La combinación de Lactobacillus fermentum NS9 y extracto de antocianidina de aronia alivia el yodato de sodio

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 8380 (2023) Citar este artículo

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Es importante explorar los enfoques efectivos para prevenir la degeneración macular seca relacionada con la edad (AMD). En este estudio, se detectaron amplitudes de onda de electrorretinogramas de campo completo significativamente reducidas y estructuras de retina desordenadas en retinas de rata del modelo de DMAE seca inducida por yodato de sodio. Seis amplitudes de onda a y b y las actividades antioxidantes aumentaron significativamente, y el grosor de la capa nuclear externa mejoró significativamente en las retinas de rata tratadas con la combinación de Lactobacillus fermentum NS9 (LF) y extracto de aronia antocianidina (AAE) en comparación con el modelo. Los efectos fueron mucho mejores que el tratamiento con AAE solo. El análisis proteómico mostró que las expresiones de α-, β- y γ-cristalinas aumentaron de 3 a 8 veces en AAE tratados solos y de 6 a 11 veces en el tratamiento con AAE + LF en comparación con el modelo, lo que fue confirmado por inmuno- análisis de transferencia. El análisis de la composición microbiana intestinal indicó que se encontró una mayor abundancia del género Parasutterella y la especie P. excrementihominis en el tratamiento AAE + LF en comparación con los otros grupos. Los resultados indicaron que el tratamiento combinado de AAE + LF es una forma potencial de prevenir la degeneración de la retina que es significativamente mejor que el tratamiento con AAE solo.

La degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) se conoce como una enfermedad ocular grave debido al daño estructural degenerativo y la pérdida de la función de la retina que da como resultado una pérdida progresiva de la visión central y ceguera1,2. La DMAE seca representa aproximadamente el 90 % del total de pacientes con DMAE1. Actualmente, la falta de tratamientos efectivos para manejar la AMD seca es un problema importante. Es necesario explorar posibles opciones terapéuticas para la DMAE seca.

Como trastorno relacionado con la edad, la DMAE a menudo se asocia con la enfermedad de Alzheimer (EA), en la que las anomalías visuales son prominentes y se cree que se desarrollan antes del deterioro cognitivo. Las dos enfermedades comparten varias características, incluidos los depósitos de β-amiloide (Aβ), la inflamación crónica y el estrés oxidativo3. Hemos demostrado que la ingestión de la cepa Lactobacillus NS redujo la ansiedad y mejoró la función cognitiva en ratas con hiperamonemia4. L. helveticus NS8 y L. fermentum NS9 exhibieron efectos específicos de cepa para la regulación del peptidoma cerebral5. L. fermentum NS9 también normalizó la composición de la microbiota intestinal y alivió el deterioro inducido por la ampicilina en la retención de la memoria6.

Aunque el mecanismo exacto de la AMD seca sigue siendo desconocido, se cree que el daño inducido por el estrés oxidativo de las células del epitelio pigmentario de la retina (EPR) y los fotorreceptores está fuertemente implicado en la patogénesis de la AMD7. Un estudio reciente mostró que L. fermentum alivia el estrés oxidativo y la inflamación en el modelo de envejecimiento inducido por D-galactosa8. Cada vez más estudios también indican que la microbiota intestinal juega un papel importante en la salud ocular y que el eje intestino-retina estuvo involucrado en los trastornos maculares relacionados con la edad9. La disbiosis microbiana podría cambiar la permeabilidad de la barrera hematorretiniana y relacionarse con la degeneración retiniana10. La microbiota intestinal también podría actuar como factor regulador de la inflamación y las respuestas inmunitarias11. Se ha informado que L. paracasei KW3110 suprimió la inflamación crónica relacionada con la edad y la pérdida de células ganglionares de la retina (RGC) mediante la modulación de la composición de la microbiota intestinal y la función del sistema inmunitario12.

En un estudio anterior, encontramos que la antocianidina de aronia tenía efectos protectores sobre la retina de rata, con un aumento significativo de la expresión de proteínas cristalinas, mientras que los efectos sobre el electrorretinograma (ERG) y la estructura de la retina de rata eran modestos13. Existen interacciones mutuas entre los polifenoles y la microbiota intestinal, y se ha observado una mayor eficacia cuando los probióticos se combinan con prebióticos14,15.

El yodato de sodio (NaIO3) es un agente oxidante y puede inducir daños selectivos en el EPR. El modelo murino NaIO3 se ha utilizado ampliamente para estudiar la DMAE seca, ya que da como resultado una degeneración retiniana en parches reproducible16,17,18. En este estudio, investigamos los efectos y los posibles mecanismos del extracto de antocianidina de aronia (AAE) junto con L. fermentum NS9 (LF) en retina de rata en el modelo de DMAE seca inducida por NaIO3, en comparación con el tratamiento con AAE solo.

ERG es una medida común y sensible para evaluar la función retiniana19. En el grupo modelo, las amplitudes de ERG se redujeron significativamente en comparación con el grupo de control, incluidas las disminuciones de la onda b de Scotopic 0.01 ERG en un 88,01 %, las ondas a y b de Scotopic 3.0 ERG en un 71,75 % y 90,34 %, la amplitud total de Scotopic 3.0 oscilatorio (3 operaciones) en un 80,10 %, onda b de Photopic 3.0 ERG en un 61,51 % y amplitud de onda P1 de Photopic 3.0 parpadeante en un 76,01 % respectivamente (Figs. 1 y 2A–F), lo que indicó una función de empeoramiento global de retina de rata después del tratamiento con NaIO3. En comparación con el grupo Modelo, el tratamiento con AAE mejoró significativamente las amplitudes de onda b de Scotopic 0.01 ERG, Photopic 3.0 ERG y Photopic 3.0 flicker en un 150,96 %, 99,36 % y 58,90 %, respectivamente (Figs. 1 y 2A, E, F) , lo que coincidió con nuestro hallazgo anterior13. Los efectos protectores fueron más significativos en el tratamiento de AAE junto con LF. Las amplitudes de las ondas a y b de los ERG para las seis mediciones diferentes aumentaron significativamente en un 233,35 %, 149,90 %, 201,43 %, 189,55 %, 130,42 % y 142,79 %, respectivamente, en comparación con el modelo (Figs. 1 y 2A–F) . Las ondas a y b de Scotopic 3.0 ERG se incrementaron aún más en un 112,07 % y un 50,28 %, la amplitud total de Scotopic 3.0 oscilatorio en un 66,73 % y la amplitud de onda P1 del parpadeo de Photopic 3.0 en un 52,80 % en comparación con el grupo AAE (Figs. 1 y 2B–D,F).

Espectros registrados de ERG de campo completo de las retinas de rata en diferentes tratamientos. Scotopic 0.01 ERG, Scotopic 3.0 ERG, Scotopic 3.0 potenciales oscilatorios, Photopic 3.0 ERG y Photopic 3.0 parpadeo de la retina de rata se registraron de acuerdo con el estándar ISCEV (Sociedad Internacional de Visión Electrofisiológica Clínica). Control: control sin tratamiento; Modelo: modelo de daño por inyección en la vena de la cola de 30 mg/kg de peso corporal NaIO3; AAE: tratamiento del modelo de daño con aronia antocianidina (60 mg/kg de peso corporal); AAE + LF: tratamiento con antocianidina de aronia 60 mg/kg de peso corporal y 108 UFC/ml L. fermentum NS9 del modelo de daño.

Amplitudes medias de ERG de las retinas de rata en diferentes tratamientos. (A) onda b de Scotopic 0,01 ERG; (B, C) onda a y b de Scotopic 3.0 ERG; (D) amplitud total de Scotopic 3.0 oscilatorio (3 ops); (E) onda b de Photopic 3.0 ERG; (F) Amplitud de onda P1 del parpadeo Photopic 3.0. Los datos que se muestran son la media ± desviación estándar (n = 10). *p < 0,05, **p < 0,01 (ANOVA unidireccional seguido de la prueba de Tukey).

La función protectora de los tratamientos también se demostró en el análisis histológico de la estructura de la retina. La retina en el modelo de daño inducido por NaIO3 mostró una estructura desordenada y una reducción de las capas celulares con capas nucleares internas y externas desordenadas (ONL e INL). Las retinas del grupo AAE mostraron una mejora en su estructura y capas celulares. La mejora fue aún más significativa en el grupo AAE + LF, la alineación de su núcleo estaba relativamente en orden (Fig. 3A). El grosor medio de ONL se redujo significativamente en un 49,89 % en el modelo en comparación con el control. Comparado con el Modelo, el grosor ONL aumentó significativamente en un 39,53% y 78,67% respectivamente en AAE y AAE + LF (Fig. 3B). El grosor medio de ONL aumentó un 28,06% en AAE + LF en comparación con el grupo AAE (Fig. 3B).

Efectos protectores de AAE solo y AAE + LF en la estructura de la retina de rata. (A) Imágenes de la sección de retina de rata teñida con H&E, tomadas con un aumento de 200 ×; (B) Espesor de la capa nuclear externa de las retinas, los datos que se muestran son la media ± desviaciones estándar (n = 4). *p < 0,05, **p < 0,01 (ANOVA unidireccional seguido de la prueba de Tukey). Capa nuclear externa ONL, capa nuclear interna INL. La barra equivale a 50 µm.

Como se muestra en la Fig. 4, las actividades de las enzimas antioxidantes superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT), glutatión peroxidasa (GPx) se redujeron en un 11,52 %, 11,50 % y 8,79 %, respectivamente, y el nivel de malondialdehído (MDA) disminuyó. aumentó en un 99,26 % en el grupo Modelo en comparación con los del Control, lo que indicó un deterioro del estado antioxidante en las ratas dañadas. Se observó un aumento limitado de la actividad de GPx y una disminución del nivel de MDA en las ratas tratadas con AAE (Fig. 4C, D). El tratamiento AAE + LF mostró una mejora significativa en la capacidad antioxidante de las retinas. Las actividades enzimáticas de SOD, CAT y GPx aumentaron en un 14,37 %, 30,53 % y 4,72 %, respectivamente, y el nivel de MDA se redujo en un 55,57 % en el tratamiento con AAE + LF en comparación con el modelo (Fig. 4). Las actividades de SOD, CAT aumentaron un 14,67 % y un 30,00 %, y el nivel de MDA disminuyó un 29,88 % en el tratamiento con AAE + LF en comparación con el tratamiento con AAE (Fig. 4). Los resultados sugieren que el tratamiento con AAE + LF aumentó significativamente la capacidad antioxidante al aumentar la actividad de las enzimas antioxidantes y disminuir la producción de MDA en la retina de rata dañada.

Capacidad antioxidante de las retinas de rata. (A–C) Actividades SOD, CAT y GPx, respectivamente; (D) Contenido de MDA. Los datos que se muestran son la media ± desviaciones estándar (n = 8). *p < 0,05, **p < 0,01 (ANOVA unidireccional seguido de la prueba de Tukey). SOD superóxido dismutasa, CAT catalasa, GPx glutatión peroxidasa, MDA malondialdehído.

Estudios previos indicaron que el tratamiento con extracto de aronia condujo a una regulación al alza de las proteínas cristalinas en condiciones de estrés13. En este estudio, 14 proteínas cristalinas, incluida la cadena A de α-cristalina (αA), la cadena B de α-cristalina (αB), la β-cristalina A3 (βA3), la β-cristalina A4 (βA4), la β-cristalina B1 (βB1) , β-cristalina B2 (βB2), β-cristalina B3 (βB3) y γ-cristalina AE (γA-E), γ-cristalina S (γS) y γ-cristalina N (γN) se encontraron en retinas de rata por espectrometría de masas . Como se muestra en la Fig. 5A, los porcentajes relativos de las 14 proteínas mencionadas anteriormente en las proteínas cristalinas totales de las retinas de rata de control fueron 37,00 %, 9,42 %, 7,64 %, 4,29 %, 3,61 %, 22,01 %, 4,25 %, 0,33 %, 2,20%, 1,17%, 1,01%, 0,01%, 6,91% y 0,15%, respectivamente.

Expresión de proteínas cristalinas y caspasa 3 en retina de rata. (A) Porcentaje relativo de expresión de diferentes cristales en la rata de control (la cantidad media de cada proteína expresada en el grupo NOR se fijó en uno o 100%); (B) Expresión de cadena A de α-cristalina (αA), cadena B de α-cristalina (αB), β-cristalina A3 (βA3), β-cristalina A4 (βA4), β-cristalina B1 (βB1), β-cristalina B2 (βB2), β-cristalina B3 (βB3) y γ-cristalina S (γS) en diferentes tratamientos, determinados por espectrometría de masas; (C) Inmunotransferencia de αA y γS en muestras de retina. Histona H2B detectada como referencia interna para mostrar una expresión de proteína básica en cada muestra; (D) Expresión de caspasa 3 en diferentes tratamientos. Los datos que se muestran son la media ± desviaciones estándar (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01 (ANOVA unidireccional seguido de la prueba de Tukey).

Las expresiones de los 8 cristalinos principales, incluidos αA, αB, βA3, βA4, βB1, βB2, βB3 y γS, se compararon adicionalmente entre diferentes tratamientos de ratas. La expresión de las 8 proteínas había aumentado ligeramente entre un 17 y un 99 % en el modelo en comparación con el control, pero estadísticamente no significativa (p > 0,05). Sin embargo, las expresiones de estas proteínas aumentaron drásticamente en los tratamientos con AAE y AAE + LF. Las expresiones de αA, αB, βA3, βA4, βB1, βB2, βB3 y γS fueron 7,55, 8,72, 10,53, 11,11, 10,75, 8,26, 8,80 y 9,86 veces respectivamente (Fig. 5B) en AAE + LF, sobre los de Modelo. En comparación con los AAE tratados solo con antocianidinas, el tratamiento con AAE + LF aumentó significativamente la expresión de αA, αB, βA4, βB1, βB2 y γS en un 51,69 %, 110,10 %, 74,19 %, 45,34 %, 52,58 %, 68,39 % ( Fig. 5B), y tendieron a aumentar la expresión de βA3 y βB3 en un 26,60% y 22,95% (Fig. 5B), respectivamente. Los resultados indicaron que el tratamiento combinado de AAE + LF condujo a una regulación positiva mucho mayor de las proteínas cristalinas protectoras en condiciones de estrés. También se obtuvo un resultado similar en el análisis de inmunotransferencia (Fig. 5C). Tanto αA como γS no se detectaron en las retinas de las ratas de control y se expresaron de forma baja en el modelo. Sus expresiones obviamente aumentaron en la AAE, y más altas en la AAE + LF que en el tratamiento con AAE (ver el archivo complementario).

Además de los cambios de las proteínas cristalinas, la expresión de caspasa 3, una proteína que regula la apoptosis, aumentó significativamente en el Modelo en comparación con el Control (Fig. 5D). La elevación se suprimió ligeramente en el tratamiento con AAE, pero se inhibió significativamente con el tratamiento de AAE + LF. La expresión de caspasa 3 en el grupo AAE + LF se redujo en un 51,38 % en comparación con el Modelo y en un 44,34 % en comparación con el AAE (Fig. 5D). Las observaciones sugieren una apoptosis regulada a la baja en retinas de rata con el tratamiento combinado AAE + LF.

Se descubrió que la DMAE seca inducida por NaIO3 presenta un cambio en la composición de la microbiota intestinal. En comparación con el control, la riqueza y diversidad microbiana intestinal tendió a aumentar en el modelo dañado por NaIO3, incluido el índice Chao1 aumentó en un 7,22 % y el índice de Simpson aumentó en un 8 %. El tratamiento con AAE o AAE + LF reconstruyó la comunidad microbiana intestinal, con índices de Chao1 y Simpson más bajos en comparación con el Modelo e índices más altos que el Control (Fig. 6A–C). PCoA y PLSDA revelaron diferencias en la estructura de la comunidad microbiana con grupos separados entre el control y el modelo, mientras que la estructura en los tratamientos de control, AAE y AAE + LF tendía a ser similar (Fig. 6D, E). Sin embargo, ningún índice exhibió significación estadística.

Patrones de estructura de la microbiota intestinal a nivel de género en las heces de rata de diferentes tratamientos. (A) Curva de abundancia de rango de géneros microbianos totales en heces de ratas. El número de unidades taxonómicas operativas (OTU) actúa en función del número de etiquetas de secuencia muestreadas; (B, C) Diagramas de caja que muestran la diversidad α, incluido el índice de Chao y Simpson en diferentes tratamientos; (D, E) diagrama que muestra la diversidad β, incluidos los resultados del análisis de componentes principales (PCoA) basado en las distancias Unifrac ponderadas de la microbiota intestinal y el análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLSDA) a nivel de género.

Se compararon aún más las abundancias relativas de los taxones a nivel de género (Fig. 7A). Bacteroides, que representó alrededor del 40 % del total de taxones, representó la mayor abundancia, y Lactobacillus, Alistipes, Parabacteroides, Akkermansia, Escherichia y Parasutterella fueron los principales taxones (más del 3 % de la abundancia media) en los 4 grupos. No hubo diferencias significativas en las abundancias relativas de los principales taxones entre los diferentes grupos (Fig. 7A).

Alteración de la microbiota intestinal tras diferentes tratamientos. (A) Abundancia relativa de los géneros bacterianos; (B) Se calculó el tamaño del efecto (LEfSe) del análisis discriminante lineal (LDA) para explorar los taxones a nivel de género que discriminan más fuertemente entre los diferentes grupos.

Se aplicó el enfoque de análisis de metagenoma LEfSe para identificar los filotipos clave responsables de la diferencia en cada nivel entre los 4 grupos. Miembros de las especies Bacteroides vulgatus y L. reuteri en Control; el orden Campylobacterales, clase Epsilonproteobacteria, familia Helicobacteraceae, el género Helicobacter en Model; las especies B. fragilis y Alistipes timonensis, el orden Burkholderiales, la clase Betaproteobacteria y la familia Sutterellaceae en AAE; la especie Parasutterella excrementihominis y el género Parasutterella en AAE + LF fueron significativamente más prevalentes que en los otros grupos que contribuyeron a la diferencia de la microbiota intestinal después de diferentes tratamientos (Fig. 7B).

Las respuestas ERG pueden proporcionar pistas importantes en relación con el efecto de la intervención sobre el funcionamiento de la retina19. En nuestros resultados, el tratamiento combinado de AAE junto con LF aumentó significativamente las amplitudes de onda a y b de ERG y suprimió el trastorno de las capas celulares y el adelgazamiento de ONL, mostró una mejora significativa en el alivio de los daños en la retina de rata en comparación con las antocianidinas tratadas solo. Los resultados indicaron que la antocianidina combinada con L. fermentum NS9 mostró una mejor protección en las retinas de rata contra daños, tanto en el sistema de conos como de bastones, que la antocianidina de aronia tratada solo, que funcionaba principalmente en el sistema de conos (Figs. 1 y 2).

Los efectos protectores del tratamiento combinado (AAE + LF) en la retina de rata frente al estrés oxidativo inducido por NaIO3 probablemente se debieron al aumento de la capacidad antioxidante y la disminución de la apoptosis en la retina. Las actividades de GPx reguladas al alza y la producción de MDA suprimida se observaron en el grupo tratado con AAE, pero una regulación al alza más amplia en las actividades de las enzimas antioxidantes, incluidas SOD, CAT, GPx, y una supresión más fuerte en el nivel de MDA en el tratamiento combinado AAE + LF (Fig. 4) . Kim et al., también encontraron que el pimentón fermentado con L. plantarum podría mitigar la reducción de los niveles de SOD y glutatión (GSH) mediada por NaIO3 en los tejidos oculares de ratones y aumentar el efecto protector de la degeneración retiniana20.

El estrés oxidativo promueve la formación de Aβ, que es causada por el mal plegamiento y la agregación de proteínas21. Tanto las cristalinas αA como las αB pertenecen a la familia de las proteínas de choque térmico (HSP). Tienen alta afinidad con las proteínas mal plegadas para proteger el EPR, los fotorreceptores y las RGC de daños17,22. En nuestros resultados, las expresiones cristalinas de αA y αB aumentaron 7,55 y 8,72 veces en las retinas de rata tratadas con AAE + LF en comparación con el modelo, y aumentaron en un 51,69 % y un 110,10 % sobre la base del tratamiento con AAE (Fig. 5B) . La alta expresión de αA y αB crystallin en la retina puede prevenir la apoptosis inducida por el estrés oxidativo del RPE y los fotorreceptores, lo que fue respaldado por la regulación negativa de la caspasa 3 (Fig. 5D).

Además de las cristalinas αA y αB, también se ha demostrado que las proteínas cristalinas βA3, βB2 y γS protegen a las RGC de la degeneración secundaria23. Nuestros resultados mostraron que el tratamiento combinado AAE + LF aumentó su expresión en un 26,60 %, 52,58 % y 68,39 % en comparación con el AAE solo (Fig. 5B). Investigaciones anteriores identificaron que las cristalinas αB, βA1/3, βA4, βB2 y γS existían en las drusas, depósitos basales del RPE que pueden estar asociados con AMD24. En este estudio, observamos que las expresiones de αA, αB, βA3, βA4, βB1, βB2, βB3 y γS en los grupos AAE y AAE + LF estaban significativamente reguladas al alza en comparación con el control y el modelo. Aunque los mecanismos detallados siguen sin estar claros, creemos que la regulación positiva significativa de los cristalinos es importante para proteger la retina del daño antioxidante inducido por el estrés, la apoptosis celular y la pérdida de estructura y función de la retina, que luego posponen el desarrollo de AMD seca.

En comparación con el tratamiento con AAE, AAE + LF mostró efectos mejorados significativos en la protección de la retina de rata, lo que sugiere la función de L. fermentum NS9 sobre la base de AAE. Las antocianidinas están ampliamente distribuidas en los tejidos de las plantas donde existen principalmente en forma de glucósidos o agliconas. Se ha informado que L. fermentum es beneficiosa para el metabolismo de los carbohidratos25. En nuestros resultados, se detectó un aumento significativo en la abundancia relativa de Parasutterella y P. excrementihominis, conocida como la cepa sacarolítica, después de tratamientos con AAE + LF. Como miembro central del microbioma, Parasutterella es una gran consumidora de L-cisteína, mientras que la L-cisteína juega un papel importante en la regulación de la glucosa en sangre26. La proporción de Parasutterella aumentó con el consumo de carbohidratos en modelos de roedores27. Se ha informado que P. excrementihominis desempeña un papel importante en el mantenimiento de la inmunidad del huésped28. Algunos probióticos pueden transformar el glucósido en aglicona para promover su absorción. Se encontró una mayor expresión de Parasutterella en ratones ICR alimentados con yogur enriquecido con flavonoides que se desarrolló utilizando Lactiplantibacillus plantarum GY29. En el intestino delgado, las antocianinas se absorben principalmente como agliconas30. La expresión mejorada de Parasutterella en el grupo AAE + LF puede aumentar la biodisponibilidad de las antocianidinas y mejorar la función inmunológica. El aumento de la investigación implicaba que la microbiota intestinal desempeñaba un papel importante en muchas enfermedades degenerativas relacionadas con la edad, como la EA y la DMAE9,31,32. Nuestro estudio presentó que L. fermentum NS9 combinado con extracto de antocianidina podría aliviar los daños retinianos inducidos por NaIO3, probablemente a través de la mejora de la expresión de cristalinas retinianas, las capacidades antioxidantes y la disbiosis de la microbiota. El tratamiento combinado fue significativamente mejor que el extracto de antocianidina de aronia solo. Complementar tanto con L. fermentum NS9 como con antocianidina podría ser una forma prometedora de prevenir y aliviar la degeneración de la retina.

Los protocolos utilizados en este estudio han sido revisados y aprobados por el Comité de Ética Animal del Instituto de Desarrollo de Plantas Medicinales (No. SLXD-20201218031). Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con la Declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión. Todos los métodos se realizaron de acuerdo con las directrices y normativas pertinentes. Además, todos los estudios en animales se realizaron de acuerdo con las pautas de ARRIVE. Cuarenta ratas macho Sprague-Dawley (SD) de 180-200 g fueron proporcionadas por los Institutos Nacionales para el Control de Alimentos y Medicamentos (Beijing, China, No. SCXK2017-0005). Los animales se mantuvieron a 22 °C y en ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h (7 AM a 7 PM).

La cepa L. fermentum NS9 se inoculó en medio MRS (agar De Man, Rogosa y Sharpe) a 37 °C durante 12 h. Las bacterias se recogieron por centrifugación a 3000 rpm durante 5 min y se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4). La cepa se resuspendió a una concentración de 108 unidades formadoras de colonias (UFC)/ml.

El extracto de antocianidina de aronia era el polvo rojo purpúreo del extracto acuoso de los frutos de Aronia melanocarpa, adquirido de Greater Hinggan Gebei Frigid Zone Biotechnology Co., LTD (Heilongjiang, China). El polvo contiene 10 % de almidón (agregado exógenamente durante la preparación del polvo), 10,3 % de antocianidina y otros nutrientes solubles en agua, incluidos sacáridos, proteínas y fibra dietética de los frutos de Aronia melanocarpa.

Las ratas se separaron aleatoriamente en grupos Control, Modelo, AAE y AAE + LF. En el grupo AAE, se administró por vía oral extracto de antocianidina de aronia a 600 mg/kg de peso corporal (antocianidina a 60 mg/kg de peso corporal) en agua destilada una vez al día durante 28 días. En el grupo AAE + LF, las ratas se trataron con 60 mg/kg de peso corporal de AAE y 108 CFU/ml de L. fermentum NS9 al día durante 28 días. En los grupos Control y Modelo, a las ratas se les administró por vía oral agua destilada. El modelo murino de inyección de NaIO3 es un modelo AMD ampliamente utilizado16,17,18 y habíamos confirmado que 30 mg/kg de peso corporal era una dosis adecuada en nuestro experimento preliminar. Se inyectó por vía intravenosa un único tratamiento de NaIO3 a 30 mg/kg de peso corporal en los grupos Modelo, AAE y AAE + LF en el octavo día.

El ERG de campo completo de ratas se registró utilizando un sistema de registro ERG (D430 Diagnosis, EE. UU.) como se informó anteriormente13,33. Antes de la medición de ERG, las ratas se adaptaron a la oscuridad durante 12 h. Veinte minutos antes del registro, los animales fueron anestesiados mediante inyección intramuscular con la mezcla de clorhidrato de ketamina y clorhidrato de xilazina a las dosis de 100 mg/kg y 15 mg/kg, respectivamente. Se administraron gotas para los ojos que contenían tropicamida al 0,5% y clorhidrato de fenilefrina al 0,5% en los ojos de ratas para dilatar las pupilas. Se registraron y analizaron estadísticamente las amplitudes de las ondas a y b.

Se extirparon ambos ojos después de sacrificar a las ratas mediante inyección intramuscular de clorhidrato de ketamina asociado con clorhidrato de xilazina. La retina se fijó y se tiñó con H&E como se informó previamente34,35. Para cada sección, se tomaron imágenes digitalizadas de toda la retina con una cámara digital (Leica DMi8, Wetzlar, Alemania) con un aumento de 200 ×. El grosor de la capa nuclear externa (ONL) se midió con el software Image J (Institutos Nacionales de Salud de EE. UU., Bethesda, EE. UU.). Se midieron doce ubicaciones para cada sección de la retina, comenzando desde cualquier lado del nervio óptico, con cada segmento con una separación de 0,5 mm. Las 12 mediciones se promediaron como el grosor ONL medio.

Las muestras de retina extraídas de los globos oculares de ratas se homogeneizaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) y se centrifugaron a 3500 rpm durante 10 min, y se recogió el sobrenadante. Las actividades de SOD, CAT, GPx y el contenido de MDA en el sobrenadante de cada muestra se determinaron espectrofotométricamente utilizando el kit de medición (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China).

Las proteínas de retina de rata se identificaron y analizaron mediante MS en tándem siguiendo el protocolo anterior13. Los tejidos de la retina se lisaron mediante sonicación en tampón de urea 8 M. Después de digerir con tripsina, los péptidos se analizaron en un espectrómetro de masas Orbitrap Q Ex-active HF acoplado con un sistema de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) EASY-nLC 1200 en línea (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.). Los resultados de la espectrometría de masas se analizaron y cuantificaron utilizando PEAKS Studio (Waterloo, Canadá).

El análisis de inmunotransferencia se realizó como se informó anteriormente13,36. La membrana con las proteínas de la retina se lavó con leche desnatada al 5 % en solución salina tamponada con Tween/Tris (TBST) para bloquear la unión no específica y luego se incubó con anticuerpos primarios contra la cadena α-cristalina A y la γ-cristalina S. Las inmunotransferencias se realizaron utilizando SuperSignal Western Pick Plus (n.º 34577, Thermo Scientific) . Las transferencias se cortaron antes de la hibridación con anticuerpos durante la transferencia.

Las muestras fecales de ratas se obtuvieron al final de los tratamientos de ratas en la sección "Efecto de los tratamientos sobre la expresión de proteínas cristalinas y caspasa 3 en retina de rata" y se almacenaron inmediatamente a -80 °C hasta su análisis. La extracción de ADN microbiano y el análisis del metagenoma fueron realizados por Microeco Tech Co., Ltd. (Guangdong, China) como se informó anteriormente37.

Para el análisis bioinformático de secuencias de microbiomas, se empleó Kraken2 (v2.0.7) para asignar lecturas a la taxonomía y Bracken (v2.5.0) para estimar con precisión la abundancia taxonómica. Se aplicó el análisis LEfSe para identificar taxones bacterianos diferencialmente abundantes entre los grupos. En última instancia, solo se consideraron aquellos taxones que obtuvieron una puntuación de análisis discriminante lineal logarítmico (LDA) > 4. Para determinar la tasa de descubrimiento falso (FDR), se utilizó el método de corrección de prueba múltiple, Benjamini-Hochberg.

Los resultados se presentan como la media ± desviación estándar. Las diferencias entre los grupos se evaluaron mediante ANOVA unidireccional, seguido de la prueba de Tukey. p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando Prism 8.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.).

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Agradecemos a la Prof. Lina Liang del Hospital Oftalmológico de la Academia China de Ciencias Médicas Chinas por el apoyo técnico y el debate. Este trabajo cuenta con el apoyo del Programa Nacional Clave de I+D de China (No. 2021YFA1302601).

Estos autores contribuyeron por igual: Yan Xing y Shan Liang.

Estos autores supervisaron conjuntamente este trabajo: Chenxi Jia y Feng Jin.

Laboratorio clave provincial de Guangdong de biotecnología para el desarrollo de plantas, Escuela de Ciencias de la Vida, Universidad Normal del Sur de China, Guangzhou, 510631, China

Yan Xing, He Ni, Liu Yang y Hai-Hang Li

Laboratorio de Investigación de Antioxidación y Antienvejecimiento, Guozhen Health Technology (Beijing) Co., Ltd., Beijing, 102206, China

Yan Xing, Limei Zhang, Xueqin Zhang, Jiancheng Wang y Shuangshuang Song

Laboratorio clave de ingeniería fisiológica y metabólica microbiana, Instituto de Microbiología, Academia de Ciencias de China, Beijing, 100101, China

shan liang

Laboratorio Estatal Clave de Proteómica, Centro de Investigación de Proteoma de Beijing, Instituto de Lifeomics, Centro Nacional de Ciencias de Proteínas (Centro PHOENIX), Beijing, 102206, China

chenxi jia

Laboratorio Clave de Salud Mental, Instituto de Psicología, Academia China de Ciencias, Beijing, 100101, China

feng jin

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YX, HL y FJ diseñaron el experimento; YX, LZ, XZ, JW y SS realizaron los experimentos; SL, HN, LY y CJ contribuyeron con reactivos/materiales/herramientas de análisis; SL y CJ analizaron los datos; YX preparó el borrador original; SL, HL, CJ y FJ revisaron el documento. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito.

Correspondencia con Hai-Hang Li, Chenxi Jia o Feng Jin.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Xing, Y., Liang, S., Zhang, L. et al. La combinación de Lactobacillus fermentum NS9 y extracto de antocianidina de aronia alivia la degeneración de la retina inducida por yodato de sodio. Informe científico 13, 8380 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34219-3

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Recibido: 02 noviembre 2022

Aceptado: 26 abril 2023

Publicado: 24 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34219-3

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