS.

Para generar SMC con expresión estable de synCAM, las SMC se cultivaron hasta un 80 % de confluencia en una placa de 96 pocillos y se transdujeron con 1 µl de virus concentrado 20x. Después de 24 h, se retiró el medio y se reemplazó con medio nuevo.

El epitelio intestinal se aisló y cultivó como se describió previamente57. En resumen, las criptas del intestino delgado se disociaron del duodeno de ratones macho C57BL/6 de 6 a 12 semanas de edad. El tejido se colocó en PBS enfriado con hielo con EDTA 15 mM durante 30 min, luego se agitó vigorosamente en múltiples fracciones para liberar las criptas. El sobrenadante que contenía las criptas se filtró en una malla de 70 μM, y luego las criptas se sedimentaron y resuspendieron en Matrigel con factor de crecimiento reducido y se cultivaron como enteroides 3D con medio ENR (Advanced DMEM/F12 (Thermo Fisher Scientific, 12634-028) con 1× N2 (Thermo Fisher Scientific, 17502-048), 1× B27 (Thermo Fisher Scientific, 17504-044), 10 mM HEPES (Thermo Fisher Scientific, 15630080), 1× GlutaMAX (Thermo Fisher Scientific, 35050-061) , N-acetilcisteína 1 mM (Sigma-Aldrich A9165), 100 U ml−1 de penicilina y 100 mg ml−1 de estreptomicina (Corning, 30-002), suplementado con 50 ng ml−1 de EGF (Sigma Aldrich, E9644.2MG) , 100 ng ml-1 de Noggin (R&D 6057-NG/CF) y medio acondicionado con R-spondin al 5 %. El medio se cambió cada 3 días y los organoides se disociaron mecánicamente y se pasaron semanalmente.

Para estos experimentos, los ratones se mantuvieron en las instalaciones de animales libres de patógenos específicos de la Universidad de California en San Francisco (UCSF). Todo el mantenimiento y los experimentos se realizaron de acuerdo con las pautas establecidas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales y el Centro de Recursos de Animales de Laboratorio. Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Centro de Recursos para Animales de Laboratorio de la UCSF. Los ratones se alojaron en las instalaciones de cuidado de animales LARC de UCSF en UCSF Parnassus. Se alojaron en una suite individual libre de patógenos específicos. Se alojaron con hasta cinco ratones por jaula en jaulas con ventilación, con alimento y agua ad libitum bajo un ciclo de luz-oscuridad de 12 h a 12 h y condiciones de temperatura y humedad controladas (20–26 °C y 30–70 %).

Para la expresión de construcciones synCAM, los organoides se transdujeron con lentivirus como se describió anteriormente58. Primero, los enteroides 3D se disociaron en células individuales usando TrypLe, que luego se cultivaron en Matrigel con factor de crecimiento reducido y medio de transducción (medio NR complementado con medio condicionado con Wnt3a al 50 %, nicotinamida 10 μM (Sigma-Aldrich, N3376-100G) , CHIR 5 μM (Sigma-Aldrich, SML1046-5MG) y Y-27632 10 μM (Sigma-Aldrich, Y0503-1MG)) durante 3 a 5 días para enriquecer las células madre. Luego, los enteroides se disociaron, sedimentaron, resuspendieron en un medio de transducción que contenía 8 μg ml-1 de polibreno (Sigma-Aldrich, H9268-5G) y lentivirus concentrado, se centrifugaron a 600 g durante 1 hora a 32 °C y luego se incubaron a 37 °C durante 6 H. Luego, las células se sedimentaron y se resuspendieron en Matrigel y se cultivaron en medio de transducción durante 3 días, luego se cambiaron a medio ENR. Después de la amplificación, la selección de antibióticos se realizó agregando 1 μg ml−1 de puromicina (Thermo Fisher Scientific, A1113803) al medio.

GFP-ICAM-1, GFP-tether, anti-GFP-fibcon-ICAM-1 o anti-GFP-fibcon-tether se transdujeron en MSC, NHDF o SMC. Para estos experimentos, se incluyó un dominio de enlace fibcon para las construcciones anti-GFP-ICAM-1 y anti-GFP-tether para mejorar la expresión en células primarias. Todas las células que expresan GFP se cotransdujeron con un plásmido para la expresión de BFP citosólica, y todas las células que expresan anti-GFP se cotransdujeron con una construcción que expresa mCherry citosólica. Luego, 24 h después de la transducción, se retiró el medio y se reemplazó con medio fresco. Después de 4 a 7 días, las MSC, SMC o NHDF se separaron con TryplE, se resuspendieron en medio y se sembraron en una placa de 384 pocillos. Luego, 24 h después del enchapado, se tomaron imágenes de los pozos usando microscopía confocal de fluorescencia (Phenix).

Las células L929 que expresan de manera estable WT PCAD, mCherry citosólico y LaG16–synCAM (ICAM-1, ECAD o control de anclaje) se mezclaron 1:1 con células L929 que expresan de manera estable WT ECAD, BFP citosólico y GFP–synCAM (ICAM-1, ECAD o control de amarre) en una placa de fondo redondo ULA (80 células en total, 80 µl, 24 h, 37 °C). Antes de mezclar, las líneas celulares L929 se separaron usando TrypLE, se resuspendieron en 1 ml de DMEM, se contaron y luego se diluyeron a 1 × 103 células por ml. Se tomaron imágenes de los ensamblajes usando microscopía confocal de fluorescencia (Phenix, aumento de ×20), y se generaron imágenes de proyección máxima de distintos pozos usando el software del fabricante y se muestran.

Para modificar el ensamblaje entre las células L929 que expresan WT NCAD y las células L929 que expresan WT PCAD, el experimento se realizó exactamente como se describe anteriormente con células L929 que expresan WT NCAD y GFP citosólica en lugar de las células WT ECAD.

Se formó una capa adherente de células MDCK que expresan BFP citosólica y GFP-Tether, GFP-ICAM-1 o GFP-ECAD dentro de los pocillos de una placa de 384 pocillos (16 000 células sembradas por pocillo). Después de 48 h, se agregaron células L929 que expresan WT PCAD, mCherry citosólico y LaG16-ICAM-1, LaG16-tether, LaG16-ECAD o ningún receptor adicional (24,000 células por pocillo). Se tomaron imágenes de la interacción entre las dos capas mediante microscopía confocal de fluorescencia (Phenix) durante 24 h. Las imágenes ampliadas de los ensamblajes se formaron uniendo nueve campos de visión adyacentes después de exportar las imágenes desde el software del fabricante. Tanto la redondez como el área superficial del conjunto mCherry+ se cuantificaron para cada campo del experimento dentro del software del fabricante (Harmony).

Los cultivos de enteroides en monocapa se establecieron como se describió previamente59. Los enteroides 3D se disociaron en células individuales usando TrypLE, se lavaron en PBS y se tiñeron usando CellTrace. Un total de 150 000 células que expresan GFP-ICAM-1 o GFP-Tether se sembraron en placas en una placa de 384 pocillos recubierta previamente con Matrigel con factor de crecimiento reducido al 5 % en 40 μl de medio ENR complementado con CHIR 3 μM y Y-27632 10 μM . Después de 4 h, se agregaron 60 μl adicionales de medio ENR a cada pocillo. Luego, 24 h después de la siembra, se agregaron las monocapas enteroides, células de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) que expresan anti-GFP-fibcon-tether o anti-GFP-fibcon-ICAM-1 y mCherry citosólico (16,000 células). Después de 24 h, se tomaron imágenes de los pozos usando microscopía confocal de fluorescencia (Phenix). Las imágenes de máxima proyección y las imágenes en 3D se exportaron desde el software del fabricante (Harmony).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos experimentales que respaldan las conclusiones de este estudio están disponibles en el Artículo y en la Información complementaria. Todas las bases de datos utilizadas en este estudio están disponibles públicamente. Para identificar secuencias de proteínas y arquitectura de dominio, se utilizó Universal Protein Resource (https://www.uniprot.org/). Para la identificación de motivos lineales dentro de los ICD CAM, se utilizó el recurso Eukaryotic Linear Motif (ELM) (http://elm.eu.org/). Las réplicas de microscopía adicionales están disponibles en Figshare (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.21647546.v1). Los datos de origen se proporcionan con este documento.

Honig, B. & Shapiro, L. Estructura de proteína de adhesión, afinidades moleculares y principios de reconocimiento de célula a célula. Celda 181, 520–535 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, MI y Nourshargh, S. Cómo llegar al sitio de la inflamación: actualización de la cascada de adhesión de leucocitos. Nat. Rev. Inmunol. 7, 678–689 (2007).

Artículo CAS Google Académico

Sanes, JR & Zipursky, SL Especificidad sináptica, moléculas de reconocimiento y ensamblaje de circuitos neuronales. Celda 181, 536–556 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Collinet, C. & Lecuit, T. Flujo de información programado y autoorganizado durante la morfogénesis. Nat. Rev Mol. Biol celular. 22, 245–265 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Todhunter, ME y col. Síntesis programada de tejidos tridimensionales. Nat. Métodos 12, 975–981 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Toda, S., Blauch, LR, Tang, SKY, Morsut, L. & Lim, WA Programación de estructuras multicelulares autoorganizadas con señalización celular sintética. Ciencia 361, 156–162 (2018).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Cavallaro, U. & Dejana, E. Señalización de moléculas de adhesión: no siempre es un asunto difícil. Nat. Rev Mol. Biol celular. 12, 189–197 (2011).

Artículo CAS Google Académico

Rubinstein, R. et al. Lógica molecular del autorreconocimiento neuronal a través de interacciones del dominio de protocadherina. Celda 163, 629–642 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Tsai, TY-C., Garner, RM & Megason, SG Autoorganización basada en la adhesión en el diseño de tejidos. año Rev. Célula Desv. Biol. 38, 349–374 (2022).

Artículo Google Académico

Lecuit, T. y Lenne, P.-F. Mecánica de la superficie celular y control de la forma celular, patrones tisulares y morfogénesis. Nat. Rev Mol. Biol celular. 8, 633–644 (2007).

Artículo CAS Google Académico

Arslan, FN, Eckert, J., Schmidt, T. y Heisenberg, C.-P. Manteniéndolo unido: cuando la cadherina se encuentra con la cadherina. Biografía. J. 120, 4182–4192 (2021).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Kinashi, T. Señalización intracelular que controla la activación de la integrina en los linfocitos. Nat. Rev. Inmunol. 5, 546–559 (2005).

Artículo CAS Google Académico

Yap, AS & Kovacs, EM Señalización celular activada por cadherina directa: una vista desde la membrana plasmática. J. Cell Biol. 160, 11–16 (2003).

Artículo CAS Google Académico

Parsons, JT, Horwitz, AR & Schwartz, MA Adhesión celular: integración de la dinámica del citoesqueleto y la tensión celular. Nat. Rev Mol. Biol celular. 11, 633–643 (2010).

Artículo CAS Google Académico

Geiger, B., Salomon, D., Takeichi, M. & Hynes, RO Un receptor quimérico de N-cadherina/β1-integrina que se localiza en las adherencias célula-célula y célula-matriz. J. ciencia celular. 103, 943–951 (1992).

Artículo CAS Google Académico

LaFlamme, SE, Thomas, LA, Yamada, SS & Yamada, KM Integrinas quiméricas de una sola subunidad como miméticos e inhibidores de las funciones de integrina endógena en la localización del receptor, la propagación y migración celular, y el ensamblaje de la matriz. J. Cell Biol. 126, 1287–1298 (1994).

Artículo CAS Google Académico

Lilienbaum, A., Reszka, AA, Horwitz, AF y Holt, CE Las integrinas quiméricas expresadas en las células ganglionares de la retina alteran el crecimiento del proceso in vivo. mol. Celúla. Neurosci. 6, 139–152 (1995).

Artículo CAS Google Académico

Young, BA et al. El dominio citoplásmico de la subunidad de la integrina alfa9 requiere la proteína adaptadora paxilina para inhibir la propagación celular, pero promueve la migración celular de manera independiente a la paxilina. mol. Biol. Celda 12, 3214–3225 (2001).

Artículo CAS Google Académico

Schoenit, A. et al. Ajuste de la adhesión célula-célula epitelial y la dinámica colectiva con enlazadores híbridos ADN-E-cadherina funcionales. Nano Lett. 22, 302–310 (2022).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Fridy, PC y col. Una tubería robusta para la producción rápida de repertorios de nanocuerpos versátiles. Nat. Métodos 11, 1253–1260 (2014).

Artículo CAS Google Académico

Nose, A., Nagafuchi, A. & Takeichi, M. Las cadherinas recombinantes expresadas median la clasificación celular en sistemas modelo. Celda 54, 993–1001 (1988).

Artículo CAS Google Académico

Foty, RA & Steinberg, MS La hipótesis de la adhesión diferencial: una evaluación directa. desarrollo Biol. 278, 255–263 (2005).

Artículo CAS Google Académico

Maître, J.-L. et al. La adhesión funciona en la clasificación celular al acoplar mecánicamente las cortezas de las células adheridas. Ciencia 338, 253–256 (2012).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Winklbauer, R. Fuerza de adhesión celular a partir de la tensión cortical: una integración de conceptos. J. ciencia celular. 128, 3687–3693 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Cerchiari, AE et al. Una estrategia para la autoorganización de tejidos que es robusta a la heterogeneidad y plasticidad celular. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 112, 2287–2292 (2015).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Cuvelier, D. et al. La dinámica universal de la propagación celular. actual Biol. 17, 694–699 (2007).

Artículo CAS Google Académico

Barreiro, O. et al. Interacción dinámica de VCAM-1 e ICAM-1 con moesin y ezrin en una nueva estructura de acoplamiento endotelial para leucocitos adherentes. J. Cell Biol. 157, 1233–1245 (2002).

Artículo CAS Google Académico

Beutel , O. , Maraspini , R. , Pombo-García , K. , Martin-Lemaitre , C. & Honigmann , A. La separación de fases de las proteínas de zonula occludens impulsa la formación de uniones estrechas . Celda 179, 923–936.

Artículo CAS Google Académico

Sytnyk, V., Leshchyns'ka, I., Nikonenko, AG y Schachner, M. NCAM promueve el ensamblaje y la remodelación dependiente de la actividad del complejo de señalización postsináptica. J. Cell Biol. 174, 1071–1085 (2006).

Artículo CAS Google Académico

Tetzlaff, F. et al. MPDZ promueve la señalización de Notch inducida por DLL4 durante la angiogénesis. eLife 7, e32860 (2018).

Artículo Google Académico

Schwayer, C. et al. La mecanosensación de las uniones estrechas depende de la separación de fases y el flujo de ZO-1. Celda 179, 937–952.e18 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Gartner, ZJ & Bertozzi, CR Ensamblaje programado de microtejidos tridimensionales con conectividad celular definida. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 106, 4606–4610 (2009).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Glass, DS & Riedel-Kruse, IH Una caja de herramientas de adhesión celular bacteriana sintética para programar morfologías y patrones multicelulares. Celda 174, 649–658 (2018).

Artículo CAS Google Académico

Chao, G. et al. helixCAM: una plataforma para ensamblaje celular programable en bacterias y células humanas. Celda 185, 3551–3567 (2022).

Artículo CAS Google Académico

Kim, H. et al. La lógica de adhesión de 4 bits permite la creación de patrones de interfaz multicelular universal. Naturaleza 608, 324–329 (2022).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Negron, C. & Keating, AE Un conjunto de homodímeros antiparalelos ortogonales diseñados computacionalmente que amplía el conjunto de herramientas de bobina en espiral sintética. Mermelada. química Soc. 136, 16544–16556 (2014).

Artículo CAS Google Académico

Rhys, GG et al. Mantenimiento y ruptura de la simetría en ensamblajes homoméricos coiled-coil. Nat. común 9, 4132 (2018).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Jacobs, SA et al. Diseño de nuevos dominios FN3 con alta estabilidad mediante un enfoque de secuencia de consenso. Ing. Proteínas Des. sel. 25, 107–117 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Hynes, RO Integrinas: máquinas de señalización alostéricas bidireccionales. Celda 110, 673–687 (2002).

Artículo CAS Google Académico

Luo, B.-H. & Springer, TA Estructuras de integrinas y señalización conformacional. actual Opinión Biol celular. 18, 579–586 (2006).

Artículo CAS Google Académico

Wu, Y. et al. Cooperatividad entre interacciones trans y cis en la formación de uniones mediadas por cadherina. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 107, 17592–17597 (2010).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Brasch, J., Harrison, OJ, Honig, B. y Shapiro, L. Pensando fuera de la célula: cómo las cadherinas impulsan la adhesión. Tendencias Cell Biol. 22, 299–310 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Abedin, M. & King, N. La ascendencia premetazoica de las cadherinas. Ciencia 319, 946–948 (2008).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

King, N., Hittinger, CT y Carroll, SB La evolución de las familias de proteínas de adhesión y señalización celular clave es anterior a los orígenes animales. Ciencia 301, 361–363 (2003).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Lecuit, T. & Yap, AS Uniones de E-cadherina como integradores mecánicos activos en la dinámica tisular. Nat. Biol celular. 17, 533–539 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Manning, ML, Foty, RA, Steinberg, MS y Schoetz, E.-M. La coacción de la adhesión intercelular y la tensión cortical especifica la tensión superficial del tejido. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 107, 12517–12522 (2010).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Krieg, M. et al. Las fuerzas de tracción gobiernan la organización de la capa germinal en el pez cebra. Nat. Biol celular. 10, 429–436 (2008).

Artículo CAS Google Académico

Amack, JD & Manning, ML Conociendo los límites: extendiendo la hipótesis de adhesión diferencial en la clasificación de células embrionarias. Ciencia 338, 212–215 (2012).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Lim, WA La era emergente de la ingeniería celular: aprovechar la modularidad de las células para programar funciones biológicas complejas. Ciencia 378, 848–852 (2022).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Guan, XM, Kobilka, TS & Kobilka, BK Mejora de la inserción y función de la membrana en una proteína de membrana tipo IIIb luego de la introducción de un péptido señal escindible. J. Biol. química 267, 21995–21998 (1992).

Artículo CAS Google Académico

Consorcio UniProt. UniProt: la base de conocimiento universal de proteínas en 2021. Nucleic Acids Res. 49, D480–D489 (2021).

Artículo Google Académico

Zimmermann, I. et al. Anticuerpos sintéticos de dominio único para el atrapamiento conformacional de proteínas de membrana. eLife 7, e34317 (2018).

Artículo Google Académico

Zhao, N. et al. Una sonda codificada genéticamente para obtener imágenes de proteínas marcadas con HA nacientes y maduras in vivo. Nat. común 10, 2947 (2019).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Grupp, SA et al. Células T modificadas con receptor de antígeno quimérico para la leucemia linfoide aguda. N. ingl. J.Med. 368, 1509–1518 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Roovers, RC y col. Un nanocuerpo anti-EGFR biparatópico inhibe eficazmente el crecimiento de tumores sólidos. En t. J. Cáncer 129, 2013–2024 (2011).

Artículo CAS Google Académico

Williams, JZ et al. Programas precisos de reconocimiento de células T diseñados mediante la vinculación transcripcional de múltiples receptores. Ciencia 370, 1099–1104 (2020).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Mahé, MM et al. Establecimiento de organoides epiteliales gastrointestinales. actual Protocolo Ratón Biol. 3, 217–240 (2013).

Artículo Google Académico

Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, RC y Koo, B.-K. Un protocolo de video de infección retroviral en cultivo de organoides intestinales primarios. J. Vis. Exp. 90, e51765 (2014).

Thorne, CA et al. Las monocapas de enteroides revelan un circuito WNT y BMP autónomo que controla el crecimiento y la organización del epitelio intestinal. desarrollo Celda 44, 624–633 (2018).

Artículo CAS Google Académico

Celli, L., Ryckewaert, J.-J., Delachanal, E. & Duperray, A. Evidencia de un papel funcional para la interacción entre ICAM-1 y actininas alfa no musculares en la diapédesis de leucocitos. J. Immunol. 177, 4113–4121 (2006).

Artículo CAS Google Académico

Anthis, NJ et al. La estructura de un complejo integrina/talina revela la base de la transducción de señales de adentro hacia afuera. EMBO J. 28, 3623–3632 (2009).

Artículo CAS Google Académico

García-Álvarez, B. et al. Determinantes estructurales del reconocimiento de integrinas por talina. mol. Celda 11, 49–58 (2003).

Artículo Google Académico

Huber, AH & Weis, WI La estructura del complejo β-catenina/E-cadherina y la base molecular del reconocimiento de diversos ligandos por β-catenina. Celda 105, 391–402 (2001).

Artículo CAS Google Académico

Little, EB, Edelman, GM y Cunningham, BA La palmitoilación del dominio citoplásmico de la molécula de adhesión de células neurales N-CAM sirve como ancla para las membranas celulares. Adhesivos celulares. común 6, 415–430 (1998).

Artículo CAS Google Académico

Descargar referencias

Damos las gracias a D. Mullins, Z. Gartner, V. Weaver, M. Kutys y los miembros del laboratorio Lim y Cell Design Institute para los debates, la asistencia y el asesoramiento. Este trabajo fue apoyado por una subvención del Centro NSF para la construcción celular (DBI-1548297), el NIH NCI (U01CA265697) y el Instituto de Diseño Celular de la UCSF. AJS es un becario Damon Runyon apoyado por la Fundación de Investigación del Cáncer Damon Runyon (DRG, 2355-19) y es un becario de diseño de células Hartz. ARH recibió el apoyo de una subvención Discovery NSERC (RGPIN-2022-04933). JG recibió el apoyo del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares, a través de la subvención UCSF número 2R25NS070680-11.

Andrés R. Harris

Dirección actual: Departamento de Ingeniería Mecánica y Aeroespacial, Universidad de Carleton, Ottawa, Ontario, Canadá

Wesley L. McKeithan

Dirección actual: Maze Therapeutics, San Francisco, CA, EE. UU.

Instituto de Diseño de Células de la UCSF, Universidad de California, San Francisco, CA, EE. UU.

Adam J. Stevens, Josiah Gerdts, Ki H. Kim, Wesley L. McKeithan y Wendell A. Lim

Departamento de Farmacología Celular y Molecular, Universidad de California, San Francisco, CA, EE. UU.

Adam J. Stevens, Josiah Gerdts, Ki H. Kim, Jonathan T. Ramirez, Wesley L. McKeithan, Faranak Fattahi y Wendell A. Lim

Centro de Construcción Celular, Universidad de California, San Francisco, CA, EE. UU.

Adam J. Stevens, Andrew R. Harris, Josiah Gerdts, Ki H. Kim, Wesley L. McKeithan, Daniel A. Fletcher y Wendell A. Lim

Departamento de Bioingeniería, Universidad de California, Berkeley, CA, EE. UU.

Andrew R. Harris y Daniel A. Fletcher

Departamento de Neurología, Instituto Weill de Neurociencia, Universidad de California, San Francisco, CA, EE. UU.

Josías Gerdts

Programa en Biología Craneofacial, Universidad de California, San Francisco, CA, EE. UU.

Coralie Trentesaux y Ophir D. Klein

Departamento de Ciencias Orofaciales, Universidad de California, San Francisco, CA, EE. UU.

Coralie Trentesaux y Ophir D. Klein

Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine and Stem Cell Research, Universidad de California, San Francisco, CA, EE. UU.

Jonathan T. Ramírez y Faranak Fattahi

Departamento de Pediatría, Centro Médico Cedars-Sinai, Los Ángeles, CA, EE. UU.

Ofir D. Klein

Chan Zuckerberg Biohub, San Francisco, CA, EE. UU.

Daniel A. Fletcher

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

Investigación diseñada por AJS, ARH, CT, FF, ODK, DAF y WAL. AJS, JG, KHK y WLM clonaron plásmidos y generaron líneas celulares. AJS realizó experimentos de adhesión célula-célula. ARH realizó experimentos de adhesión de propagación celular. AJSCT, JTR y KHK realizaron experimentos de adhesión en células primarias y derivadas de células iPS. AJS y ​​ARH analizaron los datos. AJS, ARH, DAF y WAL escribieron el artículo.

Correspondencia a Wendell A. Lim.

WAL es asesor de Allogene y SciFi Foods, y posee acciones en Gilead e Intellia. La Universidad de California en San Francisco ha presentado una solicitud de patente en relación con las moléculas de adhesión diseñadas que se informan en este trabajo con WAL y AJS enumerados como inventores (PCT/US2021/057601). Los demás autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Nature agradece a Matthias Lutolf y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

( a ) Análisis FACS de la expresión de synCAM de GFP (izquierda) y αGFP (derecha) en células de fibroblastos L929 después de la clasificación celular. La expresión superficial de cada synCAM se mide utilizando un anticuerpo marcado anti-FLAG. Se indica el dominio CAM TM y ICD para cada construcción (anclaje = control que carece de ICD, DLL1 = Proteína tipo Delta 1, JAM-B = Molécula B de adhesión a la unión, NCAM-1 = Molécula 1 de adhesión de células neurales, MUC-4 = Mucina 4, ICAM-1 = Molécula de Adhesión Intercelular 1, Ecad = E-cadherina, Intβ1 = integrina beta 1, Intβ2 = integrina beta 2). El análisis muestra que los niveles de expresión superficial de las construcciones de correa y synCAM alternativas están bien emparejados. ( b ) Réplicas adicionales del análisis de la interfaz de adhesión célula-célula synCAM. Proyección máxima de imágenes de microscopía confocal 20x de interfaces synCAM por pares (t = 3 h): la célula que expresa GFP (azul) está unida a una célula que expresa αGFP (naranja). Se muestra el canal GFP de las interfaces, destacando las diferencias de enriquecimiento del receptor. Aquí se muestran cuatro de veinte ejemplos adicionales. ( c ) Análisis FACS de la expresión de αGFP synCAM en células de fibroblastos L929 que expresan mCherry citosólico (izquierda) o BFP (derecha) después de la clasificación celular. El dominio CAM TM e ICD para cada construcción es ICAM-1, y se indica el ECD de nanocuerpo de llama (LaG) de unión a GFP para cada construcción. Este análisis muestra que esta serie de synCAM de afinidad alternativa se expresa a niveles comparables. ( d ) Proyección máxima de imágenes de microscopía confocal 20X de interfaces synCAM por pares (t = 3 h): la célula que expresa GFP (azul) está unida a una célula que expresa αGFP con el Kd de unión indicado (naranja).

( a ) Análisis FACS de la expresión de αGFP synCAM en células de fibroblastos L929 que expresan mCherry citosólico después de la clasificación celular. El dominio CAM TM e ICD para cada construcción es NCAM-1 o Intβ1, y se indica el ECD de nanocuerpo de llama (LaG) de unión a GFP para cada construcción. Este análisis muestra que esta serie de synCAM de afinidad alternativa se expresa a niveles comparables. ( b ) Proyección máxima de imágenes de microscopía confocal 20X de interfaces synCAM por pares (t = 3 h, barra de escala = 10 μm). Arriba: la célula que expresa GFP (azul) está unida a una célula que expresa αGFP (naranja). El dominio CAM TM e ICD para cada par es Intβ1. Abajo: canal GFP de las interfaces anteriores que resaltan las diferencias de enriquecimiento del receptor en la interfaz. ( c ) Proyección máxima de imágenes de microscopía confocal 20X de interfaces synCAM por pares (t = 3 h, barra de escala = 10 μm). Arriba: la célula que expresa GFP (azul) está unida a una célula que expresa αGFP (naranja). El dominio CAM TM e ICD para cada par es NCAM-1. Abajo: canal GFP de las interfaces anteriores que resaltan las diferencias de enriquecimiento del receptor en la interfaz. ( d ) Gráficos de ángulos de contacto medidos desde las interfaces que se muestran en b y c en relación con la afinidad del nanocuerpo LaG correspondiente (los datos se presentan como valores medios de n = 10 pares, error = 95 % IC). Los ángulos de contacto para Intβ1 (azul) se muestran en relación con NCAM-1 (rojo) y el control de sujeción de la Fig. 1f (negro). ( e ) Gráficos de enriquecimiento de GFP medidos desde las interfaces que se muestran en b y c en relación con la afinidad de nanocuerpos de LaG correspondiente (los datos se presentan como valores medios de n = 10 pares, error = 95 % IC). El enriquecimiento de GFP para NCAM-1 (rojo) se muestra en comparación con Intβ1 (azul) y el control de sujeción de la Fig. 1f (negro).

Datos fuente

( a ) Representación de dibujos animados del ensayo de competencia de clasificación diferencial (izquierda) y cuantificación de la distribución radial que se representa como un mapa de calor (derecha). Este experimento representa una forma alternativa de medir las preferencias / fuerza de adhesión de las diversas interacciones célula-célula impulsadas por synCAM que difiere de la medición del ángulo de contacto que se muestra en la Fig. 1f. Aquí mezclamos células GFP L929 de superficie (células cebo) con dos células L929 marcadas diferencialmente que compiten, cada una con un αGFP synCAM diferente. La adhesión más fuerte de la synCAM se evalúa a través del grado relativo de clasificación conjunta de las células competidoras al núcleo junto con las células del cebo. Calculamos la distribución radial de las células competidoras (rojo/azul) desde el centroide del esferoide. ( b ) Imágenes representativas de proyección máxima del ensayo de competencia de clasificación celular entre células L929 que expresan αGFP-ICAM-1 con el nanocuerpo ECD LaG indicado (mCherry o BFP) mezclado con células L929 que expresan GFP-ICAM-1 (t = 24 h, barra de escala = 50 micras). ( c ) Cuantificación del ensayo de competencia de clasificación celular de b ( n = 4). ( d ) Imágenes representativas de proyección máxima del ensayo de competencia de clasificación celular entre células L929 que expresan αGFP-ICAM-1 y células citosólicas y L929 que expresan αGFP-Tether mezcladas con células L929 que expresan GFP-ICAM-1 (barra de escala = 20 µm, t = 24 h). ( e ) Cuantificación del ensayo de competencia de clasificación celular de d ( n = 4).

Datos fuente

( a ) Análisis FACS de la expresión de GFP synCAM y αGFP synCAM en células de fibroblastos L929 después de la clasificación celular con un ICD ICAM-1 o Tether. Para las construcciones de GFP, la expresión se muestra tanto para la señal de GFP total en la célula (eje Y) como para las células teñidas con un anticuerpo αFlag APC 647 (eje x). (b) Proyección máxima de imágenes de microscopía confocal 20X de interfaces synCAM por pares (t = 3 h, barra de escala = 10 µm) de diferentes niveles de expresión del panel a: la célula que expresa GFP (azul) está unida a una célula que expresa αGFP (naranja ). El dominio CAM TM e ICD para cada par es ICAM-1 o Tether. (c) Diagramas de caja y bigotes (caja = percentil 25 a 75, bigotes = mín. a máx., centro = mediana) de los ángulos de contacto medidos desde las interfaces que se muestran en b (n = 10 pares).

Datos fuente

( a ) Imágenes de microscopía de ejemplo de ensayos de propagación celular de la Fig. 2, que muestran fenotipos para todas las especies synCAM (barra de escala = 10 µm). Se muestran imágenes representativas de réplicas independientes de Tether n = 10, ICAM-1 n = 20, JAM-B n = 20, MUC-4 n = 15, NCAM-1 n = 20, Intβ1 n = 20, Intβ2 n = 20 Las SynCAM se expresan en fibroblastos L929 y se colocan en una superficie de vidrio recubierta de GFP. La huella celular detectada por el colorante de la membrana se indica con un contorno azul; actina teñida con faloidina y mostrada en blanco. ( b ) Caricatura que representa el ensayo de propagación celular. Las células L929 que expresan un αGFP synCAM se sembraron en una superficie recubierta con GFP y se controlaron a lo largo del tiempo. ( c ) Imágenes representadas del ensayo de propagación celular de células L929 que expresan las synCAM indicadas. Se muestran cortes individuales de imágenes confocales. Barra de escala = 10 μm. ( d ) Curvas de progreso del área de contacto de propagación celular representativas de células L929 que expresan las synCAM indicadas. Error = SEM. (e) Constantes de propagación calculadas para células L929 que expresan las synCAM indicadas (donde n es el número de células únicas analizadas, Tether n = 24, Ecad n = 17, JAM-B n = 23, ICAM-1 n = 16, Intβ1 n = 16, Intβ2 n = 18, NCAM-1 n = 14, MUC-4 n = 12. La línea indicada representa el valor medio).

Datos fuente

(a) Imágenes de microscopía de ejemplo de fibroblastos L929 que expresan αGFP JAM-B, ICAM-1 o Tether que se extienden sobre una superficie recubierta de GFP y se tiñen con faloidina (barra de escala = 10 µm). La propagación se muestra en presencia del inhibidor indicado de la regulación de actina. Se tomaron imágenes de un mínimo de 10 regiones de interés en dos días separados. (b) Imágenes confocales de proyección máxima (barra de escala = 10 µm) y ángulos de contacto calculados de las interfaces synCAM que contienen el ICD ICAM-1 con mutaciones en los dominios de unión ERM (BD) (recuadro = percentil 25 a 75, bigotes = min a max, centro = mediana, n = 20 pares)60. ( c ) Imágenes confocales de proyección máxima (barra de escala = 10 µm) y ángulos de contacto calculados de las interfaces synCAM que contienen el ICD Intβ1 con mutaciones en los dos motivos de dominio de unión a talina "NPxY" (recuadro = percentil 25 a 75, bigotes = min a max, centro = mediana, n = 20 pares)61. ( d ) Imágenes confocales de proyección máxima (barra de escala = 10 µm) y ángulos de contacto calculados de las interfaces synCAM que contienen el ICD Intβ2 con mutaciones en los dos motivos de dominio de unión a talina "NPxF" (recuadro = percentil 25 a 75, bigotes = min a max, centro = mediana, n = 20 pares)62. (e) Imágenes confocales de proyección máxima (barra de escala = 10 µm) y ángulos de contacto calculados de las interfaces synCAM que contienen el Ecad ICD con mutaciones en el dominio de unión de β-catenina (recuadro = percentil 25 a 75, bigotes = min a max, centro = mediana, n = 20 pares)63. (f) Imágenes confocales de proyección máxima (barra de escala = 10 µm) y ángulos de contacto calculados y enriquecimiento de GFP de las interfaces synCAM que contienen el ICD MUC-4 con mutaciones en los sitios de fosforilación de Ser y Tyr (recuadro = percentil 25 a 75, bigotes = mín. a max, centro = mediana, n = 20 pares). ( g ) Imágenes confocales de proyección máxima (barra de escala = 10 µm), y ángulos de contacto calculados y enriquecimiento de GFP de interfaces synCAM que contienen el JAM ICD con mutaciones en el dominio de unión PDZ (recuadro = percentil 25 a 75, bigotes = min a max, centro = mediana, n = 20 pares). (h) Imágenes confocales de proyección máxima (barra de escala = 10 µm), y ángulos de contacto calculados y enriquecimiento de GFP de interfaces synCAM que contienen el ICD NCAM-1 con mutaciones en el sitio de palmitoilación de Cys (recuadro = percentil 25 a 75, bigotes = min a max, centro = mediana, n = 20 pares)64.

Datos fuente

(a) Proyección máxima de imágenes de microscopía confocal 20x de interfaces synCAM por pares (barra de escala = 10 µm, t = 3 h): la celda que expresa GFP (azul) está unida a una celda que expresa αGFP (naranja) que contiene el ICD de CAM indicado. Se muestran imágenes representativas de 10 pares de células independientes. ( b ) Canal GFP de pares de células que se muestran en a .

( a ) Caricatura que representa el ensayo de clasificación diferencial utilizado para determinar la ortogonalidad de los pares de ECD synCAM. Los pares SynCAM se mezclan con células L929 parentales y se obtienen imágenes después de 24 h. La clasificación de las células parentales solo debe ocurrir si los ECD synCAM afines coinciden correctamente y pueden unirse. ( b ) Imágenes representativas de proyección máxima del ensayo de clasificación diferencial para un subconjunto de synCAM con ECD ortogonales (barra de escala = 20 μm). La clasificación de células L929 parentales solo se observó en el caso de ECD coincidentes. ( c ) Cuantificación de la clasificación de b (n = 6). Se calculó la diferencia de distancia promedio desde el centro de la esfera entre las células L929 parentales y las células BFP+ y se representa como un mapa de calor. Se observa la exclusión de las células parentales en el caso de pares de synCAM coincidentes. ( d ) Diseño representativo de imágenes de proyección máxima synCAM que contiene múltiples epítopos dentro de un solo ECD (barra de escala = 20 µm). El ECD HA-CD19 exhibe una clasificación diferencial solo para αCD19 o αHA synCAM. Por lo tanto, podemos generar synCAM OR-gate capaces de emparejarse con múltiples socios de adhesión. ( e ) Cuantificación de la clasificación de d (n = 6). Se calculó la diferencia de distancia promedio desde el centro de la esfera entre las células L929 parentales y las células BFP+ y se representa como un mapa de calor. Se observa la exclusión de las células parentales en el caso de pares de synCAM coincidentes.

Datos fuente

Proyección máxima de imágenes de microscopía confocal 20X de clasificación diferencial entre células L929 que expresan WT Ecad o las synCAM de unión homofílica indicadas (barra de escala = 50 µm, t = 48 h). Se muestran imágenes representativas, clasificaciones de montaje y distribuciones para Ecad-IF1 (a), Ecad-Aph4 (b), IF1-Aph4 (c) y Ecad-IF1-Aph4 (d).

(a) Imágenes de proyección máxima del ensayo de clasificación en el que las células L929 que expresan WT Pcad (naranja) se mezclan con células L929 parentales (izquierda) o synCAM (derecha) (azul, t = 0, 24 h, barra de escala = 50 µm) . (b) Cuantificación del área relativa entre el control negativo de BFP o las células αPcad synCAM y mCherry (Pcad) L929 en el transcurso del ensamblaje de 24 h (n = 4 muestras biológicamente independientes, error = SEM). Una mayor diferencia en el área es consistente con una esfera de Pcad más compacta y la exclusión de células BFP+. ( c ) Cuantificación de la distancia relativa por celda (BFP-mCherry) desde el centro de la esfera después del ensamblaje (t = 24 h, n = 4 muestras biológicamente independientes, línea = media). Las células WT BFP exhiben una mayor diferencia en la distancia, lo que es consistente con su exclusión de la esfera Pcad, mientras que las synCAM αPCAD se intercalan.

Datos fuente

Proyección máxima de imágenes de microscopía confocal 20x de αGFP y synCAM GFP (con ICD ICAM-1) o la correa correspondiente (sin ICD) expresadas en MSC (a, barra de escala = 10 µm) fibroblastos dérmicos primarios (b, barra de escala = 20 µm) o SMC derivados de iPSC (c, barra de escala = 20 µm). Las células αGFP también se marcaron con mCherry; Las células GFP también se marcaron con BFP. Se muestran imágenes representativas de tres réplicas independientes. En ambos tipos de células, la atadura de GFP se distribuye de forma difusa por toda la célula. Por el contrario, la GFP-synCAM está fuertemente enriquecida con interfaces célula-célula aterotípicas (flechas blancas). Cuando las células que expresan GFP-synCAM se colocan en placas sin sus células asociadas, la GFP se distribuye de forma difusa por toda la célula.

(a) caricatura que representa la modulación de la clasificación WT Ncad (verde) y WT Pcad (naranja) mediante la introducción de synCAM. (b) Proyecciones máximas de imágenes de microscopía confocal 20X de células WT Pcad y WT Ncad L929 con expresión de las synCAM heterófilas indicadas (barra de escala = 20 µm, t = 24 h). GFP-synCAM se expresa en la célula L929 que expresa Ncad y αGFP synCAM en la célula L929 que expresa Pcad. Se muestran imágenes representativas de tres réplicas independientes. Estos datos muestran que las synCAM pueden impulsar la integración entre las celdas Pcad y Ncad de clasificación diferencial, tal como pueden hacerlo entre las celdas Pcad y Ecad (Fig. 5a). ( c ) Cuantificación de la redondez (izquierda) y el área de superficie total (derecha) de las células L929 a partir de proyecciones máximas de imágenes confocales 20x en la Fig. 5b (los datos se presentan como valores medios de n = 18 campos únicos analizados en dos pozos independientes, error = DE). ( d ) Vistas en 3D (superior) y proyección máxima (inferior) de ensamblajes multicelulares entre una monocapa epitelial intestinal de ratón (verde) y células de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) (naranja) con una atadura GFP-αGFP (izquierda) o ICAM sintético -1 (derecha) interacción de adhesión heterófila. Se muestran imágenes representativas de dos réplicas independientes.

Datos fuente

Interfaces célula-célula SynCAM. Se proporcionan mediciones de ángulo de contacto y enriquecimiento de GFP. Error = IC del 95 %.

Secuencias de construcciones proteicas utilizadas en este estudio. La etiqueta del epítopo se resalta en rojo, la región de unión a ECD se muestra en azul y la región TM y ICD en negrita.

Dominios SLiM de CAM ICD utilizados en synCAM. Los SLiM se identificaron a partir de la base de datos ELM y fuentes bibliográficas.

Autoensamblaje de celdas con pares ortogonales de synCAM. Se muestran ECD alternativos con ICD ICAM-1 (vinculados a la Fig. 4a).

Red de interacción synCAM de tres celdas. Las redes de interacción synCAM de tres celdas impulsan el ensamblaje de celdas (vinculado a la Fig. 4b).

Intercalación de SynCAM en ensamblajes nativos. Anti-PCAD synCAM (ICAM-1 ICD) impulsa la intercalación celular en el grupo PCAD (vinculado a la Fig. 4e).

Remodelación de la organización de los tejidos. SynCAMs puede impulsar el acoplamiento y la remodelación compleja de tejidos epiteliales y esferoides (vinculado a la Fig. 5b).

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Stevens, AJ, Harris, AR, Gerdts, J. et al. Programación del ensamblaje multicelular con moléculas sintéticas de adhesión celular. Naturaleza 614, 144–152 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05622-z

Descargar cita

Recibido: 28 de octubre de 2021

Aceptado: 02 diciembre 2022

Publicado: 12 diciembre 2022

Fecha de emisión: 02 de febrero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-022-05622-z

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt

Materiales naturales (2023)

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y Pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.